Seminar enzyme protease

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN NHÓM 1 SEMINAR ENZYME PROTEASE An Giang, Tháng 03.2013 TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN SEMINAR ENZYME PROTEASE GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Th.S Nguyễn Phú Thọ Th.S Lê Hoàng Bảo Ngọc NHÓM 1 1. Bung San Ny Thanh Hồng Anh 2. Trương Thị Ngọc Hân 3. Lê Thị Đẹp 4. Nguyễn Hoàng Nhựt Lynh 5. Hoàng Nguyễn Trung Nghĩa 6. Nguyễn Hoàng An 7. Trần Văn Phận 8. Nguyễn Phú Hơn 9. Nguyễn Minh Luân 10. Trần Thanh Tiền An Giang, Tháng 03.2013 i Mục lục Nội dung Trang Mục lục ....................................................................................................................................... i Danh sách hình .......................................................................................................................... iii Chương 1: Giới thiệu ................................................................................................................ 1 Chương 2: Tổng quan về enzym Protease ............................................................................... 2 2.1. Đặc điểm chung ................................................................................................................... 2 2.2. Phân loại .............................................................................................................................. 3 2.3. Quy trình thu nhận protease ................................................................................................. 4 Chương 3: Thu nhận protease ................................................................................................. 5 3.1. Thu nhận protease từ thực vật .............................................................................................. 5 3.1.1. Bromelin ........................................................................................................................... 5 3.1.2. Papain ............................................................................................................................... 6 3.1.3. Ficin ................................................................................................................................. 7 3.2. Nguồn protease từ từ động vật ............................................................................................. 9 3.2.1. Pepsin ............................................................................................................................... 9 3.2.2. Rennin ............................................................................................................................ 10 3.2.3. Pancreatin ....................................................................................................................... 11 3.2.4. Trypsin ........................................................................................................................... 12 3.2.5. Chymotrypsin ................................................................................................................. 13 3.3. Nguồn protease từ vi sinh vật ............................................................................................. 14 3.3.1. Đặc điểm chung .............................................................................................................. 14 3.3.2. Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật ................................................................ 14 3.3.3. Một số loại enzyme vi sinh vật: ....................................................................................... 15 Chương 4: Tình hình nghiên cứu - Ứng dụng enzym protease ............................................. 17 4.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease .............................................................................. 17 4.1.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước .......................................................... 17 ii 4.1.2. Tình hình nghiên cứu enzyme Protease trên thế giới: ...................................................... 17 4.2. Ứng dụng enzyme protease ................................................................................................ 18 4.2.1. Trong công nghiệp sữa .................................................................................................... 18 4.2.2. Trong chế biến nước mắm ............................................................................................... 19 4.2.3. Trong công nghiệp chế biến thịt ...................................................................................... 19 4.2.4. Trong công nghiệp dệt .................................................................................................... 