Thảo luận Quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng, ưu nhược điểm

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THẢO LUẬN NHÓM ĐỀ BÀI: QUY TRÌNH SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG, ƯU NHƯỢC ĐIỂM. Môn học: Công nghệ protein GiảngViên: TS. Nguyễn Văn Duy 1 NỘI DUNG 1.Những khái niệm liên quan 2.Quy trình sản xuất sản xuất kháng thể đơn dòng ưu, nhược điểm của sản xuất kháng thể đơn dòng 3. Ứng dụng của sản xuất kháng thể đơn dòng 2 1. Những khái niệm liên quan * Kháng nguyên: Kháng nguyên là những phân tử (protein, polysaccharide…) kích thích đáp ứng miễn dịch cơ thể, đặc biệt để sản xuất kháng thể. 3 1. Những khái niệm liên quan * Kháng thể: Kháng thể là các phân tử immunoglobulin (có bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho B cũng như các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc virus. Mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện một epitope kháng nguyên duy nhất. 4 1. Những khái niệm liên quan 5 1. Những khái niệm liên quan • Phân tử kháng thể cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide. Một phần cấu trúc của các chuỗi thì cố định. • Phần đầu của hai "cánh tay" chữ Y thì rất khác nhau giữa các kháng thể khác nhau tạo nên các vị trí kết hợp kháng nguyên . • Vùng biến đổi với có các CDR quyết định khả năng kháng thể liên kết với kháng nguyên. 6 1. Những khái niệm liên quan 7 1. Những khái niệm liên quan * Vai trò của kháng thể: Trong một đáp ứng miễn dịch, kháng thể có 3 chức năng chính: gắn với kháng nguyên, kích hoạt hệ thống bổ thể và huy động các tế bào miễn dịch. 8 1. Những khái niệm liên quan * Ái lực giữa kháng nguyên và kháng thể: Trên kháng nguyên có một hoặc nhiều vị trí gắn với một kháng thể gọi là epitope. Mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện một epitope kháng nguyên duy nhất. Liên kết giữa kháng thể và kháng nguyên, tương tự như giữa enzyme và cơ chất. 9 1. Những khái niệm liên quan * Có hai loại kháng thể:  Kháng thể đơn dòng liên kết với một epitope đặc hiệu.  Kháng thể đa dòng là một tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitope khác nhau trên cùng một kháng nguyên. 10 1. Những khái niệm liên quan * Kháng thể đa dòng: Các kháng thể đa dòng là một tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitope khác nhau trên một kháng nguyên cho trước . Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể tổng hợp nhiều kháng thể tương ứng với các epitope của cùng một kháng nguyên: đáp ứng như vậy gọi là đa dòng. 11 2. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng 12 2. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng • Lịch sử : Năm 1975, hai nhà miễn nhiễm học César Milstein - người Anh gốc Argentina và Georges Köhle - người Đức đã khám phá một kỹ thuật tạo ra một số lượng lớn các tế bào bạch huyết, có khả năng sản xuất một dạng kháng thể duy nhất. Các kháng thể này chỉ đáp ứng với một loại kháng nguyên chuyên biệt, chẳng hạn với chỉ một độc tố hay một siêu vi, vì thế chúng được đặt tên là kháng thể đơn dòng (Monoclonal Antibodies). 13 2. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng * Khái niệm kháng thể đơn dòng: • Các kháng thể chỉ đáp ứng với một loại kháng nguyên chuyên biệt (chẳng hạn với chỉ một độc tố hay một siêu vi) • Chỉ nhận biết một epitope trên một kháng nguyên cho sẵn. • Tất cả các kháng thể đơn dòng cùng một dòng thì giống hệt nhau và được sản xuất bởi cùng một dòng tương bào (biệt hóa từ lympho B. • Kháng thể đơn dòng được sử dụng rộng rãi trong các phân tích sinh học và chữa bệnh. Ngày nay, các kháng thể đơn dòng đã được ứng dụng nhiều trong chẩn đoán và điều trị. 14 2. