Sinh tổng hợp kháng sinh streptomycin

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊNKHOA KHTN & CNBÀI TIỂU LUẬNMÔN: HÓA SINH ỨNG DỤNGNHÓM 11. Nguyễn Đình Thư2. Nguyễn Thị Dung3. Nguyễn Thị Trinh4. Nguyễn Thị Hạnh5. Nguyễn Thị Thùy Trinh6. Nguyễn Thị Thanh Huyền7. Nguyễn Khả Thị Giang 8. Lê Thị Huyền Trang9. Trương Thị Hồng Oanh10. Đỗ Thúy KiềuSINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH STREPTOMYCINSTREPTOMYCIN1. Khái quátKháng sinh là các chất có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật.Streptomycin là một kháng sinh dùng phổ biến trong y học, thú y và bảo vệ thực vật.1.1. StreptomycinD-glucose-6P1L-myo-inositol-1PMyo-inositolScyllo-inososeScyllo-inosamineAmidino-Scyllo-inosamine-4PScyllo-inosamine-4PAmidino-3-keto-Scyllo-inosamineAmidino-Scyllo-inosamineAmidinostreptamine-6PAmidinostreptamineDihydrostreptomycin-6PStreptidine-6P D- Glucose-1PdTDP-glucosedTDP-4-oxo-6-deoxy-D-GlucosedTDP-4-oxo-L-rhamnosedTDP-L-rhamnosedTDP-L-dihydro-streptoseButirosin and neomycin biosynthesisPolyketide sugar unit biosynthesisO-1,4-α-L-dihydro-streptosyl-streptidine-6PStreptomycin-6PstreptomycinAminoglycosidesNDP-N-methyl-L-glucosamineD - glucoseSơ đồ sinh tổng hợp streptomycin1.2. Xác định hoạt tính kháng sinh của streptomycinTheo phương pháp của Loo, Y.H. et al., (1945) và Waksman S.A (1945) bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch. Môi trường khoáng: pH = 7,3Trước khi xác định bổ sung thạch 1,5%, glucose 0,5% đã thanh trùng bằng phương pháp lọc và 1ml dung dịch muối vào môi trường thạch nóng chảy sau khi làm lạnh xuống 55oC. Sau đó lắc đều và đổ 30ml môi trường vào đĩa peptri vô trùng(φ= 100mm) và để đông lại. Độ dày của môi trường thạch 2,0± 0.2mm.Vi sinh vật kiểm định được sử dụng là E.coli. Giống ban đầu được bảo quản trong môi trường thạch nghiêng ở 4oC.Thành phầnKH2PO4K2HPO4NaCl(NH4)2SO4%0,320,420,20,21.2. Xác định hoạt tính kháng sinh của streptomycinSau khi đục lỗ thạch, nhỏ dung dịch streptomycin cần xác định đã pha loãng đến nồng độ thích hợp vào lỗ thạch và xác định theo phương pháp của Dmitrieva, 1970. Đối chứng sử dụng kháng sinh streptomycin base chuẩn. 1 đơn vị streptomycin tương đương 0,97mcg streptomycin base.2. Lên men sản xuất streptomycin2.1. Chủng giống sản xuấtXạ khuẩn Streptomyces griseus 2.2 Môi trường và điều kiện lên menMôi trường: phải phù hợp với điều kiện nơi sản xuất và điều kiện phát triển của chủng giống.pH= 7,2Môi trường lên men được cấy 5% thể tích môi trương nhân giống sau 48h.Nhiệt độ lên men tối ưu là 28oC và thời gian lên men là 5-10 ngày.Thành phần Cao thịtPeptonGlucoseNaCl( g)35105Thành phầnDextroseCao thịt- peptonNaClKali phosphatAmon sunphatMgSO4.7H2OCaCO3 (g)101512,50,253,5Các giai đoạn lên men2.3. Quá trình lên men sản xuấtPhương pháp lên men: nuôi cấy chìm gồm 2 pha3. Tách chiết và tinh sạch3.1. Tách chiết bằng dung môi Điều chế streptomycin sunphat100l dịch lên men + 250g than hoạt tính, khuấy trộn 30 