Tạo dòng và biểu hiện gen chitinase từ nấm trichoderma

Cây trồng nông nghiệp bao gồm các loại rau và ngũ cốc như: rau ăn lá, ăn quả, củ, đậu đỗ, lúa, ngô, khoai, sắn giữ vai trò quan trọng trong bữa ăn hàng ngày của từng gia đình và là nguồn hàng xuất khẩu có giá trị. Tuy nhiên, đây là loại cây trồng có những đặc điểm hình thái và sinh trưởng thuận lợi cho các loại sâu và nấm bệnh sống ký sinh. Sức tàn phá của các loại sâu và nấm bệnh này nhiều khi rất lớn, gây tổn thất nghiêm trọng về năng suất và chất lượng của cây trồng [15]. Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới, vì thế thích hợp cho nhiều loại sâu và nấm bệnh gây hại cây trồng nông nghiệp phát triển. Các loại nấm bệnh gây hại thường gặp ở cây trồng như Rhizoctonia gây bệnh thối gốc (lở cổ rễ), Fusarium gây bệnh héo rũ, thối khô, Alternaria gây bệnh đốm vòng Để hạn chế tác hại của nấm bệnh, một trong những phương pháp có hiệu quả là sử dụng hóa chất và thuốc trừ sâu bệnh. Tuy nhiên, việc làm này gây tác hại lâu dài với môi trường và sức khoẻ của cộng đồng [10]. Hiện nay, công nghệ sinh học ngày càng phát triển đã mở ra một hướng đi mới trong việc ngăn ngừa tác hại của sâu và bệnh hại cây trồng nhưng vẫn bảo vệ được môi trường như tạo ra các cơ thể tái tổ hợp có khả năng kháng lại các loại sâu bệnh [74], [75].

pdf59 trang | Chia sẻ: lvbuiluyen | Lượt xem: 3576 | Lượt tải: 5download
Bạn đang xem trước 20 trang tài liệu Tạo dòng và biểu hiện gen chitinase từ nấm trichoderma, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC HUẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN BẢO HƯNG TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN CHITINASE TỪ NẤM TRICHODERMA CHUYÊN NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ SỐ: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC 2 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS. TS NGUYỄN HOÀNG LỘC Huế, 2010 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Người cam kết Nguyễn Bảo Hưng 3 Lời cảm ơn Trong suốt quá trình làm việc, ngoài sự nổ lực của bản thân, em đã nhận được sự giúp đở nhiệt tình của quý thầy cô, anh chị kỹ thuật viên ở Viện Tài nguyên Môi trường và Công Nghệ Sinh Học, em xin chân thành cảm ơn. Đặc biệt, em xin bày tỏ lời biết ơn chân thành nhất đến thầy PGS.TS Nguyễn Hoàng Lộc, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, động viên, giúp em vững tin trên con đường mình đang đi. Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân của mình đã khích lệ, động viên tinh thần cho em trong suốt thời gian học tập và làm việc. Trong quá trình làm việc, bước đầu làm quen với chuyên môn có thể mắc nhiều sai sót, em sẽ cố gắng hoàn thiện mình để ngày một trưởng thành hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Huế, tháng 11 năm 2010 Nguyễn Bảo Hưng 4 MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục Lục Danh mục các kí hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị Mở đầu Chương 1. Tổng quan 1.1. Tổng quan về chitinase 1.1.1. Giới thiệu chitinase 1.1.2. Tình hình nghiên cứu chitinase 1.1.3. Khả năng kiểm soát nấm bệnh và côn trùng gây hại thực vật của chitinase. 1.2. Tổng quan về nấm Trichoderma 1.2.1 Tình hình nghiên cứu nấm Trichoderma 1.2.