Phương pháp xác định axit shikimic trong quả Hồi bằng sắc ký lỏng cao áp HPLC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI VIỆN ĐÀO TẠO SAU ĐẠI HỌC -----------*&*----------- TIỂU LUẬN MễN HỌC Tờn tiểu luận Phương phỏp xỏc định axit shikimic trong quả Hồi bằng sắc ký lỏng cao ỏp HPLC Họ và tờn HV: Nguyễn Thị Xuõn Nhung Mó số : CB101199 Lớp : CHTP2010 Hà Nội 2011 Mục lục I. Tổng quan về axit shikimic và các phơng pháp xác định hàm lợng. I.1. Tổng quan về axit shikimic Axit shikimic lần đầu tiên đợc phân lập vào năm 1885 từ cây ở Nhật Bản, tên là Shikimino-ki (Illicium anisatum). Tuy nhiên, nó cũng có mặt trong các cây lá nhọn, trong rất nhiều loại quả trong đó có quả Hồi (Illicium verum) (khoảng từ 5-7%) []. Axit shikimic đóng vai trò quan trọng, đợc coi là một trong những chất chìa khóa trong quá trình sinh tổng hợp của rất nhiều hợp chất tự nhiên quan trọng, bao gồm amino axit thơm, alkaloid, các hợp chất phenolic, phenylpropanoid và các dẫn xuất của chúng, ví dụ nh flavonoids, lignans, lignins. Hình 1: Cấu trúc của axit shikimic (C7H10O5) Axit shikimic (3,4,5- Trihydroxy-1-cyclohexen-1-carboxylic axit) có thể đợc sinh tổng hợp từ axit chinic bằng phơng pháp đề hydrat hoá. Một số đặc tính hoá lý của axit shikimic [] - Nhiệt độ nóng chảy: 178 – 180 0C - Độ quay cực : [a]D22 - 157 (c, 1 trong nớc) - Axit tan trong nớc khoảng 18%, dễ tạo thành dung dịch bão hoà trong nớc. Axit shikimic tan kém trong ete và rợu, không tan trong một số dung môi hữu cơ nh benzen, clorofooc và ete dầu hoả []. Axit shikimic là nguồn nguyên liệu chủ yếu để tổng hợp hoạt chất oseltaminvir, thành phần chính để sản xuất thuốc Taminflu chống virút cúm. Trong dịch cúm gà H5N1 và cúm lợn H1N1 gần đây, số ngời mắc và số ngời chết nhiều đến mức kỷ lục khiến WHO phải đa mức cảnh báo về dịch lên mức 6 là mức cao nhất. ảnh hởng của dịch cúm lên nền kinh tế toàn cầu nói chung và Việt Nam nói riêng là không đếm đợc. Theo các tài liệu [] [], nguồn nguyên liệu axit shikimic đợc sử dụng chủ yếu cho quá trình tổng hợp oseltamivir - thành phần chính của thuốc Taminflu, đợc chiết xuất từ quả Hồi ở Trung Quốc và Việt Nam. Chính vì vậy, xây dựng phơng pháp chiết tách axit shikimic với hiệu suất cao từ quả Hồi đã đợc nhiều nhà khoa học trong và ngoài nớc quan tâm. Thông thờng, hàm lợng axit shikimic trong quả Hồi phụ thuộc vào từng giống Hồi, từng vùng sinh thái, thời vụ thu hái và điều kiện chiết xuất. Việc xác định nhanh và chính xác hàm lợng axit shikimic trong quả Hồi sẽ rất có ích cho quá trình tuyển chọn nguồn nguyên liệu tốt, tiến tới cung cấp nguồn nguyên liệu với khối lợng lớn cho quá trình chiết xuất axit shikimic hàng loạt, phục vụ cho sản xuất Taminflu. Nguồn nguyên liệu Hồi Hồi (Illicium verum) đợc trồng rộng rãi ở một số huyện thuộc các tỉnh Lạng Sơn, Quảng Ninh, và một vài địa phơng thuộc miền Nam Trung Quốc. Quả Hồi khô và tinh dầu Hồi từ xa xa đã đợc sử dụng làm thuốc và gia vị. Cây Hồi từ lâu đã đợc gây trồng ở dạng rừng trồng hoặc bán hoang dại tại các tỉnh miền