19 4.2.5. Trong sản xuất bia........................................................................................................... 20 4.2.6. Trong công nghiệp da ..................................................................................................... 21 4.2.7. Trong hương phẩn, mỹ phẩm .......................................................................................... 21 4.2.8. Trong y học .................................................................................................................... 22 4.2.9. Trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa ............................................................................ 23 4.2.10. Trong một số ngành khác .............................................................................................. 24 Chương 5: Kết luận ................................................................................................................ 25 Tài liệu tham khảo .................................................................................................................. 26 iii Danh sách hình Nội dung Trang Hình 2.1: Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein .................................................. 2 Hình 2.2: Sơ đồ phân loại protease ............................................................................................. 3 Hình 2.3: Quy trình tổng quát thu nhận protease ......................................................................... 4 Hình 3.1: Cấu trúc phần hydrocacbon của bromelin thân dứa ...................................................... 5 Hình 3.2: Quy trình tổng quát thu nhận và tinh sạch enzym bromelin ......................................... 6 Hình 3.3: Mô hình phân tử enzyme protease (papain) ................................................................. 6 Hình 3.4: Cấu trúc tâm hoạt động của papain .............................................................................. 6 Hình 3.5: Sơ đồ tổng quát quy trình thu nhận ficin từ nhựa sung ................................................. 8 Hình 3.6: Cấu trúc không gian của pepsin A ............................................................................... 9 Hình 3.7: Một số chế phẩm men tiêu hóa pepsin ......................................................................... 9 Hình 3.8: Phomat ...................................................................................................................... 11 Hình 3.9: Một số chế phẩm pacreatin ........................................................................................ 11 Hình 3.10: Cấu trúc không gian của trypsin .............................................................................. 12 Hình 3.11: Trypsin cắt các liên kết tạo ra bởi nhóm carboxyl (-COOH) của lysin hoặc arginine với nhóm amine (-NH2) của các amino acid bất kì .................................................................... 13 Hình 3.12: Cấu trúc không gian của chymotrypsin .................................................................... 13 Hình 3.13: Cấu trúc không gian của subtilisin ........................................................................... 15 Hình 3.14: Cấu trúc tâm hoạt động của subtilisin ...................................................................... 15 Hình 3.15: Chế phẩm từ collagenase ......................................................................................... 16 Hình 4.1: Một số loại Phomat ................................................................................................... 18 Hình 4.2: Một số loại nước mắm điển hình ............................................................................... 19 Hình 4.3: Một số loại bia .......................................................................................................... 20 Hình 4.4: Sơ đồ khái quát quy trình sản xuất bia ....................................................................... 20 Hình 4.5: Các giai đoạn làm sạch lông ...................................................................................... 21 Hình 4.6: Mỹ phẩm chứa collagen ............................................................................................ 21 iv Hình 4.7: Thuốc có chứa enzyme papain .................................................................................. 22 Hình 4.8: Thuốc có chứa bromelin ............................................................................................ 23 Hình 4.9: Thuốc có chứa chymotripsin ..................................................................................... 23 Hình 4.10: Sản xuất bánh kẹo ................................................................................................... 