Sử dụng một số hóa chất để cải thiện hiệu quả ly trích DNA từ lông

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** BÙI THỊ NGỌC BÍCH SỬ DỤNG MỘT SỐ HÓA CHẤT ĐỂ CẢI THIỆN HIỆU QUẢ LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** SỬ DỤNG MỘT SỐ HÓA CHẤT ĐỂ CẢI THIỆN HIỆU QUẢ LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. TRẦN THỊ DÂN BÙI THỊ NGỌC BÍCH KS. NGUYỄN VĂN ÚT Khóa: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** USE SOME CHEMICALS TO ENHANCE ABILITY OF EXTRACTING DNA FROM HAIR Graduation thesis Major: Biotechnology Professor: Student: Ph. D. TRAN THI DAN BUI THI NGOC BICH Ba. NGUYEN VAN UT Term: 2002 – 2006 HCMC 9/2006 iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: * Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng Quý thầy cô đã tạo điều kiện tốt đẹp cũng nhƣ truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. * Ban giám đốc cùng tập thể cán bộ nhân viên Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp. * Tập thể cán bộ thú y và các cô chú tại lò mổ tập trung huyện Dĩ An – Bình Dƣơng đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình lấy mẫu. * PGS. TS. Trần Thị Dân, KS. Nguyễn Văn Út đã hƣớng dẫn tận tình, để tôi hoàn thành tốt đề tài. * Bạn Lƣơng Quý Phƣơng đã giúp tôi lấy mẫu lông để thí nghiệm. * Các anh chị tại Trung tâm Phân Tích Thí nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP HCM đã tạo mọi điều kiện cơ sở vật chất, kỹ thuật để tôi làm tốt đề tài. * Xin cảm ơn bạn bè ở lớp CNSH 28 đã giúp đỡ tôi và cùng học tập trong suốt 4 năm đại học. Sinh viên thực hiện Bùi Thị Ngọc Bích iv TÓM TẮT KHÓA LUẬN BÙI THỊ NGỌC BÍCH, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, tháng 9/2006, “SỬ DỤNG MỘT SỐ HÓA CHẤT CẢI THIỆN HIỆU QUẢ LY TRÍCH DNA TỪ LÔNG”. Hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Trần Thị Dân 2. KS. Nguyễn Văn Út Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 14 – 02 – 2006 đến ngày 30 – 07 – 2006 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Trong các thí nghiệm sinh học phân tử, ngƣời ta thƣờng sử dụng mẫu máu, da, cơ để ly trích DNA. Tuy nhiên, nhiều khi ta không thể có những loại mẫu đó, ví dụ trong khoa học hình sự hay khi nghiên cứu về những loài tiệt chủng hay loài quý hiếm. Ngoài ra, thu thập mẫu lông dễ dàng hơn thu thập các loại mẫu khác trên thú sống. Với mục đích tìm một quy trình tối ƣu cho ly trích DNA từ nhiều nguồn lông, đề tài đƣợc tiến hành trên lông bò và lông heo. Kết quả ly trích đƣợc đánh giá dựa vào tỷ số OD của mẫu DNA và hiệu suất thành công của PCR với đoạn mồi phân biệt giới tính và đoạn mồi phát hiện gen halothane. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau: 1. Dung dịch đệm ly trích chứa proteinase K và Ca2+ ở các nồng độ 2 mM, 6 mM và 10 mM cho DNA với tỷ số OD đạt khoảng 1,6 – 1,69. Trong đó, sản phẩm PCR từ DNA của gốc lông bò khi ly trích với dung dịch đệm có 10 mM Ca2+ cho 1 băng dài 370 bp của gen giới tính. 2. DNA ly trích từ mẫu gốc lông heo và gốc lông bò không có sự khác biệt nhau về tỷ số OD và hàm lƣợng . 3. DNA từ gốc lông bò (tỷ số OD trung bình 1,76) tinh sạch và có hàm lƣợng cao hơn DNA từ ngọn lông (1,2). 4. DNA ly trích từ dung dịch đệm có DTT (tỷ số OD trung bình 1,84) tinh sạch hơn DNA từ dung dịch đệm không có DTT (1,58). v 5. Nồng độ CTAB trong quá trình ly trích có ảnh hƣởng đến độ tinh sạch của DNA. Không bổ sung CTAB cho tỷ số OD cao nhất (1,84 ); 0,06% CTAB cho OD = 1,6; 0,2% CTAB cho OD = 1,3. 6. Sử dụng BSA cũng không có tác dụng trong việc cải thiện kết quả PCR vì không nhân đƣợc đoạn DNA 655 bp của gen giới tính. Nhìn chung, các hoá chất đƣợc bổ sung vào quy trình ly trích DNA và hỗn hợp PCR chỉ cho đoạn sản phẩm PCR ngắn (370 bp) mà không có đoạn DNA dài (655 bp) của gen giới tính. Đồng thời, các thí nghiệm đều không cho kết quả mong muốn khi PCR phát hiện gen halothane trên 5 mẫu lông heo. vi MỤC LỤC TRANG Lời cảm ơn ....................................................................................................................... 