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Trichoderma 1.2.3. Khả năng kiểm soát các tác nhân gây bệnh cây trồng và cơ chế tác động của nấm đối kháng Trichoderma 1.2.3.1. Hiệu quả đối kháng của nấm Trichoderma đối với nấm gây bệnh cây trồng 5 1.2.3.2. Cơ chế tác động của nấm Trichoderma lên các tác nhân gây bệnh cây trồng 1.3. Tổng quan về công nghệ DNA tái tổ hợp 1.3.1. Giới thiệu chung 1.3.2. Ứng dụng công nghệ DNA tái tổ hợp trong sản xuất enzyme 1.4. Tình hình nghiên cứu về chitinase tái tổ hợp 1.5. Tạo dòng và biểu hiện gene trong E.coli 1.6. Tạo dòng và biểu hiện gen trong nấm men Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1.Xác định chủng Trichoderma sinh chitinase ngoại bào mạnh 2.2.2. Xác định hoạt tính chitinase 2.2.3. Tách chiết chitinase 2.2.4. Xác định khối lượng phân tử của chitinase 2.2.5. Định danh chủng nấm Trichoderma 2.2.5.1. Tách chiết genomic DNA 2.2.5.2. Tạo dòng trình tự ITS 2.2.5.3. Tạo dòng và biểu hiện gen chitinase 2.2.6. Các phương pháp thống kê sinh học Chương 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Tuyển chọn các chủng nấm Trichoderma tiết chitinase ngoại bào mạnh 6 3.2. Xác định hoạt độ chitinase bằng phương pháp quang phổ 3.3. Xác định khối lượng phân tử của enzyme chtinase 3.4. Định danh chủng nấm 3.5. Tạo dòng và biểu hiện gen chitinase Chương 4. Kết luận TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 7 BẢNG CHỮ VIẾT TẮT CS: cộng sự IPTG: Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside BMV: brome mossaic virus TMV: Tobacco mosaic virus RT-PCR: reverse transcription-polymerase chain reaction PCR: Polymerase Chain Reaction 8 DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH Hình 3.1. Vòng phân giải chitin của các chủng nấmTrichoderma spp. Hình 3.2. Điện di SDS và điện di cơ chất Hình 3.3. Phản ứng PCR với cặp mồi ITS1 và ITS4 Hình 3.4. So sánh trình tự ITS của chủng SH16 với chủng ZJPH0810 Hình 3.5. Phản ứng PCR với cặp mồi C42R và C42F Hình 3.6. So sánh trình tự các gen chitinase phân lập được và gen ech42. Dấu * thể hiện sự giống nhau trong trình tự của các gen. Hình 3.7. Vector pYES2/NT A có mang gen chi42-SH16 Hình 3.8. Kiểm tra sự hiện diện của gen chi42-SH16 trong nấm men tái tổ hợp Hình 3.9. Hoạt tính chitinase tái tổ hợp theo thời gian cảm ứng Danh mục bảng Bảng 3.1. Đường kính vòng phân giải chitin của Trichoderma trên môi trường cảm ứng Bảng 3.2.Hoạt độ chitinase của các chủng Trichoderma spp. 9 MỞ ĐẦU Cây trồng nông nghiệp bao gồm các loại rau và ngũ cốc như: rau ăn lá, ăn quả, củ, đậu đỗ, lúa, ngô, khoai, sắn… giữ vai trò quan trọng trong bữa ăn hàng ngày của từng gia đình và là nguồn hàng xuất khẩu có giá trị. Tuy nhiên, đây là loại cây trồng có những đặc điểm hình thái và sinh trưởng thuận lợi cho các loại sâu và nấm bệnh sống ký sinh. Sức tàn phá của các loại sâu và nấm bệnh này nhiều khi rất lớn, gây tổn thất nghiêm trọng về năng suất và chất lượng của cây trồng [15]. Việt Nam là nước có khí hậu nhiệt đới, vì thế thích hợp cho nhiều loại sâu và nấm bệnh gây hại cây trồng nông nghiệp phát triển. Các loại nấm bệnh gây hại thường gặp ở cây trồng như Rhizoctonia gây bệnh thối gốc (lở cổ rễ), Fusarium gây bệnh héo rũ, thối khô, Alternaria gây bệnh đốm vòng… Để hạn chế tác hại của nấm bệnh, một trong những phương pháp có hiệu quả là sử dụng hóa chất và thuốc trừ sâu bệnh. Tuy nhiên, việc làm này gây tác hại lâu dài với môi trường và sức khoẻ của cộng đồng [10]. Hiện nay, công nghệ sinh học ngày càng phát triển đã mở ra một hướng đi mới trong việc ngăn ngừa tác hại của sâu và bệnh hại cây trồng nhưng vẫn bảo vệ được môi trường như tạo ra các cơ thể tái tổ hợp có khả năng kháng lại các loại sâu bệnh [74], [75]. Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là kỹ thuật di truyền hay kỹ thuật gen) là một bộ phận quan trọng và là công nghệ then chốt của lĩnh vực công nghệ sinh học. Công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử và hiện nay đang đóng vai trò cách mạng trong sự phát triển của sinh học. Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép phân lập và khuếch đại một gen đơn từ genome của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể sinh vật khác. Cải thiện hoạt tính và khả năng tổng hợp enzyme bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA hiện đang được ứng dụng rộng rãi [69], trong đó có tạo dòng và sản xuất chitinase [43], [64], [56]. 10 Chitinase là một enzyme glycosyl hydrolase xúc tác thủy phân chitin, có trong nhiều loại cơ thể sống khác nhau bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật không xương sống, thực vật và động vật có xương sống. Chitinase thực vật là các enzyme xúc tác thủy phân chitin của nấm bệnh. Tuy nhiên, không phải cây trồng nào cũng có khả năng sản xuất chitinase, hoặc hoạt tính chitinase của chúng đủ cao để kháng lại nấm bệnh, vì vậy việc tạo ra một chủng sinh vật có khả năng sản xuất enzyme này với lượng lớn và hoạt tính cao là có ý nghĩa rất lớn [46]. Đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu về tạo dòng và biểu hiện gen chitinase trong Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiea và các loại vi khuẩn khác đã được công bố, như nghiên cứu của Boer và cộng sự (2007) về biểu hiệu gen chit33 và chit42 của Trichoderma harzianum trong E. coli [32], biểu hiện gen chitinase của Serratia marcescens trong các chủng Sinorhizobium fredii USDA191 và S. meliloti RCR2011 (Krishnan và cs 1999), biểu hiện gen chitinase của T. aureoviride trong nấm men S. cerevisiae (Jinzhu và cs 2005)... Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, chúng tôi thực hiện đề tài: “Tạo dòng và biểu hiện gen chitinase từ nấm Trichoderma ” nhằm mục đích sản xuất enzyme này với hiệu suất cao hơn các sinh vật truyền thống, từ đó áp dụng vào sản xuất nông nghiệp phòng trừ nấm bệnh trên một số cây trồng kinh tế như rau, quả hoặc các loại ngũ cốc. 11 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITINASE 1.1.1. Giới thiệu chitinase Chitinase (poly (1,4-N-acetyl-β-glucosaminide) glucanhydrolase) là enzyme thuộc nhóm glycosyl hydrolase thủy phân liên kết 1,4-N-acetyl-β- glucosaminide (β-1,4-GlcNAc) của chitin. Chitinase được tạo ra từ nhiều sinh vật, từ những loài có thành phần cấu trúc là chitin như nấm, côn trùng, giáp xác, đến những loài không có chitin như vi khuẩn, thực vật... Ở những sinh vật chứa chitin, chitinase đóng vai trò chính trong quá trình phát sinh hình thái và phân chia tế bào. Các sinh vật khác tổng hợp chitinase với các mục đích khác nhau. Vi khuẩn tổng hợp chitinase để phân hủy chitin tạo ra nguồn carbon. Ở thực vật và động vật chitinase nằm trong hệ thống chống lại các tác nhân gây bệnh như nấm bằng cách phá vỡ thành tế bào chứa chitin của nấm [46]. Cơ chất của chitinase là chitin và một số dẫn xuất của nó. Chitin là polysaccharide được tạo thành nhờ liên kết β-1,4 của các đơn phân N- acetylglucosamine, một trong những dạng polysaccharide phổ biến trong tự nhiên. Chitin là thành phần chủ yếu trong cấu trúc bộ xương ngoài của các loài côn trùng, vỏ giáp xác và thành tế bào nấm [46]. Chitin có hoạt tính hóa học thấp, màu trắng, cứng và có chứa nitrogen. Chitin không tan trong nước và hầu hết các dung môi hữu cơ, tan trong hexa fluro isopropanol, hexa fluroacetone... Hàm lượng nitrogen của chitin chiếm từ 5-8%, khối lượng phân tử trung bình từ 1,03×106-2,5×106 Da. Trong môi trường base, chitin bị deacetyl tạo thành chitosan (-NHCOCH3→ -NH2) [50]. 