24 1 Chương 1: Giới thiệu Protease là chất xúc tác thủy phân protein tạo thành những phân tử thấp và các amino acid. Chúng không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường. Protease là một trong những enzyme được ứng dụng rất nhiều trong mọi lĩnh vực. Đặc biệt là công nghiệp thực phẩm, protease đã có những đóng góp rất to lớn trong việc phục vụ và nâng cao đời sống của con người. Hiện nay trên thế giới, công nghệ thu nhận protease từ vi sinh vật hiện còn đang phát triển, tìm tòi nghiên cứu về khả năng ứng dụng vô vàn của enzyme protease. Ở Việt Nam cũng có nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng Protease, chủ yếu tập trung vào các protease thực vật và động vật còn protease vi sinh vật chỉ được nghiên cứu trong hơn chục năm trở lại đây. 2 Chương 2: Tổng quan về enzym Protease 2.1. Đặc điểm chung Protease là nhóm enzym xúc tác sự thủy phân liên kết peptide, là liên kết chủ yếu trong phân tử protein và peptide. Cơ chế thủy phân như sau: Thường các protease trong cơ thể tồn tại ở dạng không hoạt động (zymogen) và có thể trở thành hoạt động do chính protease tương ứng tác động bằng sự cắt đứt một hay một số liên kết peptide trong phân tử của nó, khi đó sự thay đổi cấu trúc phân tử theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác, enzym chuyển sang trạng thái hoạt động. Hình 2.1: Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein Cấu trúc bậc bốn của phân tử protein ảnh hưởng đến quá trình phân giải cơ chất dưới tác dụng của các protease. Dạng monomer và dimer của cơ chất dễ phân giải hơn dạng tetramer. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. 3 2.2. Phân loại Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) . Hình 2.2: Sơ đồ phân loại protease Với enzym protease thì có nhiều cách phân loại nhưng ta chỉ dựa vào hai đặc điểm sau để phân loại chúng: Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các peptide trong phân tử protein, người ta chia protease làm 2 nhóm chính: Endopeptidase (proteinase): Chủ yếu phân giải các liên kết peptide nằm trong phân tử protein tạo thành những đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ. Exopeptidase (polypeptidase): Chủ yếu phân cắt peptide ở hai đầu mạch. Dựa vào thành phần amimo acid và vùng pH tối ưu của protease, người ta chia làm các nhóm: Protease acid: pepsin, renin, … hoạt động ở vùng pH acid. Protease kiềm: tryssin, chymmotrysin, … hoạt động ở vùng pH kiềm. Protease trung tính: papain, … hoạt động ở vùng pH trung tính. 4 2.3. Quy trình thu nhận protease Trong sản xuất các chế phẩm protease, người ta thường chia làm hai giai đoạn: Thu Protease thô và tinh sạch protease. Thu chế phẩm protease thô: Với nguồn động vật và thực vật thì ta nghiền , trích ly rồi ly tâm. Còn với nguồn vi sinh vật thì ta nuôi cấy, phá vỡ tế bào rồi đem ly tâm. Tinh sạch protease: Sử dụng phương pháp hóa lý để loại dần các thành phần không phải protease ra khỏi thành phần protease. Sản phẩm cuối cùng là protease tinh khiết. Hình 2.3: Quy trình tổng quát thu nhận protease 5 Chương 3: Thu nhận protease 3.1. Thu nhận protease từ thực vật Thực vật có nguồn enzym đã được loài người hiểu biết và ứng dụng từ rất lâu. Cho đến nay, người ta đã thu nhận enzym từ thực vật để ứng dụng vào các sản xuất khác nhau chủ yếu là nhóm protease. Một số protease phổ biến được thu từ nguồn thực vật: Bromelin, papain, ficin… 3.1.1. Bromelin Bromelin là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 maltose, 2 glucosamine, 2 xylose và 1 fructose. Hình 3.1: Cấu trúc phần hydrocacbon của bromelin thân dứa Bromelin có trung tâm hoạt động chứa cysteine và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối -S-S-. Hoạt tính của bromelin là do nhóm sulfhydryl trong trung tâm hoạt động quyết định. Bromelin có 3 hoạt tính khác nhau: Peptidase, amidase và esterase. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của bromelin: Cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzym, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh khiết… Bromelin có nhiều ở trong thân và quả dứa. Hoạt tính bromelin cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi quả chín, do đó thu hoạch trái dứa vào khoảng thời gian này sẽ cho năng suất enzym cao. Bromelin thân được thu từ dịch rút ra từ thân cây dứa, trung bình có thể thu được 3,6kg bromelin từ 378 lít nước rút ra từ thân cây dứa. Việc thu nhận và tinh sạch bromelin được thực hiện theo sơ đồ sau: 6 Hình 3.2: Quy trình tổng quát thu nhận và tinh sạch enzym bromelin 3.1.2. Papain Hình 3.3: Mô hình phân tử enzyme protease (papain) Là một protease-thiol, trung tâm hoạt động có nhóm –SH. Chính nhóm này quyết định hoạt tính của papain. Hình 3.4: Cấu trúc tâm hoạt động của papain Theo R. L. Hill và E.L. Smith, Papain là một chuỗi polypeptide gồm 185 amyno acid, trọng lượng phân tử là 20.900 dalton. 