1 Tóm tắt khóa luận ...........................................................................................................iv Mục lục ...........................................................................................................................vi Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... viii Danh sách các bảng ........................................................................................................ix Danh sách các hình và biểu đồ ........................................................................................ x PHẦN I. MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu và yêu cầu .................................................................................................. 1 1.2.1. Mục tiêu ............................................................................................................. 1 1.2.2. Yêu cầu .............................................................................................................. 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 3 2.1. Cấu trúc tổng quan của lông ..................................................................................... 3 2.2. Cấu trúc của lông bò và lông heo ............................................................................. 3 2.3. Cấu trúc của melanin ................................................................................................ 4 2.4. Cấu tạo của keratin ................................................................................................... 5 2.5. Những công trình tách chiết DNA từ lông ............................................................... 5 2.6. Nguyên tắc của PCR ................................................................................................. 7 2.7. Nguyên tắc xác định gen giới tính và gen halothane ................................................ 9 2.7.1. Nguyên tắc xác định gen giới tính ..................................................................... 9 2.7.2. Nguyên tắc xác định gen halothane ................................................................... 9 PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................... 11 3.1. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 11 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành.............................................................................. 11 3.3. Vật liệu ................................................................................................................... 11 3.3.1. Nguồn mẫu chiết xuất DNA ............................................................................ 11 3.3.2. Đoạn mồi ......................................................................................................... 11 3.3.2.1. Đoạn mồi của gen xác định giới tính ........................................................ 11 vii 3.2.2.2. Đoạn mồi của gen halothane .................................................................... 12 3.4. PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ............................................................................. 12 3.4.1. Lấy và trữ mẫu ................................................................................................. 12 3.4.2. Tách chiết DNA ............................................................................................... 12 3.4.3. Đánh giá độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA ly trích ......................................... 