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng • Để sản xuất kháng thể đơn dòng, các tế bào bạch cầu lymphocyte được kích thích đáp ứng miễn dịch để sản sinh kháng thể đặc hiệu. Các dòng tế bào lymphocyte sản sinh kháng thể được lai với các tế bào ung thư ( có khả năng phân chia vĩnh viễn tạo nên các dòng tế bào lai gọi là hybridoma). Dòng tế bào lai hybridoma có đặc điểm đặc biệt đó là có khả năng tăng sinh vĩnh viễn ( bất tử) và sản sinh cùng loại kháng thể ( kháng thể đơn dòng) trong môi trường nuôi cấy. 15 2. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng * Các bước tạo kháng thể đơn dòng: - Tiêm các tế bào khối u vào chuột để kích thích các tế bào lympho B tạo ra các kháng thể. - Hòa lẫn các tế bào myeloma bất hoại được chọn với các lympho B . - Sự kết hợp sẽ tạo ra tế bào lai (hybridomas) có khả năng sinh sản vô hạn (nhận từ tế bào myeloma) và tiết ra kháng thể đặc hiệu (nhận từ tế bào lympho B). - Các tế bào lai sản xuất kháng thể được chọn lọc và nhân bản để đưa 16 vào quá trình tạo thành kháng thể đơn dòng 2. Công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng 17 2.1 Ưu điểm của sản xuất kháng thể đơn dòng - Không cần một lượng lớn động vật mà vẫn thu được lượng kháng thể nhiều bằng nuôi cấy invitro. - Kháng thể thu được tinh khiết, có tính đặc hiệu cao. Ví dụ: Thí nghiệm nuôi liên hiệp tế bào myeloma và lympho bào trong ổ phúc mạc của cơ thể có sự phù hợp tổ chức các tế bào lai, có thể thu được từ 5 đến 20 mg kháng thể trong 1 ml dịch, trong khi đó nếu bằng phương pháp gây miễn dịch khác thì huyết thanh thu được không tinh khiết, lẫn tạp, nhiều kháng thể khác và hàm lượng không cao. 18 2.1 Ưu điểm của sản xuất kháng thể đơn dòng - Cho phép phát hiện được nhiều kháng nguyên chưa biết trên bề mặt tế bào. - Việc sử dụng kháng thể đơn dòng giảm được hiện tượng dương tính giả trong các phản ứng miễn dịch cực nhạy như ELISA, RIA vì kháng thể dùng trong phản ứng này có tính đặc hiệu cao và tinh khiết. - Có thể ứng dụng trong việc sử dụng chất đồng vị phóng xạ để sản xuất kháng thể và nghiên cứu về y sinh học. - Trong tương lai khi thực hiện được liên hợp lai myeloma người với lympho người, thì có thể sản xuất kháng thể đơn dòng của người, thuận lợi cho điều trị bệnh truyền nhiễm bằng huyết thanh miễn dịch. 19 2.2. Nhược điểm của sản xuất kháng thể đơn dòng - Hệ thống miễn dịch của con người nhận diện KTĐD (được sản xuất từ tế bào B của chuột) như là protein lạ nên tạo ra các kháng thể chống lại chúng, thậm chí trung hòa chúng, làm hiệu quả của chúng suy giảm đáng kể. Hơn nữa, một số KTĐD khi tiếp cận và bám được vào các kháng nguyên, chúng không trung hòa hoặc phá hủy được các kháng nguyên gây bệnh. - Thành phần kết hợp với KTĐD được đưa vào cơ thể bệnh nhân có thể bị tách ra và đi khắp nơi, gây nên các phản ứng phụ và hậu quả khó lường. Ngoài ra, với một số khối u được bao bọc chắc chắn bởi các lớp mạch máu nuôi dưỡng, KTĐD rất khó thâm nhập vào bên trong để phá hủy. - Giá thành đắt 20 2.3 Cách khắc phục Để khắc phục những hạn chế trên, các nhà khoa học đã nghiên cứu đưa tế bào lympho B của người vào cơ thể chuột, các tế bào B này sẽ tạo ra các KTĐD mà hệ thống miễn dịch của bệnh nhân sẽ chấp nhận như là của mình. Các nghiên cứu mới đây còn dùng công nghệ gene và thay thế chuột bằng các vi khuẩn để tạo các KTĐD nhỏ hơn, hoạt động hữu hiệu hơn, gắn chặt các vật mang hơn, thâm nhập các khối u dễ dàng hơn và đặc biệt là giá thành rẻ hơn. 21 3. Ứng dụng của kháng thể đơn dòng • Có thể được dùng để chẩn đoán và chữa trị các bệnh nhiễm trùng, dùng để thử nghiệm miễn dịch để phát hiện các kháng nguyên với nồng độ thấp. 22 Chữa trị ung thư máu bằng kháng thể đơn dòng Alemtuzumab • - Bệnh ung thư máu CLL là bệnh lý ác tính của dòng limpho B tăng lên quá mức bình thường về số lượng (chỉ dưới 2% là của dòng limpho T) • - Khi bị bệnh đa số các tế bào máu sẽ phát triển thành các tế bào bạch cầu limphocytes không bình thường và không thể đảm nhiệm chức năng của một bạch cầu chống lại bệnh tật 23 Chữa trị ung thư máu bằng kháng thể đơn dòng Alemtuzumab - Alemtuzumab là một kháng thể đơn dòng tái tổ hợp dạng IgG1 đã được “người hóa” - Là một kháng thể của người có với các phần CDR (vùng xác định bổ trợ) có nguồn gốc từ chuột quyết định khả năng kháng thể lk với kháng nguyên - Có 95% là từ người và 5% là từ chuột nên giảm bớt được sự đáp ứng miễn dịch của người. 