Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật elisa và bƣớc đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật pcr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. NGUYỄN ANH KHOA PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Tp. HCM, 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNHCẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Tp. HCM, 8/2006 Sinh viên thực hiện NGUYỄN ANH KHOA Niên khóa: 2002 - 2006 Giáo viên hƣớng dẫn PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY SURVEYING SUGARCANE MOSAIC DISEASE BY ELISA AND THE FIRST STEP TO RESEARCH AND DETECT RATOON STUNTING DISEASE BY PCR Graduation thesis Major: Biotechnology HCMC, 9/2006 Professor BUI CACH TUYEN Student NGUYEN ANH KHOA Term: 2002- 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2002 – 2006 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ANH KHOA Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 / 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 / 2006 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ANH KHOA Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN iii LỜI CẢM ƠN  Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:  PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn tất khóa luận tốt nghiệp này.  TS. Bùi Minh Trí đã chỉ bảo cho tôi nhiều kiến thức trong thời gian thực hiện đề tài.  ThS. Nguyễn Văn Cƣờng cùng các anh chị trong Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh – trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.  ThS. Hà Đình Tuấn, Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng Bến Cát đã giúp đỡ tôi trong quá trình thu mẫu tại đây.  Xin chân thành cảm ơn đến quí Thầy Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã nhiệt tình chỉ dạy cũng nhƣ đóng góp ý kiến chân thành cho tôi trong suốt thời gian làm khóa luận này.  Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã luôn ủng hộ, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Sinh viên thực hiện Nguyễn Anh Khoa iv TÓM TẮT NGUYỄN ANH KHOA, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8 năm 2006. “PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KĨ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KĨ THUẬT PCR” Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. Bùi Cách Tuyến. Đề tài khảo sát sự nhiễm bệnh khảm lá mía (Sugarcane Mosaic) và cằn mía gốc (Ratoon stunting disease) đƣợc thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng (TTNCMĐ) tỉnh Bình Dƣơng và nông trƣờng Thọ Vực tỉnh Đồng Nai. Đây là nghiên cứu nhằm góp phần thống kê tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía và cằn mía gốc trên một số giống mía sản xuất và nhập nội tại 2 vùng trồng mía này. Đặc biệt đề tài là bƣớc đi đầu tiên trong nghiên cứu, phát hiện bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây ra trên cây mía ở nƣớc ta bằng kỹ thuật PCR. Nghiên cứu góp phần quan trọng trong công tác tuyển chọn giống sạch bệnh cũng nhƣ công tác phòng chống và kiểm soát dịch bệnh trên cây có mía hiệu quả hơn. Kết quả đạt đƣợc - Các giống mía sản xuất và nhập nội đƣợc khảo sát đều không bị nhiễm bệnh khảm lá mía thông qua kết quả chẩn đoán bằng ELISA. - Phát hiện đƣợc bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và nhuộm mô mẫu. Kết quả: tỉ lệ mô khoẻ mạnh trên các giống mía khảo sát tại TTNCMĐ là 70,5%, tại nông trƣờng Thọ vực là 75,18%. - Xác định sơ bộ các nhân tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx. - Đề xuất phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn Lxx và hoàn thiện quy trình phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kỹ thuật PCR. v SUMMARY This is Nguyen Anh Khoa studying at Nong Lam University and finishing the thesis on 9 th 2006. The thesis entiled “Surveying sugarcane mosaic disease by ELISA and the first step to research and detect ratoon stunting disease by PCR ”. Surveying sugarcane mosaic disease and ratoon stunting disease (RSD) on some sugarcane species produced and imported at sugarcane researching center at Binh Duong and at Tho Vuc farm at Dong Nai. That is basic to contribute statistics to situation of sugarcane mosaic disease at the areas. Specially, the thesis is the first step to research and detect RSD caused by bacteria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) on sugarcane in our country. The researching is an important contribution to select pathogenic free species, to prevent and to control epidemic diseases on sugarcane effectively. The results of this research are as follows: - DAS-ELISA result data show that all investigatived sugarcane species produced and imported at sugarcane researching center at Binh Duong, is not found SCMV. - Detecting Lxx by microscopy and STM stainning. Results: 70,5% of phloem vessel do not infected by Lxx on sugarcane species at Binh Duong provine and 75,18% phloem of vessel do not infected by Lxx on sugarcane at Tho Vuc farm. - Preliminary defining factors effecting the Lxx bacteria culturing process. - Proposing the method to culture Lxx bacteria and to perfect Lxx bacteria detecting process by PCR. vi MỤC LỤC Nội dung Trang LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ iii TÓM TẮT .......................................................................................................................iv MỤC LỤC ......................................................................................................................vi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ........................................................................ix DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ HÌNH CHỤP ................................................................ x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...........................................................................xi Phần 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu ...................................................... 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................... 2 1.3. Giới hạn đề tài ................................................................................................... 2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3 2.1. Sơ lƣợc về cây mía ............................................................................................ 