15 3.4.4. Thực hiện phản ứng PCR ................................................................................ 15 3.4.4.1. Multiplex PCR xác định giới tính ............................................................ 15 3.4.4.2. PCR xác định gen halothane..................................................................... 16 3.4.5. Điện di và quan sát kết quả .............................................................................. 17 3.4.5.1. Chuẩn bị gel agarose ................................................................................ 17 3.4.5.2. Kết quả điện di PCR ................................................................................. 17 3.5 Xử lý số liệu ............................................................................................................ 17 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................... 18 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ Ca2+ trong dung dịch đệm ly trích DNA ............ 18 4.2. Thí nghiệm 2: So sánh DNA ly trích từ gốc và ngọn lông bò ............................... 19 4.3. Thí nghiệm 3: So sánh DNA ly trích từ lông heo và lông bò ................................ 20 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát tác dụng của DTT trong việc phân cắt keratin khi ly trích DNA ............................................................................................................................... 21 4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát tác dụng của CTAB trong việc loại bỏ melanin .............. 23 4.6. Thí nghiệm 6: Sử dụng BSA trong phản ứng PCR ................................................ 23 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 25 5.1. Kết luận................................................................................................................... 25 5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 25 VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 26 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 28 viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp base pair ctv cộng tác viên DNA deoxyribonucleic acid NST nhiễm sắc thể OD optical density DTT Dithiothreitol CTAB Cetyltrimetylamonium bromide BSA bovine serum albumine PCR polymerase chain reaction Taq thermus aquaticus Tỷ số OD tỷ số OD260 nm /OD280 nm UI unit UV ultra violet W wave ix DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 3.1 Trình tự các đoạn mồi của gen xác định giới tính ........................................ 12 Bảng 3.2 Thành phần hỗn hợp PCR xác định giới tính ................................................. 15 Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt trong PCR xác định giới tính ................................................... 16 Bảng 3.4 Thành phần hỗn hợp PCR xác định gen halothane ....................................... 16 Bảng 3.5 Chu kỳ nhiệt trong PCR xác định gen halothane .......................................... 17 Bảng 4.1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi tƣơng ứng với các nồng độ Ca2+ ...... 18 Bảng 4.2a Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 2 vị trí lông bò ............................ 19 Bảng 4.2b Kết quả PCR từ 2 vị trí lông bò ................................................................... 19 Bảng 4.3 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 2 nguồn lông ................................ 21 Bảng 4.4 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ việc sử dụng DTT ........................ 22 Bảng 4.5 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA thu hồi từ 3 mức CTAB ................................ 23 Bảng 4.6 Kết quả PCR tƣơng ứng với nồng độ BSA đƣợc bổ sung ............................. 