núi Đông Bắc nớc ta. Quả Hồi và tinh dầu Hồi đã đợc xuất khẩu sang các nớc Trung Quốc, Đông Âu, Cuba và Pháp. Nhng sau chiến tranh biên giới phía Bắc diện tích rừng Hồi cũng bị thu hẹp nhiều. Ngày nay, nh đã trình bày ở trên, axit shikimic chiết xuất từ quả Hồi là nguồn nguyên liệu quan trọng trong việc sản xuất thuốc Taminflu, thuốc đặc hiệu phòng chống bệnh đại dịch cúm. Vì vậy, nhằm tạo đợc nguồn nguyên liệu ổn định về số lợng và chất lợng, xác định hàm lợng axit shikimic chiết xuất từ Hồi là vấn đề cần đợc u tiên quan tâm []. I.2. Các phơng pháp xác định hàm lợng axit shikimic từ quả Hồi I.2.1. Xây dựng phơng pháp chiết tách axit shikimic từ quả Hồi Có rất nhiều phơng pháp sử dụng để chiết tách axit shikimic từ cây Hồi. Adams và cộng sự [] chiết tách axít shikimic từ cây Hồi sử dụng phơng pháp chiết Soxhlet và làm sạch bằng phơng pháp trao đổi anion và Solka-Floc đã đạt đợc hiệu suất tới 7%. Payne và Edmonds [] cũng sử dụng phơng pháp này nhng sử dụng kỹ thuật làm sạch tẩy màu bằng than hoạt tính. Các tác giả này cũng cho rằng có thể sắc ký trao đổi ion trong quá trình tinh chế axit shikimic do sự có mặt của nhóm chức axit cacboxylic trong cấu trúc của axit shikimic. Tác giả Nguyễn Thị Luyện và cộng sự [] đã trình bày các nghiên cứu chiết tách axit shikimic từ hoa Hồi bằng cách chiết trong bể điều nhiệt trong nớc hoặc bằng cách đun Hồi lu trong cồn. Các phơng pháp sau đơn giản, dễ tiến hành và hiệu suất thu đợc từ 6-7%. Dới đây là một số phơng pháp thử nghiệm chiết tách axit shikimic đã đợc tiến hành trên các mẫu quả Hồi. Mẫu tiến hành thử nghiệm là mẫu hỗn hợp của các mẫu quả Hồi. Phơng pháp C1: Chiết xuất axit shikimic trong bể siêu âm bằng các dung môi khác nhau Nh đã trình bày ở phần tổng quan, axit shikimic tan nhiều trong nớc, tan kém trong ete và rợu, không tan trong một số dung môi hữu cơ nh benzen, clorofooc và ete dầu hoả. Tiến hành thí nghiệm sử dụng một số dung môi và hỗn hợp dung môi để chiết xuất axit shikimic trong bể siêu âm bằng các dung môi nh sau: - Dung môi 1: nớc cất Dung môi 2: cồn 96% Dung môi 3: cồn 50% Cân chính xác 3g mẫu hỗn hợp quả Hồi khô đã đợc nghiền nhỏ đem tiến hành chiết trong bể siêu âm ở 500C trong 30 phút lần lợt trong các dung môi khác nhau (nớc cất, cồn 96% và cồn 50%). Tiến hành chiết ba lần, với các thể tích dung môi là 50, 30 và 25ml dung môi, thu tổng dịch chiết rồi đem chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Với dịch chiết là dung dịch cồn, tiến hành thêm bớc thí nghiệm quay cô loại dung môi rồi hoà tan lại trong nớc trớc khi chạy sắc ký lỏng. Kết quả cho thấy chiết bằng dung dịch nớc cất là tốt nhất, đồng thời chứa ít tạp chất hơn là dịch chiết cồn, ảnh hởng đến quá trình xử lý mẫu và phân tích sắc ký lỏng. Phơng pháp C2: Chiết xuất axit shikimic bằng đun Hồi lu trên bếp cách thuỷ - Dung môi là cồn 96% - Dung môi là cồn 50% - Dung môi là nớc cất Cân chính xác 3g mẫu hỗn hợp quả Hồi khô đã đợc nghiền nhỏ, đem tiến hành đun Hồi lu với thời gian và lợng dung môi để chiết nh trên. Dịch