3 2.1.1. Lịch sử phát hiện ....................................................................................... 3 2.1.2. Phân loại .................................................................................................... 3 2.1.3. Nguồn gốc và phân bố ............................................................................... 3 2.1.4. Nhân giống ................................................................................................ 4 2.1.5. Sản lƣợng ................................................................................................... 4 2.1.6. Chế biến và sử dụng .................................................................................. 5 2.2. Bệnh trên cây mía ............................................................................................. 5 2.3. Bệnh khảm lá mía ............................................................................................. 7 2.3.1. Nguồn gốc và phân bố ............................................................................... 7 2.3.2. Triệu chứng................................................................................................ 7 2.3.3. Tác nhân gây bệnh ..................................................................................... 8 2.3.4. Các chủng virus gây bệnh khảm lá mía..................................................... 9 2.3.5. Qui luật phát sinh phát triển bệnh ............................................................. 9 2.3.6. Tầm quan trọng kinh tế ............................................................................. 9 2.3.7. Phòng trừ ................................................................................................. 10 2.3.8. Các phƣơng pháp xác định bệnh khảm lá mía ........................................ 10 vii 2.3.8.1. Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh ...................................................... 10 2.3.8.2. Phƣơng pháp chẩn đoán dùng kính hiển vi ...................................... 10 2.3.8.3. Phƣơng pháp ELISA (Enzym-link immunosorbent assay) .............. 10 2.3.8.4. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ........................... 12 2.4. Bệnh cằn mía gốc ............................................................................................ 14 2.4.1. Nguồn gốc và phân bố ............................................................................. 14 2.4.2. Triệu chứng.............................................................................................. 14 2.4.2.1. Triệu chứng bên ngoài ..................................................................... 14 2.4.2.2. Triệu chứng bên trong cây ............................................................... 15 2.4.3. Tác nhân gây bệnh ................................................................................... 16 2.4.4. Quy luật phát sinh phát triển bệnh .......................................................... 16 2.4.5. Tầm quan trọng kinh tế ........................................................................... 17 2.4.6. Kiểm soát bệnh ........................................................................................ 17 2.4.7. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên cây mía ................. 17 2.4.7.1. Phƣơng pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi ....................... 17 2.4.7.2. Phƣơng pháp huyết thanh học .......................................................... 17 2.4.7.3. Phƣơng pháp nhuộm STM (dựa vào đáp ứng của kí chủ) ............... 19 2.4.7.4. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử ........... 19 2.5. Tình hình nghiên cứu về bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc ................. 19 2.5.1. Trên thế giới ............................................................................................ 19 2.5.2. Trong nƣớc .............................................................................................. 20 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 22 3.1. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 22 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................. 22 3.3. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 22 3.3.1. Các giống mía nghiên cứu ....................................................................... 22 3.3.2. Virus gây bệnh......................................................................................... 22 3.3.3. Vi khuẩn gây bệnh ................................................................................... 22 3.3.4. Hóa chất thí nghiệm ................................................................................ 23 3.3.5. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................. 23 3.4. Phƣơng pháp tiến hành ................................................................................... 23 3.4.1. Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu ................................................................. 23 viii 3.4.2. Phƣơng pháp phát hiện SCMV bằng kỹ thuật ELISA ............................ 24 3.4.3.1. Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu và bố trí thí nghiệm ............................. 24 3.4.3.2. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA .......................... 26 3.4.3. Phƣơng pháp nhận dạng bệnh cằn mía gốc trên đồng ruộng .................. 27 3.4.4. Phƣơng pháp phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kính hiển vi và bằng phƣơng pháp nhuộm STM .................................................................................... 27 3.4.5. Phƣơng pháp nuôi cấy và nhận dạng khuẩn lạc vi khuẩn Lxx ................ 28 3.4.6. Phƣơng pháp PCR phát hiện vi khuẩn Lxx .............................................. 29 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 31 4.1. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA ......................................... 31 4.2. Nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR ......................... 32 4.2.1. Điều tra sự nhiễm bệnh cằn mía gốc dựa vào triệu chứng. Phát hiện vi khuẩn Lxx bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp nhuộm STM. ............................................................................................ 