Phát hiện và định lượng virus aujeszky trên heo bằng kỹ thuật nested PRC và real - Time PRC

1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Bài tiểu luận PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG VIRUS AUJESZKY TRÊN HEO BẰNG KỸ THUẬT NESTED PCR VÀ REAL-TIME PCR. Giáo viên hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Phương Thảo Mã số sinh viên: 06126139 Lớp: DH06SH 2 A. Đặt vấn đề Trong quá trình phát triển của ngành chăn nuôi heo thì giới chăn nuôi cũng phải đối mặt với không ít khó khăn, đặc biệt là những bệnh ảnh hưởng trực tiếp đến thành tích sinh sản và tăng trưởng của heo như: bệnh dịch tả heo, bệnh đóng dấu son, bệnh tai xanh và một trong số đó có bệnh giả dại (Aujeszky). Ở heo, bệnh lan tràn dưới dạng nhiễm trùng tiềm ẩn, gây tử vong cho heo con bằng chứng viêm não cấp. Virus pseudorabies (PrV) thiết lập sự lây nhiễm suốt đời (mãn tính) trong nhiều mô thần kinh của vật chủ tự nhiên, và sự lây nhiễm này có thể được phục hồi hoạt động dưới những kích thích căng thẳng (stress) tự nhiên hay thí nghiệm ( Rock,1993; Azmietal và ctv, 2002). Kỹ thuật ELISA phân biệt kháng glucoprotein cũng được phát triển cho phép kiểm soát sự lan truyền của PrV, cũng như tiêu diệt chúng bằng việc kiểm soát và tiêu diệt heo bị nhiễm virus (Kit và ctv, 1990; Lehmann và ctv, 2002; Pensaert và ctv, 2004). Tuy nhiên, heo với sự lây nhiễm tiềm ẩn, được coi như là được miễn với PrV, có thể dễ dàng bị bỏ sót trong trường hợp ELISA phân biệt sai để tìm ra những đáp ứng kháng thể với virus. Hơn nữa, điều này cũng nêu lên rằng một vài con heo có thể lây nhiễm tiềm ẩn với PrV biến thể trong huyết thanh âm tính (Jacobs và và ctv, 1996; McCaw và ctv, 1997). Những kỹ thuật khác nhau đã được phát triển để phát hiện và định lượng sự nhiễm PrV tiềm ẩn (Schang and Osorio, 1994; Denis và ctv., 1997). Kỹ thuật này, dựa vào sự cấy chuyển và tiêm truyền (explantation and cocultivation) của mô đã nhiễm bệnh, cả hai phương pháp này đều tốn nhiều thời gian và độ nhạy không cao, trong khi sử dụng kỹ thuật phân tử đã giúp ích được với việc nâng cao cả độ nhạy và độ chính xác (McFarlane và ctv., 1986; Lokensgard và ctv., 1991). Đặc biệt, kỹ thuật PCR đã dự đoán trước một sự gia tăng đáng kể trong khả năng xác định sự tồn tại và định lượng được virus mà điều này gặp trở ngại trong nuôi cấy mô. Việc sử dụng kỹ thuật này, cũng như kết quả này, tiếp tục gia tăng (Krumbholz và ctv., 2003; Mumford và ctv., 2004; Ozoemena và ctv., 2004). Trong bài báo cáo đã sử dụng cả kỹ thuật nested PCR và real-time PCR đã xác định tần số thực tế và số lượng của sự lây nhiễm PrV trong những mô thần kinh của nhiều heo được chọn ngẫu nhiên. Từ đó, có thể áp dụng 2 kỹ thuật này trong việc phát hiện virus PrV tiềm ẩn trong heo ở Việt Nam. 3 B. Tổng quan I. Bệnh Aujeszky 1.1. Khái niệm Bệnh Aujeszky là bệnh truyền nhiễm do virus gây nên ở heo, loài gặm nhấm và nhiều loài