12 1.1.2. Tình hình nghiên cứu chitinase Chitinase lần đầu tiên được mô tả bởi Bernad (1911) trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến chitinase và khả năng khuếch tán nhân tố kháng nấm ở cây hoa phong lan [12]. Năm 1929, Karrer và Hofmann đã nghiên cứu đặc tính của enzyme này trong ốc sên [38]. Sau này, những khảo sát của Jeuniaux (1966) đã mở ra những hướng nghiên cứu mới về chitinase [34]. Năm 1991, Henrissat dựa trên sự tương đồng trình tự amino acid ở vùng xúc tác đã phân loại nhóm protein glycosyl hydrolases thành hơn 50 họ trong đó chitinase được chia thành hai họ 18 và 19 (gồm những enzyme thuộc EC 3.2.1.14 và EC 3.2.1.52) [35]. Năm 1993, Henrissat và Bairoch phân loại thêm những enzyme từ các loài Flavobacterium, endo-N-acetylglucosaminidase (EC 3.2.1.96) vào họ 18. Những protein này phân cắt liên kết β 1,4-N-GlcNAc thành các manosyl glycoprotein. Các protein thuộc hai họ 18 và 19 hoàn toàn khác nhau về cơ chế xúc tác, trình tự amino acid cũng như cấu trúc không gian do đó chúng được cho là có nguồn gốc tiến hóa khác nhau. Hai họ này chứa cả endochitinase và exochitinase [36]. Chitinase họ 18 bao gồm những chitinase từ thực vật (Arabidopsis, dưa leo, cây họ đậu, thuốc lá...), nấm (Aphanocladium, Rhizopus, Saccharomyces…), vi khuẩn (Alteromonas, Bacillus, Serratia, Streptomyces...), virus và động vật… Các chitinase họ 18 thủy phân các liên kết GlcNAc-GlcNAc, GlcNAc-GlcN bằng cơ chế giữ nguyên cấu hình anomeric. Hoạt tính của các chitinase họ 18 bị ức chế bởi allosamidin [36]. Ở Việt Nam, gần đây chitinase mới được quan tâm nghiên cứu do những ứng dụng của nó trong việc xử lý môi trường và khả năng ức chế chống lại nấm bệnh hại cây trồng. Một số công trình đã được công bố như: Nghiên cứu 13 chitinase và β-glucanase từ vi nấm Trichoderma spp. và khả năng kiểm soát sinh học đối với một số nấm gây bệnh ở thực vật [9]; Khảo sát hoạt tính các hệ enzyme thủy phân chiết tách từ môi trường nuôi cấy Trichoderma sp. và thử nghiệm ứng dụng chế biến phân hữu cơ vi sinh [13]. Tuy nhiên, nghiên cứu về chitinase vẫn còn là vấn đề mới mẻ tại Việt Nam. 1.1.3. Khả năng kiểm soát nấm bệnh và côn trùng gây hại thực vật của chitinase Đặc tính sinh học của chitinase đã được nhiều nhà khoa học nghiên cứu và ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau. Nhiều công trình trên thế giới cho thấy chitinase có khả năng kiểm soát nấm bệnh và côn trùng gây hại thực vật [44], [51], [60]. Ở thực vật, việc sản xuất chitinase được xác định là một cơ chế bảo vệ cây trồng trước những nhân tố gây bệnh. Đối với các tác nhân gây bệnh như nấm hay côn trùng chứa chitin, phản ứng tự vệ chính của thực vật là tạo ra chitinase. Hầu hết chitinase được tạo ra tại cơ quan bị nhiễm nấm hay côn trùng [25]. Nhiều chitinase sinh ra khi bị nhiễm virus. Từ lá cây thuốc lá bị gây nhiễm virus khảm thuốc lá, Legrand và cs (1987) đã tìm ra 2 chitinase P và Q [44]. Có tới 13 loại chitinase (6 loại chitinase acid và 7 loại chitinase base) được phát hiện khi điện di mô lá cây thuốc lá bị nhiễm TMV và một trong số chúng được tìm thấy từ những mô khỏe mạnh. Nghiên cứu của Metraux và cs (1988) cho thấy dưa chuột bị nhiễm TMV cũng sinh ra chitinase [61]. Ở cây ngô, BMV kích thích tiết ra chitinase có tên là PrmBa2 và PRm3, 4, 5 và 7. Ở mô bị thương, nhiễm vi sinh vật và nhiễm nấm người ta cũng thấy có sự xuất hiện chitinase. Theo nghiên cứu của Hedrick và cs (1988), trong tế bào hạt đậu nuôi cấy huyền phù và trong đoạn trụ dưới mầm, chitinase được tổng 14 hợp sau khi được gây nhiễm với nấm bệnh [20]. Khi bị kích thích 10 lần trong 5 phút gen chitinase phiên mã rất nhanh chóng. Ở cây đậu Hà Lan sau khi bóc sạch vỏ hạt bị nhiễm nấm, người ta đã thu được 2 loại chitinase. Hai loại chitinase này tương ứng với những enzyme mà Bernasconi và cs (1987) tìm thấy trong Parthenocissus bởi [51]. Nhiều nghiên cứu chứng minh rằng chitinase có khả năng phân hủy thành tế bào sợi nấm, ngăn cản sự nảy mầm và phát triển của sợi nấm trong điều kiện phòng thí nghiệm. Nấm Trichoderma tiết ra ngoại bào enzyme chitinase tấn công trực tiếp nhiều loài nấm gây bệnh như Rhizotonia solani, Fusarium solani [59]. Hai enzyme CHIT42 và CHIT33 từ nấm T. harzianum là yếu tố cơ bản trong quá trình đối kháng với các loại nấm khác. Hệ thống gen mã hóa cho chitinase từ các loài Trichoderma đã được giải mã, tạo dòng và chuyển vào cây trồng [60]. Theo Jollès và Muzzarelli (1999), các loài nấm mốc như Trichoderma, Gliocladium... cho hàm lượng chitinase cao. Nấm Trichoderma khi ký sinh trên nấm gây bệnh sẽ tiết ra hệ enzyme phân hủy chitin của thành tế bào nấm gây bệnh bao gồm 6 enzyme: 2 enzyme β-1,4-N-acetylglucosaminidase và 4 enzym endochitinase. Robert và Selitrennikoff (1988) cũng đã nghiên cứu hoạt tính kháng nấm của chitinase thực vật và chitinase vi khuẩn, các tác giả cho rằng chitinase phân lập từ hạt cây lúa mì, lúa mạch và ngô có hoạt tính phân cắt nội mạch phân tử cơ chất và ức chế sự kéo dài sợi nấm. Trái lại, chitinase phân lập từ nấm men Saccharomyces marcescens, S. griseus và vi khuẩn Pseudomonas stutzeri có hoạt tính phân cắt cơ chất từ đầu không khử, không ảnh hưởng đến sự phát triển của sợi nấm Tetranichus reesei và Phycomyces blackesleeanus [59]. Tuy nhiên, theo Ordentlich và cs (1988), khi có sự hiện diện của S. marcescens, bệnh do nấm Sclerotium rolfsii trên hạt đậu phát triển chậm hơn. Shapira (1991) đã tạo dòng gen chitinase từ S. 15 marcescens và nhận thấy trong điều kiện nhà kính chitinase tạo ra có tác dụng kìm hãm sự phát triển của bệnh do nấm S. rolfsii gây ra trên cây đậu và nấm R. solani trên cây bông. 1.2. TỔNG QUAN VỀ NẤM TRICHODERMA 1.2.1. Tình hình nghiên cứu nấm Trichoderma Khái niệm sử dụng nấm Trichoderma đối với nấm gây bệnh hại cây trồng có từ những năm 1930, người đầu tiên đề xuất vấn đề này là Weinding (Seiketov, 1982). Tác giả này đã đề nghị dùng nấm Trichoderma để trừ nấm Rhizoctonia gây bệnh thối cây con mới mọc ở cam quýt. Weinding đã ghi nhận rằng xử lý đất bằng nấm Trichoderma có thể bảo vệ được cây con mới mọc từ hạt không bị bệnh. Từ đó, các nghiên cứu về nấm Trichoderma nhằm sử dụng chúng để trừ bệnh hại cây trồng đã được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới. Cho đến nay, có khoảng 30 nước nghiên cứu sử dụng nấm Trichoderma để trừ bệnh hại cây trồng như Nga, Mỹ, Anh, Pháp, Đức, Hungary, Ấn Độ, Thái Lan, Philippines, Malaysia [18]. Nhiều nước Châu Âu đã nghiên cứu sản xuất và sử dụng nấm Trichoderma để phòng chống hơn 150 loài bệnh hại trên 40 loại cây trồng khác nhau [2]. Ở Việt Nam, nhóm nấm này đã được quan tâm nghiên cứu đầu tiên trong việc sử dụng các vi sinh vật đối kháng với sinh vật gây bệnh trên cây trồng. Công việc này được bắt đầu từ năm 1987 tại Bộ môn Bệnh cây, Viện Bảo vệ thực vật, sau đó các nghiên cứu này cũng được tiến hành tại Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội [2]. Từ năm 1990, nguồn nấm Trichoderma bản địa đã được phân lập để nghiên cứu cơ chế đối kháng, điều kiện ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của chúng. Những chủng nấm Trichoderma bản địa có hiệu quả ức chế