24 Quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng Alametuzumab • Phân lập cDNA của chuỗi L và H từ dòng TB u tủy- lá lách chuột. • Các CDR của cDNA khuếch đại bằng PCR. • Ghép CDR chuột vào khung kháng thể người. • CDR với vùng thay đổi được nhân dòng biểu hiện . • Đưa vào tế bào đích (E.coli hoặc TB ĐV có vú). • Kháng thể Alemtuzumab được “người hoá”. 25 Tác động của Alemtuzumab tới các tế bào ung thư limpho B trong điều trị bệnh CLL • Kháng thể Alemtuzumab khi được đưa vào trong cơ thể người sẽ tìm và liên kết đặc hiệu với CD52 (một glycoprotein trên bề mặt các tế bào limpho trưởng thành. 26 Tác động của Alemtuzumab tới các tế bào ung thư limpho B trong điều trị bệnh CLL • Alemtuzumab đã lk với CD52 => gây ra các phản ứng đáp ứng miễn dịch trong cơ thể người bệnh tiêu diệt các tế bào ung thư có CD52 trên bề mặt. • Tủy xương trước (trên) và sau (dưới) khi điều tri bằng kháng thể Alemtuzumab => mật độ tế bào ung thư giảm. 27 Tác dụng phụ của Alametuzumab - Sốt, ra mồ hôi, mất cảm giác ngon miệng và thèm ăn, tiêu chảy, đau đầu, thở gấp. - Có thể làm giảm số lượng tế bào máu làm tăng nguy cơ mắc các bệnh truyền nhiễm, gây ra sự mệt mỏi và tình trạng chảy máu trong hay máu khó đông. - Có thể gây viêm phổi, các cơn đau tim, các vấn đề về gan, thận, và các vấn đề về tiêu hóa. 28 Các ứng dụng khác - Thử thai: Khi một người nữ mang thai, hormon HCG (human chorionic gonadotropin) được bài tiết qua nước tiểu. Cho dung dịch KTĐD liên kết với một enzym, sẽ biến đổi màu khi có sự hiện diện của HCG, vào ống nghiệm đựng nước tiểu. Nếu nước tiểu đổi màu thì có thai và ngược lại. Que thử thai ứng dụng công nghệ này đã giúp chị em phụ nữ tự xác định mình có thai hay không rất nhanh chóng và tiện lợi. - Chẩn đoán bệnh Aids: Cũng với nguyên tắc trên, KTĐD giúp các phòng thí nghiệm phát hiện sự hiện diện của HIV (human immunodeficiency virus) trong máu các bệnh nhân mắc bệnh Aids. 29 Các ứng dụng khác - Ghép tạng: KTĐD giúp xác định mô người cho có tương thích với người nhận hay không và ngăn ngừa hệ thống miễn dịch của bệnh nhân thải loại mô ghép. 30 Các ứng dụng khác • Trong bệnh tim mạch: Một loại protein cơ có tên myosin hiện diện với số lượng lớn trong các cơ bắp. Một phần myosin ở cơ tim bị phá hủy sau cơn nhồi máu. Bằng cách tiêm KTĐD đáp ứng với myosin, người ta có thể xác định được số lượng myosin mất đi để đánh giá tình trạng của tim bệnh nhân. • KTĐD cũng được dùng để xác định vị trí cục máu đông trong cơ thể bệnh nhân bằng cách gắn vào sợi huyết (fibrin) phát sinh khi có cục máu đông. Việc này giúp các bác sĩ chẩn đoán và xử lý kịp thời cho người bệnh. 31 3. KẾT LUẬN Những phần trên đã trình bày về kháng thể, kháng thể đa dòng, kháng thể đơn dòng , quy trình sản xuất , ưu nhược điểm của kháng thể đơn dòng. 32 33 Tài liệu tham khảo 1. Bài giảng CNSHĐV, TS. Nguyễn Văn Duy, khoa CNSH & CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. 2. “Công nghệ sinh học trên người và động vật”, (2010), Phan Kim Ngọc, NXB Giáo dục. 3. Giáo trình “Miễn dịch học”,(2011), Lương Thị Hồng Vân, NXB Hà Nội. 4. Bài giảng “ Công nghệ sinh học thú y”, Nguyễn Quang Tuyên, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên. 5. 6. 7. . 34 Thành viên nhóm 5. 1. Mạc Văn Dương 2.Nguyễn Thị Thanh Dung 3. Đỗ Thị Hào 4. Nguyễn Thị Thu Hằng 5. Lý Thị Liễu 6. Mông Thị Hương 35