24 x DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ TRANG Hình 2.1 Chu kỳ đầu tiên trong PCR .............................................................................. 7 Hình 2.2 Chu kỳ thứ hai trong phản ứng PCR .............................................................. 8 Hình 4.1 Kết quả PCR từ mẫu có 10 mM Ca2+ ............................................................. 19 Hình 4.2 Kết quả PCR từ ngọn lông và gốc lông bò ..................................................... 20 Hình 4.3 Kết quả PCR với DNA từ gốc lông heo và gốc lông bò ................................ 21 Hình 4.4 Kết quả PCR từ mẫu có DTT và không DTT ................................................. 22 Hình 4.6 Kết quả PCR từ mẫu sử dụng và không sử dụng BSA ................................... 24 Biểu đồ 4.1 Tỷ số OD và hàm lƣợng DNA ly trích tƣơng ứng với các nồng độ Ca2+ .. 18 Biểu đồ 4.2 Tỷ số OD của DNA ly trích từ gốc lông và ngọn lông bò ......................... 19 Biểu đồ 4.3 Tỷ số OD của DNA ly trích từ mẫu gốc lông heo và lông bò ................... 21 Biểu đồ 4.4 So sánh DNA ly trích bởi dung dịch đệm có DTT và không có DTT ....... 22 Biểu đồ 4.5 Tỷ số OD của DNA ly trích bởi dung dịch đệm có và không có CTAB ... 23 1 PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Công nghệ sinh học đang ngày càng thể hiện tầm quan trọng trong rất nhiều ngành khoa học nhƣ chăn nuôi, thực vật, thực phẩm...Áp dụng kỹ thuật gen trong nghiên cứu di truyền đã làm tăng cấp độ và hiệu quả của việc cải thiện cây trồng và chăn nuôi. Một điều kiện tiên quyết để đạt ƣu điểm của những phƣơng pháp này là khả năng tách chiết và tinh sạch DNA đạt yêu cầu số lƣợng và giữ nguyên cấu trúc. Sự phát triển của những phƣơng pháp tinh sạch DNA hiệu quả từ nhiều nguồn mẫu khác nhau là mối quan tâm đối với những phòng thí nghiệm mô hình mẫu. Công việc này đang là thử thách đối với những vật liệu chứa một hàm lƣợng lớn polysaccharide hay những chất thứ cấp nhƣ polyphenol, terpene, resin… Tách chiết DNA từ máu, thịt rõ ràng không phức tạp và dễ thành công. Các mẫu này thƣờng đƣợc dùng cho hầu hết các nghiên cứu. Tuy nhiên, các nguồn mẫu khác nhƣ lông, da, xƣơng… cũng cần đƣợc quan tâm. Loại mẫu này thƣờng chứa lƣợng DNA ít, nhiều protein và chất hữu cơ nên việc ly trích trở nên khó khăn khi muốn tinh sạch và có đủ lƣợng DNA cho bất kỳ phân tích nào. Lông có thể là nguồn DNA cho những nghiên cứu không ảnh hƣởng đến cơ thể sống. Tuy nhiên, lông chứa một lƣợng rất nhỏ DNA, do đó tìm ra một phƣơng pháp để tách chiết DNA từ lông là hết sức quan trọng. Vấn đề quan tâm nhất hiện nay đối với mẫu lông là lƣợng nhỏ DNA, chứa nhiều protein ức chế và quy trình tách chiết không đặc hiệu. Do đó hoàn thiện quy trình tách chiết DNA từ lông cho những thí nghiệm xa hơn là cần thiết. Từ việc thử nghiệm những quy trình ly trích, một bộ kit có thể đƣợc tạo sẽ giúp việc tách chiết đƣợc thực hiện nhanh, và có thể đƣợc thƣơng mại hóa vì vấn đề này vẫn còn đang bỏ ngỏ. 1.2. Mục tiêu và yêu cầu 1.2.1. Mục tiêu Đánh giá ảnh hƣởng của một số hóa chất trong quy trình tách chiết DNA từ lông, trên cơ sở hoàn thiện quy trình ly trích và tạo bộ kit ly trích lông sau này. 2 1.2.2. Yêu cầu - Thay đổi quy trình tách chiết DNA từ lông heo, bò bằng cách bổ sung canxi, DTT, CTAB trong dung dịch đệm ly trích, và bổ sung BSA trong hỗn hợp PCR. - Kiểm tra hiệu quả quy trình tách chiết thông qua đo OD và phản ứng PCR với gen mục tiêu là giới tính (trên bò) và halothane (trên heo). 