mẫu chiết đợc đem chạy qua sắc ký lỏng. Kết quả cho thấy chiết trong dung môi là nớc cất tốt hơn (trung bình đạt 4,90%) so với khi chiết bằng cồn 50% (trung bình đạt 4,65%) và dung môi cồn 96% (trung bình đạt 4,60%). ố Kết luận về phơng pháp chiết xuất: Từ các kết quả nghiên cứu trên đã chọn được phơng pháp chiết bằng siêu âm với dung môi là nớc, đơn giản và cho hiệu suất chiết cao nhất. Xác định nhiệt độ chiết: Tiến hành chiết 3 lần chiết với lợng mẫu thử là 3g hỗn hợp mẫu nghiên cứu, mỗi lần 30 phút với lợng dung môi là nớc với thể tích lần lợt là 50, 30, 25 ml, lần lợt ở các nhiệt độ 30oC, 50oC, 70oC. Kết quả cho thấy chiết tại nhiệt độ 50oC trong dung môi là nớc cất tốt hơn (trung bình đạt 5%) so với khi chiết ở 30oC (trung bình đạt 4,90%) và ở 70oC (trung bình đạt 4,85%). Xác định số lần chiết: Tiến hành chiết 3 lần chiết với lợng mẫu thử là 3g hỗn hợp mẫu nghiên cứu, mỗi lần 30 phút với lợng dung môi là nớc với thể tích lần lợt là 50, 30, 25 ml. Kết quả cho thấy, phần lớn axit shikimic đợc chiết ra trong lần thứ nhất. Dịch chiết lần thứ nhất có hàm lợng axit shikimic chiếm 65,5% tổng axit shikimic của mẫu sau 3 lần chiết. Dịch chiết lần thứ t: có hàm lợng axit shikimic không đáng kể (0,6%). Kết quả trên cho thấy, sau ba lần chiết với số lợng dung môi nh trên, axit shikimic đã đợc chiết kiệt khỏi mẫu. I.2.2. Xây dựng phơng pháp xác định hàm lợng axit shikimic Theo các tài liệu đã công bố, có rất nhiều phơng pháp khác nhau để xác định hàm lợng axit shikimic nh quang phổ so màu, điện di mao quản, sắc ký lỏng hiệu năng cao Trong phơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao, rất nhiều tác giả đã sử dụng các loại cột khác nhau nh cột trao đổi ion, cột silicagen dẫn xuất hoá NH2, cột C18 [] [] [] [] Trên cơ sở các nghiên cứu đó ngời ta đã tiến hành xây dựng phơng pháp xác định hàm lợng axit shikimic bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng cột pha đảo C18, bao gồm 2 giai đoạn. Giai đoạn 1: Xử lý mẫu bằng phơng pháp chiết pha rắn SPE (solid phase extraction) Dịch chiết tổng nếu đợc bơm trực tiếp vào cột sắc ký lỏng sẽ cho ra các pic nhiễu trên sắc đồ, đồng thời làm giảm tuổi thọ của cột. Vì vậy, cần lọc mẫu, loại tạp chất trớc khi bơm mẫu vào hệ thống sắc ký lỏng bằng cách cho mẫu đi qua cột chiết pha rắn C18 và sử dụng dung môi thích hợp để giải hấp, sau đó đợc lọc qua màng lọc Whatman trớc khi bơm mẫu vào sắc ký lỏng. Giai đoạn 2: Định lợng axit shikimic bằng phơng pháp ngoại chuẩn trên máy sắc ký lỏng nối ghép khối phổ HPLC-MS - Các điều kiện phân tích hệ HPLC: + Máy sắc ký lỏng HPLC-MS 1200 nối ghép khối phổ 6310 Ion trap (Agilent Technologies, Mỹ). + Cột Zorbax XDB C18 4,6x150mm + Nhiệt độ cột: 35oC + Hệ dung môi: MeOH/H2O (0.1% formic acid) = 2/98 + Thời gian chạy: 10 phút + Tốc độ dòng: 0.6 ml/phút + Bơm mẫu: 5 ml/lần + Bớc sóng: 254nm, 220nm, 212nm + Bớc sóng định lợng: 254nm - Các điều kiện hệ MS: + Detector: MS Ion Trap với chế độ quét tự động và bẫy mảnh ở Negative, mảnh bẫy đợc chọn là 173 + áp suất