phút Sản phẩm là bột màu trắng có 600đv/ml, hiệu suất thu hồi 60%, độ sạch đạt 400đv/mgLọc ép khung bản với 2000g bột trợ lọc diatomit, rửa bằng 10l nướcHỗn hợp dịch lọc với dịch rủa được trung hòa đến pH=7 bằng NaOH và khuấy với 1000g than hoạt tính trong 30 phútThan hoạt tính chứa streptomycin lọc ép với bột trợ diatomit và rửa sạch 2 lần với 10l nướcTách Streptomycin ra khỏi than hoạt tính bằng 3,5l aceton (5-10%) đã acid hóa đến pH=2,5 bằng H2SO4Dịch streptomycin được khuấy với 3 lần thể tích (28,5l) aceton để rửa streptomycin sunphatƯớp lạnh ở 4oC để qua đêm, thu kết tủa bằng cách gạn và lọcRửa = 250ml nước cất, lọc loại bỏ chất không hòa tan, tiếp tục trung hòa bằng NaOH đến pH=7, lọc loại bỏ chất không hòa tanDịch streptomycin sunphat sạch được đông và cô chân không ở 200 đến 600psiĐiều chế streptomycin hydrochloridQuá trình điều chế tương tự như streptomycin sunphat nhưng thay HCl trong quá trình acid hóa.Streptomycin hòa tan trong aceton và tủa với aceton 75%.Năng suất thu nhận tốt hơn khi kết tủa với aceton 80%.HCl bổ sung để duy trì pH = 2 trong khi khuấy được tiếp tục trong 60 phút.Than hoạt tính được lọc qua phễu lọc Buchner và rửa bằng aceton đã acid hóa.Dung dịch tách chiết và dịch rửa đã được điều chỉnh pH = 7,7 bằng NaOH và cô đặc chân không đến còn 1/10 thể tích.Bổ sung 4 lần thể tích aceton để kết tủa streptomycin hydrochlorid.Hỗn hợp được làm lạnh qua đêm, lọc thu nhận kết tủa, hòa tan vào nước, đông lạnh và sấy khô chân không. Streptomycin hydrochlorid thu được là dạng bột hơi với năng suất thu được 43,5%Điều chế streptomycin hydrochloridStreptomycin hydrochlorid cũng được tạo ra từ streptomycin sunphat bằng cách cho 1g streptomycin sunphat (632000đv) hòa tan trong 7ml nước, pH = 3,2.Dung dịch CaCl2 (100ml) đã được bổ sung nhỏ giọt với khuấy liên tục đến một điểm kết tủa và kết tủa được loại bỏ bằng cách ly tâm và rửa sạch.Dịch lọc nhận được được làm lạnh đông và sấy khô. Streptomycin hydrochlorid thu được là 905mg bột màu trắng với hoạt tính là 590đv/mg, hiệu suất đạt 84% từ streptomycin sunphat.3.2. Tách chiết bằng phương pháp trao đổi ion4. Ứng dụngLà kháng sinh đầu tiên và đứng đầu trong nhóm aminoglycosid điều trị bệnh lao.Streptomycin được dùng trong điều trị bệnh tularemia, dịch hạch.Phối hợp với tetracyclin trong điều trị bệnh Brucella và phối hợp với tetracyclin hoặc sulfonamid để điều trị bệnh sổ mũi ngựa (nhiễm khuẩn Mallomyces mallei).Dùng đơn độc hoặc phối hợp với các thuốc chống nhiễm khuẩn khác để điều trị u hạch bẹn và da cam, lậu.Phối hợp với penicilin G hoặc ampicilin thường có hiệu quả trong điều trị viêm màng trong tim do Enterococcus và Strepxococcus.Streptomycin sunphat hấp thu từ ruột kém nên thường được sử dụng ở dạng tiêm.Liều bình thường là 0,5 – 1,0g/ngày.Tác dụng phụ: ảnh hưởng thính giác bài tiết, gây độc cho thính gác của thai nhi và tê liệt thần kinh cơ, khả năng gây độc ở trẻ em cao hơn ở người lớn.Cảm ơn THẦY và các bạn đã lắng nghe!