3 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Cấu trúc tổng quát của lông Theo Hairhandout (2005), lông có 3 vùng hình thái học: lớp cutin, vỏ, lõi. - Lớp cutin: là 1 lớp mờ bên ngoài của thân lông chứa những vảy bao lấy thân. Có 3 cấu trúc vảy cơ bản tạo lên lớp cutin – vòng hoa, cánh hoa, mái ngói. - Lớp vỏ: là thân chính của lông chứa những tế bào thon dài và mảnh. Nó chứa cortical fusi, hạt sắc tố, và / hoặc những cấu trúc có hình dạng từ bầu dục đến hình tròn lớn gọi là thân hình trứng. - Lõi: là trung tâm của những tế bào có thể hiện diện trong lông. Thành phần cơ bản của lông là keratin (1 loại protein), melanin (1 loại sắc tố), và 1 lƣợng rất nhỏ nguyên tố kim loại. 2.2. Cấu trúc của lông bò và lông heo Theo Wagner và ctv (1996), lông không chỉ bao gồm thân lông chết nhìn thấy bên ngoài da mà còn bao gồm phần gốc đang phát triển trong da. Phần gốc nằm trong da đƣợc bao quanh bởi bao gốc lông, để lộ ra cấu trúc phức tạp và khác nhau. Cấu trúc này thƣờng đƣợc tìm thấy trong tất cả động vật có vú. Tại phần đế của lông có hình dạng nhƣ chuông (hành lông), bao quanh là một nhú da nhỏ, hình dạng này phụ thuộc vào lớp biểu bì hình ngói của da. Chức năng của hành lông là dinh dƣỡng cho những tế bào đang phát triển của lông. Những tế bào gần nhú lông không khác nhau và là vùng tái sinh của lông, bao gồm cả bao gốc. Phụ thuộc vào vị trí của chúng trong hành lông, những tế bào đƣợc tạo ra sau trong vùng này khác nhau về những loại tế bào mà nó sẽ tạo ra lông và mô xung quanh nó. Mô này chứa năm lớp đồng tâm khác nhau, ba lớp trong cùng hợp thành bao gốc trong cùng (inner root sheath – IRS). Tiếp xúc trực tiếp với lớp cutin của lông là cutin của IRS (IRS – cutin), tiếp theo là hai lớp, lớp Huxley và lớp Henle. Lớp kèm (companion layer – CL) là lớp tiếp theo bên trong bao gốc. Lớp này cũng đƣợc gọi là lớp trong cùng của bao gốc bên ngoài (outer root sheath – ORS) hay bao gốc giữa. Lớp ngoài cùng của bao gốc là ORS, bao quanh bởi những lớp khác nhau và lông. Lớp ORS 4 không chỉ nằm trong phần nhú da của gốc lông, mà còn trong phần thân lông, thay đổi bên trong lớp biểu bì tại điểm kết thúc của nó. Những lớp của bao gốc IRS chứa ba lớp tế bào khác nhau. Lớp trong cùng của nó là cutin (IRS – cutin), những tế bào của nó là những tế bào nhỏ nhất của lông với bề dày dƣới 1 mm. Chúng có hình dạng và cách xếp lớp giống vảy cá. Lớp cutin đƣợc theo sau bởi hai lớp tế bào đơn từ những tế bào có cấu trúc tƣơng tự: lớp Huxley bên trong và Henle bên ngoài. Những lớp này chứa những tế bào có hình dạng thon dài và hình ngọn giáo bao quanh bề mặt nhẵn của lớp cutin – IRS. Ba lớp IRS có sự keratin hóa xảy ra tại những thời điểm khác nhau. Tiến trình này chịu trách nhiệm cho cấu trúc cứng giống da của ba lớp tế bào này. Ý nghĩa sinh lý học của tiến trình này chƣa đƣợc biết. Lớp đầu tiên bị keratin hóa là lớp Henle. Lớp tiếp theo là lớp cutin – IRS. Lớp Huxley giữa hai lớp này vẫn là cấu trúc sợi nhỏ của mô ngắn, không bị keratin hóa. Lớp CL bao quanh IRS. Nó có thể đƣợc thấy trong phần chiều dài gần lớp Henle nhƣ là một lớp sáng hơn, mỏng hơn. Nó gồm một lớp những tế bào hình chữ nhật, dát mỏng. ORS là lớp ngoài cùng của gốc lông. Nó tiếp xúc trực tiếp với CL và xung quanh chứa những tế bào hình khối. 2.3. Cấu trúc của melanin Trong nghiên cứu của Rees (2003) tế bào melanin tạo những hạt melanin chứa một enzyme gọi là tyrosinase. Enzyme này chứa Cu, tổng hợp sự chuyển đổi oxy hóa của DOPA (tyrosine) thành một sắc tố gọi là melanin. Tế bào melanin có nguồn gốc từ những tế bào thần kinh di chuyển vào biểu bì trong tháng thứ 3 đầu tiên. Việc tạo melanin đi cùng với việc tạo 1 vài chất trung gian độc và xảy ra chủ yếu trong hạt giống nhƣ lysosome (hạt melanin). Hạt melanin đƣợc tiết ra trong những tế bào keratin qua cơ chế đƣợc mô tả khá ít. Cơ chế hóa học của melanin là phức tạp và chƣa đƣợc hiểu nhiều do những đặc điểm của nó là 1 phức hợp của nhiều polymer, những chất trung gian tự oxy hoá nhanh chóng và không ổn định, phƣơng pháp hòa tan melanin làm thay đổi cấu trúc cơ bản của nó. Sự tạo màu lông và màu biểu bì có cơ chế tƣơng tự nhau. Trong nang lông, sắc tố đƣợc chuyển từ tế bào melanin san