động vật khác. Bệnh Aujeszky còn có những tên gọi khác như: pseudorage, aujeszky’s disease, pseudorabie, mad itch. Ở heo, bệnh lan tràn dưới dạng nhiễm trùng tiềm ẩn, gây tử vong cho heo con bằng chứng viêm não cấp. Ở những loài vật khác, người thấy triệu chứng viêm não – màng não tiến triển mau lẹ đưa tới tử vong kèm theo chứng ngứa không gì cản trở nổi. Không thấy bệnh lây trên người. Hình 2. Diagram showing the virion structure, its different proteins (with the new nomenclature) and the DNA of the AD virus. (nguồn: www.sanidadanimal.info/.../images/9virus.gif ) 1.1.1. Lịch sử và phân bố địa lí Năm 1902, Aladar Aujeszky, giáo sư vi trùng học trường Thú y Budapest đã phân lập một căn bệnh bằng việc nuôi cấy trên thỏ, bệnh phẩm từ thần kinh chó và bê sau khi xuất hiện triệu chứng thần kinh tương tự như bệnh dại nhưng ở thời gian nung bệnh ngắn khoảng 3 ngày, dẫn đến chết trong 24–48 giờ với biểu hiện ngứa dữ dội ở điểm tiêm truyền. Ông cho đó là bệnh mới khác với bệnh dại. Về sau bệnh được ghi nhận ở nhiều loài thú. Nhưng trong thời gian khá dài người ta không biết heo (ổ chứa và nguồn lây nhiễm cho các loài vật khác) trong hầu hết các quốc gia bị nhiễm. Ngay như ở Pháp, 4 từ năm 1912 bệnh đã được nghi ngờ trên bò và chó, rồi được giám định chắc chắn vào năm 1934 trên bò cái tơ và mãi đến 1966 việc cảm nhiễm trên heo mới được xác lập. Bệnh xuất hiện ở nhiều quốc gia Châu Âu, ở Bắc và Nam Mỹ. Bệnh chưa được biết rõ ở Châu Phi và Châu Á. Nhưng vài năm gần đây đã gây thiệt hại ở nhiều quốc gia như Singapore, Đài Loan… Vài quốc gia như: Áo, Úc, Nhật chưa thấy xuất hiện bệnh. 1.1.2. Căn bệnh Aujeszky là một DNA virus, thuộc họ Herpesviridase Suid Herpesvirus I (SHV I), kích thước 180 nm, 162 capsomeres, có vỏ bọc. Virus đề kháng trung bình với các tác nhân vật lí và hóa học. Một số chất vô hoạt virus như Formol, beta – probiolactone Glutaraldehyde, ethyl ethylene imine( áp dụng cho chế vaccine vô hoạt), nước javel, NH4 (áp dụng vào việc sát trùng), virus tồn tại lâu ở 4 oC đến – 20 oC. Bệnh tích tế bào đặc trưng là xuất hiện những thể vùi trong nhân ưa acid và hợp bào (syncytia). Áp dụng trong thực hành phương pháp này là sản xuất nhiều virus (cho việc chế tạo vaccine) biến đổi độc lực, phân lập những chủng virus (chẩn đoán virus) định hiệu giá và tìm kiếm kháng thể. Trong tự nhiên, virus có tính gây bệnh mạnh, có thể giết chết một số loài thú theo một số hướng . Virus hướng thần kinh (neurotropisme) liên quan đến những biểu hiện lâm sàng và phân bố virus trong cơ thể. Virus hướng sinh dục liên quan đến việc gây sảy thai. Virus hướng phổi gây xáo trộn hô hấp (hầu hết cho heo cai sữa). Đặc điểm kháng nguyên: vỏ bọc chứa 5 loại glycoprotein gI, gII, gIII, gIV (hay gp 50), gX (hay gp 63). Capside chứa protein, thymidine Kinase. Nguồn chứa virus: Heo bệnh bài virus qua chất tiết, dịch từ mũi, miệng, sinh dục và tinh trùng. Ở thời kì cao