7 Enzym papain được thu từ nguồn nguyên liệu là cây đu đủ (Carica papaya). Nhựa cây đu đủ là hỗn hợp enzym chứa các protease: Papain, chymopapain, proteinase III, proteinase IV, thiolprotease… Trong đó papain chiếm 95% hàm lượng hỗn hợp enzym này. Quả xanh vào khoảng 10 tuần tuổi chứa nhiều nhựa nhất và hoạt tính enzym cao nhất. Hoạt tính của papain phụ thuộc vào các yếu tố sau: Nhiệt độ: Papain là enzym chịu được nhiệt độ tương đối cao. Ở dạng nhựa khô papain không bị biến tính trong 3h ở 1000C. Còn ở dạng dung dịch papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,50C và nếu tăng nhiệt độ cao hơn nó sẽ mất hoàn toàn hoạt tính do cấu trúc trung tâm hoạt động bị phá hủy hoàn toàn. Khi thủy phân các protein khác nhau thì nhiệt độ phản ứng thích hợp cho papain cũng khác nhau. pH: Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 – 8,5 nhưng lại dễ biến tính trong môi trường acid có pH 12. Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ khác nhau. Papain dạng ổn định tức dạng mà cấu trúc không gian của enzym được ổn định, có thể chịu được các pH = 1,5 và pH = 8,5. Dung môi: Papain không thay đổi độ quay quang học trong methanol 70% và cũng không thay đổi độ nhớt trong methanol 50%. Trong dung dịch dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm giảm hoạt tính cũng như thay đổi cấu hình papain. Các chất gây biến tính mạnh như TCA 10%, guanidine hydrochcloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ quay quang học và hoạt tính của papain. 3.1.3. Ficin Enzym ficin được thu từ nguồn nguyên liệu là cây sung, vả (Ficus), thuộc họ Moraceae, bộ Urticales. Cây sung xuất xứ từ vùng Tây Á và phân bố khắp vùng Địa Trung Hải. Ở Việt Nam có nhiều lồi sung khác nhau: sung (Ficus racemosa L), sung trổ (Ficus variegata), sung ba thuỳ (Ficus hirta), sung thằn lằn (Ficus pumila L), vả (Ficus auriculata lour). Ficin được chiết tách từ nhựa sung. Hầu hết các bộ phận của cây đều có chứa nhựa. Người ta có thể thu ficin từ nhựa của lá, thân và quả sung. Ở dạng nhựa tươi, ficin dẽ bị oxi hóa bởi không khí làm cho dịch nhựa chuyển sang màu hồng nâu hoặc hồng và đồng thời hoạt tính xúc tác bị gỉam xuống. Các liên kết peptide của nhiều loại protein tự nhiên như protein sữa, hemoglobin, protein đậu nành, gelatin, collagen, elastin, fibrin, fibrinogen và cả Ascaris sống đều có thể bị thủy giải bởi enzim ficin. Ficin còn có thể thủy gỉai các liên kết peptide, ester, các liên kết amide của cơ chất nhân tạo. 8 Hoạt tính của papain phụ thuộc vào các yếu tố sau: Nhiệt độ: Trong khoảng nhiệt độ không làm biến tính enzym, tốc độ phản ứng của enzym tỷ lệ thuận với sự gia tăng nhiệt độ. Nhiệt độ hoạt động: 30 - 800C. Nhiệt độ tối hảo cho hoạt tính xúc tác 50 - 650C. Ficin có thể giữ nguyên hoạt tính trong 2 giờ ở 500C. Độ pH: pH hoạt động của ficin rộng: 4 – 9,5 (dịch nhựa sung có pH = 5); pH tối thích của ficin phụ thuộc vào loại cơ chất của enzim: gelatin: pHopt = 5; casein: pHopt = 9,5; hemoglobin: pHopt = 7. Các yếu tố hoạt hóa: Hoạt tính của ficin tăng lên khi có mặt của các nhân tố: kim loại, cyanide, cysteine, mercaptoethanol, 1,2-dimercaptopropanol. Các yếu tố kìm hãm: Enzym sẽ bị bất hoạt khi các chất ức chế như HgCl2, N-ethylmalemnide, iodo acetic acid, chloroacetamide hay iodoacetamide. Hình 3.5: Sơ đồ tổng quát quy trình thu nhận ficin từ nhựa sung 9 3.2. Nguồn protease từ từ động vật Hai protease acid quan trọng trong tuyến tiêu hóa ở người và động vật, có nhiều ứng dụng và được quan tâm là pepsin và rennin, đặc biệt về khả năng đông tụ sữa. Hai enzym này được thu nhận chủ yếu từ dạ dày động vật (heo, bê, bò…) 3.2.1. Pepsin Pepsin hoạt đợng trong dịch vị của động vật có vú, chim, bò sát và cá. Pepsin thô là một hỗn hợp của pepsin, gelatinase, cathepsin và Brucke pepsin. Pepsin heo thô chứa một pepsin chính A, pepsin phụ B, C, D và gastricsin. Hình 3.6: Cấu trúc không gian của pepsin A Pepsin là một mạch polypeptide đơn giản hợp thành bởi 329 amino acid, đầu C là alanin và đầu N là isoleusine, có thể cuộn lại thành hình cầu, rất ít xoắn cấu trúc bậc hai, cấu trúc bậc bốn cũng gồm có bốn tiểu phần; pepsin là một protein vững chắc bởi các mối liên kết hydro, hydrophobic, liên kết điện tử và S-S. Trung tâm hoạt động của pepsin gồm một hoặc hai nhóm carbonxyl của acid glutamic, một nhân thơm (phenol) của tyrosin. Chế phẩm pepsin được tồn tại ở dạng bột vô định hình, trắng hay vàng nhạt hay mảnh nhỏ, trong hay hơi đặc, mùi đặc biệt giống mùi nước thịt, vị hơi chua. Hình 3.7: Một số chế phẩm men tiêu hóa pepsin 10 Pepsin xúc tác trực tiếp sự thủy giải protein, tạo thành chủ yếu những peptide ngắn, có ít hay không có amino acid tự do. Pepsin không có kh