khá cao (67,8-85,5 %) đối với các nấm gây bệnh như Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Boytrytis cinerea, Aspergillus niger, Fusarium sp. 16 Nấm Trichoderma cho hiệu quả ức chế nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh héo rũ gốc mốc trắng ở lạc và nấm Rhizoctonia solani gây bệnh khô vằn trên ngô tương ứng đạt hơn 90% và 42,2-45,3% (thí nghiệm ô nhỏ). Trong vụ đông, nấm Trichoderma làm giảm 51,3-59,8 % cây ngô bị khô vằn (thí nghiệm ô ruộng) [2]. Hiện nay, việc phân loại nấm Trichoderma vẫn chưa được thống nhất. Theo Esposito và Silva (1998), Trichoderma thuộc lớp Ascomycetes, họ Hypocreaceae và gồm 5 nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum, Satunisporum, Pachybarium và Hypocreanum. Theo Samuels (2004), nấm Trichoderma thuộc lớp Euascomycetes, bộ Hypocreales, họ Hypocreaceae. Theo Agrios (2001) thì nấm Trichoderma thuộc ngành phụ 4 Deuteromycota, lớp Hyphomycotes, bộ Hyphales (Moniliales) [14]. Cho đến nay có ít nhất 33 loài Trichoderma đã được tìm thấy. 1.2.2. Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát triển của nấm Trichoderma Trichoderma là một loại nấm đất, chúng phát triển tốt trên các loại đất giàu dinh dưỡng hoặc trên tàn dư thực vật. Do đó, Trichoderma có khả năng sử dụng hỗn hợp carbon và nitrogen làm nguồn dinh dưỡng. Nguồn carbon và năng lượng Trichoderma sử dụng được là đường đơn và đường đa, cùng với hỗn hợp polysaccharide, amino acid… Đặc biệt acid béo, methanol methylamine và NH3 là nguồn đạm bắt buộc phải có trong môi trường nuôi cấy Trichoderma. Muối, các nguồn sulfur và các hỗn hợp vitamin cũng có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh trưởng của Trichoderma. Tuy nhiên, muối sodium chloride làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của một số loài Trichoderma. Do vậy, trong môi trường nhân sinh khối nấm Trichoderma không được có mặt của loại muối này [9]. Hầu hết các loài Trichoderma phát triển mạnh ở nhiệt độ 24-280C, một số 17 loài phát triển tốt ở 350C, thậm chí ở 400C [11]. Theo Nguyễn Đăng Diệp và cộng sự (2004), nhiệt độ ảnh hưởng đến lên men sinh khối của Trichoderma, nhiệt độ thích hợp là 28-340C, tối ưu là 30- 32 0C. pH thích hợp để nấm Trichoderma phát triển là 5-6, khi pH > 6 sinh trưởng của nấm sẽ yếu dần, pH < 4 sinh trưởng của nấm rất yếu [9]. 1.2.3. Khả năng kiểm soát các tác nhân gây bệnh cây trồng và cơ chế tác động của nấm đối kháng Trichoderma spp. 1.2.3.1. Hiệu quả đối kháng của nấm Trichoderma spp. đối với nấm gây bệnh cây trồng Nhóm nấm Trichoderma là một trong những nhóm nấm có khả năng đối kháng với các vi sinh vật khác thông qua việc tiết ra các chất kháng sinh, men rượu, các chất có hoạt tính sinh học cao tạo khả năng ức chế các nấm hại phát sinh từ đất như Sclerotium, Phytophthora, Fusarium, Pythium, Rhizoctonia gây bệnh trên các loại cây họ đậu, cây ăn trái, cây hòa thảo, cây công nghiệp và cây hoa cảnh [2]. Với nguồn tài liệu chưa đầy đủ, Trần Thị Thuần (1996) đã thống kê được khoảng 150 loài vi sinh vật (chủ yếu là nấm) gây bệnh trên gần 40 loại cây trồng đã được nghiên cứu phòng trừ bằng nấm Trichoderma. Các nghiên cứu này được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm, nhà kính, nhà lưới và ngoài đồng ruộng [13]. Nhiều nghiên cứu trên đồng ruộng đã cho thấy hiệu quả trừ bệnh của nấm Trichoderma. Ở Nam Mỹ, nấm T. harzianum có hiệu quả cao trong phòng trừ các loài nấm Pythium spp., R. solani gây bệnh chết héo đậu đỗ và củ cải (Chet và cs, 1981). Hiệu quả ức chế bệnh do R. solani gây trên khoai tây của nấm T. harziamu