điểm, một heo cai sữa có thể thải 105,3. Virus còn hiện diện lớn trong tử thi heo. Heo khỏi bệnh thì trở thành vật chứa virus cho đến chết. Chúng có thể bài virus, có thể chết đột ngột dưới ảnh hưởng của vài yếu tố (tiêm vaccine, thay đổi chỗ nuôi, tình trạng sinh lí – chửa đẻ…). Heo khỏe mang trùng lại thường gặp trên heo trưởng thành, nhiễm trùng ngay cả heo vừa khỏi bệnh, chính chúng cũng là ổ chứa giả dại. Heo đã tiêm vaccine sau khi tiếp xúc với virus Aujeszky gây bệnh trong tự nhiên (virus hoang dã) có thể trở thành 5 vật khỏe mang trùng. Việc tiêm chủng được dùng bởi lẽ giới hạn cường độ và thời gian bài virus hoang dã đã xâm nhiễm. Chất chứa căn bệnh Heo bệnh: các chất tiết (mũi, miệng, cơ quan sinh dục) và tử thi rất nhiều virus. Heo khỏi bệnh mang trùng: có thể thấy virus trong nước mũi ở 6 tháng sau. Heo khỏe mang trùng:(có thể nhiễm trung thầm lặng) có thể gặp nhiều trên heo sinh sản hay heo đã tiêm vaccine rồi cảm nhiễm virus hoang dại. Các sản phẩm động vật: thịt và cơ quan (gan, thận, phổi) thì heo bệnh là nguồn lây nhiễm nguy hiểm cho loài ăn thịt. Virus còn tìm thấy trong tinh trùng, huyết thanh heo ( tinh trạng huyết nhiễm siêu vi). Từ môi trường bên ngoài: virus có thể tồn tại trong thức ăn, nước uống, phương tiện vận chuyển trong 30 – 40 ngày. Virus cũng có thể được gió mang đi từ vài trăm mét tới khoảng hai km.. Đường xâm nhập: Ở trên heo, virus có thể xâm nhập qua đường miệng (qua sữa, qua thức ăn), đường mũi, đường sinh dục, qua da bị xây sát. Ở trên thú ăn thịt và cho lông (cao, chồn…) đường xâm nhập chủ yếu là đường tiêu hóa. Trên bò, người ta chưa biết thật rõ, có thể là qua da. Các stress mở đường cho sự xâm nhiễm và bài thải virus. Cách sinh bệnh: Sau khi theo đường mũi – miệng (oro – nasal) virus sẽ nhân lên tại chỗ, đặc biệt nhất là ở hạch amygdale và lan tỏa hướng trung tâm thần kinh đồng thời tấn công thần kinh trung ương. Mặt khác qua đường máu, trong tình trạng viremia, virus tấn công nhiều cơ quan nhất là phổi (gây xáo trộn hô hấp), cơ quan sinh sản (gây xáo trộn sinh sản). Trong sự cảm nhiễm chậm, những heo khỏi bệnh, virus có thể hiện diện thời gian khá dài ở vài mô (có thể phân lập virus 5 tháng sau khi khỏi bệnh). Việc cảm nhiễm thời gian phôi thai (thời kì heo nái có mang) có thể dẫn đến sảy thai. Cách lây lan: Ở heo có thể lây theo hai cách: trực tiếp và gián tiếp. Trực tiếp (chủ yếu): heo con bú sữa mẹ mắc bệnh, heo lớn khi nuôi nhốt chung, heo giống khi giao phối và qua bào thai thì tùy thuộc ngày nhiễm virus mà gây sảy thai, thai khô, chết thai, sinh ra còi cọc… Gián tiếp: qua xe chổ thức ăn, qua dụng cụ nhiễm. Ở các loài vật khác: chó, mèo, thú lấy lông thì phần lớn do tiêu thụ ở những bộ phận heo bệnh chứa virus. 