32 4.2.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx và nhận dạng khuẩn lạc của nó trên môi trƣờng nuôi cấy ....................... 36 4.2.3. PCR phát hiện vi khuẩn Lxx .................................................................... 37 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................... 41 5.1. Kết luận .......................................................................................................... 41 5.2. Đề nghị ............................................................................................................ 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 43 PHỤ LỤC ................................................................................................................... xii ix DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ BẢNG TRANG Bảng 1.1. Thống kê về nhóm tác nhân gây bệnh và số lƣợng bệnh. ........................ 6 Bảng 3.1. Thành phần các chất trong phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt ..................... 30 Bảng 4.1. Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi ........................................................................ 34 Bảng 4.2. Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên các giống sản xuất tại TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực bằng phƣơng pháp nhuộm STM. .. 35 Bảng 4.3. So sánh kết quả chẩn đoán của hai phƣơng pháp: dùng kính hiển vi và nhuộm STM. .......................................................... 36 Sơ đồ 2.1. Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp ..................................... 11 Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT - PCR ................................................. 13 Sơ đồ 3.1. Sơ đồ điều tra .......................................................................................... 24 Sơ đồ 3.2. Sơ đồ tách chiết mẫu lá cho ELISA ........................................................ 25 Sơ đồ 3.3. Sơ đồ bố trí giếng trên đĩa ELISA .......................................................... 25 x DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Cây mía ..................................................................................................... 3 Hình 2.2. Bệnh hại phổ biến trên cây mía ............................................................... 6 Hình 2.3. Triệu chứng bệnh khảm lá mía ................................................................ 7 Hình 2.4. Sugarcane mosaic virus ............................................................................ 8 Hình 2.5. Cơ chế phản ứng đổi màu trong DAS- ELISA ......................................... 12 Hình 2.6. Lxx gây những vết chuyển màu ở thân mía. ............................................. 15 Hình 2.7. Vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli dƣới kính hiển vi điện tử (x30.000 lần) (K. E. Damann, 2002). ..................................................... 16 Hình 4.1. Kết quả chẩn đoán SCMV qua quan sát sự đổi màu trên đĩa ELISA. ..... 32 Hình 4.2. Vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi (độ phóng đại 1000 lần) ........................ 34 Hình 4.3. Mẫu thân nhuộm safranin dƣới kính hiển vi (x 40 lần (A) và x 100 lần (B)). ............................................................... 35 Hình 4.4. Khuẩn lạc nhỏ tƣơng tự nhƣ khuẩn lạc Lxx trên môi trƣờng sau 2 ngày nuôi cấy (A); và khuẩn lạc của nó sau khi phân lập (B). ...... 36 Hình PL1. Nhận dạng triệu chứng và thu mẫu. ........................................................ xvi Hình PL2. Lá mía có triệu chứng khảm. .................................................................. xvi Hình PL3. Kết quả âm tính trong phân tích ELISA. ................................................ xvi Hình PL4. Bệnh đốm vòng thƣờng xuất hiện trên các cây khảo sát. ....................... xvi Hình PL5. Quá trình điều tra và thu mẫu. ................................................................ xvi Hình PL6. Gốc mía bị cằn. ....................................................................................... xvi Hình PL7. Đốt thân mía bị nhiễm Lxx nên ngắn lại. ................................................ xvii Hình PL8. Thân mía bị bệnh có đƣờng kính nhỏ hơn thân bình thƣờng. ................ xvii Hình PL9,10. Vết đổi màu bên trong thân. ....................................................................... xvii xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ELISA: enzym linked immunosorbent assay. DAS-ELISA: double antibody sandwich-enzyme linked immunosorbent assay. TTNCMĐ: Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng. RT-PCR: Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction. cDNA: Complementary Deoxyribonucleotide acid. ctv: Cộng tác viên. NCM: Màng nitrocellulose ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate. DEPC: Diethyl pyrocarbonate. dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate. p-NPP: p - nitrophenol phosphate. PVP: Polyvinylpyrrolidone. BSA: Bovine serum albumin. PBS: Dung dịch chứa PVP, BSA, Tween–20 và sodium azide. RNA: Ribonucleic acid. bp: Base pair. EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid. mRNA: Messenger RNA. PCR: Polymerase chain reaction. RNase: Ribonuclease. SCMV: Sugarcane Mosaic Virus. RSD: Ratoon stunting disease. Lxx: Leifsonia xyli subsp. xyli. STM: Stainning transpiration. TTPT: Trung tâm phân tích. Taq: Thermus aquaticus. 1 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu Hiện nay cây mía (Saccharum spp.) đang là một trong những loại cây công nghiệp cho hiệu quả kinh tế cao ở nƣớc ta cũng nhƣ nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Cuba, Ấn Độ, Australia,.v.v. vì vậy diện tích trồng mía cũng nhƣ sự ra đời của nhiều giống mới không ngừng gia tăng trong những năm gần đây. Tuy nhiên mía là cây trồng một lần nhƣng lại có khả năng cho thu hoạch nhiều vụ, nên đây cũng là một trong những điều kiện thuận lợi cho nhiều loại sâu bệnh gây hại tồn tại và phát triển (Nguyễn Huy Ƣớc, 1994). Hơn nữa khi cơ cấu giống mía phong phú hơn, thời tiết khí hậu có nhiều biến đổi cũng góp phần làm cho dịch bệnh đa dạng hơn. Các bệnh quan trọng ảnh hƣởng đến năng suất mía hiện nay có rất nhiều, trong đó phải kể đến bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc. Bệnh khảm lá m