đầu phun: 30psi + Nhiệt độ làm khô: 325oC + Hệ nén khí dung có tốc độ dòng 8l/phút + Khoảng quét phổ: 50-300m/Z - Chuẩn bị mẫu và đờng chuẩn: + Dung dịch axit shikimic chuẩn đợc pha thành các nồng độ 0.05, 0.1, 0.25, 0.5, 1, 1.25, 1.5, 2, 3, 4, 5(mg/ml) để dựng đờng ngoại chuẩn + Xác định phơng trình hồi quy tuyến tính thu đợc từ đờng ngoại chuẩn là + Hệ số tơng quan R2 Axit shikimic sử dụng là axit tinh khiết (>99%). Xác định thời gian lu. Phổ UV của pic axit shikimic có một cực đại hấp thụ tại 212nm [] [] []. ố Kết luận về phơng pháp sử dụng: Dựa vào các kết quả thí nghiệm trên, lựa chọn phơng pháp C1 (chiết siêu âm trong nớc 3 lần ở 50oC) để chiết tách và sử dụng phơng pháp phân tích sử dụng sắc ký lỏng nối ghép khối phổ để xác định hàm lợng axit shikimic. II. Tài liệu tham khảo Adams H., Bailey N., Brettle R., Cross R., Frederickson M., Haslam E., Macbeach F., Davies G. Tetrahedron. 1996, 52, p. 8565-8580. Claudia Mardones, Antonieta Hitschfeld, Alejandra Contreras, Karla Lepe, Luis Gutierrez, Dietrich von Baer, 2005. Comparison of shikimic acid determination by capillary zone electrophoresis with direct and indirect detection with liquid chromatography for varietal differentiation of red wines. Journal of Chromatography A, 1085, p. 285–292. Đỗ Tất Lợi, 1999. Những cây thuốc và vị thuốc Việt nam. Nhà xuất bản Y học, trang 524-525. Eykman J.F. 1885, Rec. Trav. Chim. Pays-bas, 4, p. 32. Jang S. and Singh G. 1998. Tetraheron 54, p. 4697- 4753. Mangas J. J., J. Moreno, B. Suarez, A. Picinelli and D. Blanco, 1998. Chromatographic Analysis of Non-Volatile Strawberry, Compounds. Chromatographia Vol. 47, No. 3/4, p. 197-202. Natural products on CD-ROM dictionary, 2000. Version 11.1, Copyright (c) 1982-2003 Chapman & Hall/CRC. Nguyễn Thị Luyện, Lê Tiến Hng, Phan Tiến Thành, 2006. Chiết xuất acid shikimic từ hoa Hồi. Tạp chí Dợc học, số 358 năm 46, trang 8-9. Payne Richard and Michael Edmonds, 2005. Isolation of Shikimic Acid from Star Aniseed. Journal of Chemistry Education, 82 (4). JCE Featured Molecules, an interactive modeling feature, Only@JCE Online: Romero Rodriguez M.A., Vazquez Oderiz, M.L., Lopez Hernandez J., Simal Lozano J., 1992. Determination of vitamin C and organic acids in various fruits by HPLC. Journal of Chromatographic Science 30 (11), p. 433- 437. Rompp. , 1992. Chimie Lexikon. Band 5, p. 4136 Stavric B. and D.R. Stoltz., 1976. Shikimic acid, Food Cosmet Toxicol. 14(2), p.141–145. Tusseau D. and C. Benoit, 1987. Routine high-performance liquid chromatographic determination of carboxylic acids in wines and champagne. Journal of chromatography 395, p. 323-33. Vũ Ngọc Lộ, Đỗ Chung Võ, Nguyễn Mạnh Pha, Lê Thuý Hạnh. 1996. Những cây tinh dầu Việt Nam: Khai thác-Chế Biến-ứng dụng. Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật, tr. 94-97. Wang X Q, Guo Y.J, Yang C.S., 2001. Determination of shikimic acid in fruit of Illiciacea plants by HPLC with diode array detection. China Journal of Chinese Material Medica, 26 (7): 447-9.