6 1.1.3.Triệu chứng Trên heo mức độ trầm trọng của triệu chứng và số heo chết thì tỉ lệ nghịch với tuổi của heo. Triệu chứng ngứa rất hay gặp trên thú khác thì không bao giờ gặp ở heo. Heo dưới 15 ngày tuổi: phát triển lâm sàng rất nhanh, có thể chỉ trong vài giờ đến 12 giờ rồi chết. Tử số có thể lên đến 100%. Con vật bệnh có những biểu hiện thần kinh như: o Run cơ, hoạt động mất phối hợp, đi vòng. o Co giật (convulsion) trong khoảng 45 giây, co rút ưỡn cong người ra sau (opisthotonus). o Đạp bơi bốn chân. o Nghiến răng, chảy nước nhãi. o Trợn mắt (nygtaginus). o Có thể ói mửa, tiêu chảy, nhiệt độ không vượt quá 41 oC. Heo 15 ngày – 3 tháng tuổi: Bắt đầu với biểu hiện ăn không ngon, thân nhiệt tăng 41oC trong 2 -3 ngày. Có một số dấu hiệu thần kinh của viêm màng não, não tủy cấp tính (meningo-encephalo myélite) như: quá nhạy cảm, dễ run cơ, động kinh (epileptiforme) kêu khàn giọng, có thể liệt vùng hầu, chảy nhiều nước dãi (ptyalisme). Con vật sẽ chết sau 4-6 ngày kể từ khi xuất hiện triệu chứng thần kinh. Tỉ lệ tử vong khoảng 20%. Heo nuôi vỗ: bệnh có thể xuất hiện dưới nhiều hình thức khác nhau. Tỉ lệ tử vong rất thấp khoảng 1%. Biểu hiện như: - Xáo trộn về tiêu hóa: sốt, kém ăn, đôi khi xuất hiện triệu chứng thần kinh. - Xáo trộn hô hấp: sốt, kém ăn, ho trong vài ngày, giảm tăng trưởng. - Đôi khi cảm nhiễm thầm lặng mà không thấy xuất hiện triệu chứng nào cả. - Heo sinh sản: hầu như là cảm nhiễm thầm lặng. Đoi khi người ta ghi nhận được là sốt, kém ăn, hay ngáp trong 4-5 ngày.Triệu chứng thần kinh hiếm thấy. Trên nái có mang thấy những xáo trộn sinh sản như: - Sảy thai, 50% trường hợp thường thấy ở tháng đầu hơn là tháng sau. - Đẻ ra những heo chết. Trong ổ có con sống, có con chết. Thai khô hoặc thai ngậm nước. Sau khi mắc bệnh, heo hình thành miễn dịch khác vững chắc và kéo dài gần hai năm với sự hình thành kháng thể trung hòa, kháng thể kết hợp bổ thể... Heo không truyền 7 kháng thể qua nhau thai nhưng truyền kháng thể qua sữa đầu. Heo có thể kháng bệnh trong vòng một tháng sau khi sinh. Sau khi mắc bệnh 2-3 ngày, con vật xuất hiện những triệu chứng ngứa không gì ngăn trở nổi. Để thỏa mãn cơn ngứa, con vật có thể cào cắn tới tận da thịt. Bệnh biến trong 12-48 giờ thì con vật chết. 1.1.4. Chẩn đoán 1.1.4.1. Bệnh phẩm: Heo chết, thai sảy. Nội quan và hạch amygdale. Để chẩn đoán huyết thanh học lấy máu khoảng 10 ngày sau khi phát bệnh ( lấy ít nhất 10 mẫu ) và lấy mẫu theo bảng sau: Bảng 1.cách lấy mẫu chẩn đoán huyết thanh học Tìm virus Tìm kháng thể Thú ăn thịt Đầu hay não Hạch amygdale Thú ăn cỏ Não Tủy sống vùng ngứa ( nếu không định vị vị ở đầu) Heo Não Hạch amugdale Nguyên heo bệnh Thai sảy Lấy ít 10 mẫu 10 ngày sau khi phát triển bệnh. 2 lần ( vào lúc sớm và lúc trễ ). 1.1.4.2. Phân lập và giám định virus Nuôi cấy tế bào: virus giả dại mọc trên tế bào phôi gà con, tế bào thận heo, thỏ, dê, bê. Có thể 3 lần cấy chuyền thì phát hiện thể vùi trung nhân. Đặc điểm mọc trên tế bào phôi thai gà có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán. Kết quả nhận được từ 24 giờ đến 15 ngày. Đâ