Thu nhận hợp chất shikonin từ cây Lithospermum erythrorhizon

Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 1 I. Tổng quan tài liệu ................................................................................................................. 2 1. Giới thiệu về hợp chất thứ cấp ......................................................................................... 2 2. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật .................................................................................... 2 3. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật .................................................. 3 4. Một số nghiên cứu về hợp chất thứ cấp ........................................................................... 5 II. Thu nhận hợp chất shikonin từ cây Lithospermum erythrorhizon .................................... 7 1. Giới thiệu Shikonin ............................................................................................................ 7 2. Phương pháp nuôi cấy tế bào. ........................................................................................... 8 2.1. Giới thiệu về nuôi cấy lông rễ .................................................................................... 8 2.2. Vi khuẩn Agrobacterium và cơ chế gây nhiễm của chúng trên thực vật. ............ 10 2.3. Thu nhận hợp chất shikonin từ rễ cây Lithospermum erythrorhizon được gây nhiễm với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes . ............................................................... 14 2.3.1. Giới thiệu về phương pháp. ................................................................................. 14 2.3.2. Nguyên liệu và phương pháp ............................................................................... 14 2.3.3. Kết quả và thảo luận ............................................................................................. 15 2.4. Tăng cường sản xuất Shikonin từ Lithospermum erythrorhizon nhờ tách chiết in situ (tại chỗ) và cố định Calcium Alginate ............................................................................ 18 2.4.1. Giới thiệu về phương pháp .................................................................................. 18 2.4.2. Nguyên liệu và phương pháp. .............................................................................. 19 2.4.3. Sự cố định và cảm ứng tạo Shikonin trong nuôi cấy tế bào thực vật .............. 19 2.4.4. Phương pháp phân tích ........................................................................................ 19 2.4.5. Kết quả và thảo luận ............................................................................................. 20 Nhóm thực hành : Nguyễn Thị Thanh Trúc mssv 60802410 Nguyễn Thị Thủy Tiên mssv 60802210 Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 2 SHIKONIN VÀ PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN SHIKONIN TỪ CÂY LITHOSPERMUM ERYTHRORHIZON I. Tổng quan tài liệu 1. Giới thiệu về hợp chất thứ cấp Sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật thường được hình thành với một lượng nhỏ trong cây. Chúng được biết đến như là các hợp chất thứ cấp và thường được dùng làm dược liệu hay phụ gia thực phẩm có giá trị . Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ 20 (Rao và cs 2002). Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside. Các alkaloid : Có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, có hoạt tính sinh lý trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược. Họ alkaloid bao gồm: codein, nicotine, caffeine và morphine.Một số loài thực vật có chứa nhiều alkaloid như cây thuốc phiện,canh ki na,cà độc dược,thuốc lá,khoai tây.alkaloid có thể có trong toàn cây hay chỉ tập trung ở bộ phận nào đó,như ở quả cây thuốc phiện,vỏ cây canh ki na,rễ cây và độc dược....Các hoạt tính sinh học của nó có thể tác động lên hệ thần kinh,hệ cơ,mạch máu hay bộ máy hô hấp của con người. Với liều lượng lớn alkaloid thường độc nhưng liều lượng nhỏ chúng thường làm dùng thuốc chữa bệnh. Các tinh dầu : Chứa hỗn hợp terpenoid,được sử dụng như chất mùi ,chất thơm và dung môi.Chúng không tan trong nước. Các glycoside: Bao gồm các hợp chât phenol và flavonoid,saponin,và các cyanogenic glycoside,một số dùng làm thuốc nhuộm,chất mùi thực phẩm và dược phẩm. 2. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật Kỹ thuật này là tiềm năng để thu được các hợp chất có giá trị mà không thể sản xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học. Những năm gần đây, sự phát triển của các hợp chất thứ cấp quan trọng trong thương mại là kết quả được mong đợi nhất trong lĩnh vực nghiên cứu này. Ưu thế về mặt nguyên lý của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung cấp liên Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 3 tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy . Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái. Nhiều hợp chất thứ cấp được sản xuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các mô có khả năng phân hóa cao như rễ, lá và hoa. Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thành không xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất thứ cấp có khuynh hướng ngưng tạo thành trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối có sự tiếp xúc với môi trường khác với các tế bào ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối để tạo thành các chất thứ cấp (Lee 2001). Nuôi cấy tế bào huyền phù : Thường khởi đầu bằng cách đặt các khối callus dễ vỡ vụn trong môi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy). Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xoáy của môi trường. Sau một thời gian ngắn trong dịch huyền phù sẽ có các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, các mẫu nuôi cấy còn thừa chưa phát triển và các tế bào chết. Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền phù hoàn hảo, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. Mức độ tách rời của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi thành phần môi trường (Misawa, 1994). Nuôi cấy callus (trên môi trường rắn) : Có ưu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu nhưng nhược điểm là thể tích nuôi cấy bé nên khó phát triển ở quy mô công nghiệp, mẫu nuôi cấy chỉ tiếp xúc được một mặt với nguồn dinh dưỡng, những sản phẩm do mẫu nuôi cấy tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ xung quanh dẫn đến làm chậm sự sinh trưởng của tế bào. Vì thế, nuôi cấy tế bào huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật vì có thể duy trì và thao tác tương tự với các hệ thống lên men vi sinh vật ngập chìm trong môi trường lỏng. 3. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật Với sự tiến bộ không ngừng của ngành công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô tế bào thực vật đã giúp nhân giống các cây trồng có giá trị và thu nhận được nhiều hợp chất thứ cấp quý hiếm mang lại nhiều ý nghĩa về mặt thương mại Phương pháp này sẽ mở rộng và tăng khả năng thu hồi các hóa chất giá trị có nguồn gốc thực vật, một sự thay thế từ quy mô nông nghiệp truyền thống lên quy mô công nghiệp trong sản xuất các hợp chất thứ cấp .Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được khởi xướng từ cuối những năm 60 của thế kỷ 20 như là một công cụ hữu ích để nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật. Mục tiêu của kỹ thuật nuôi cấy tế bào :cải thiện hiệu suất các sản phẩm có hoạt tính Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 4 sinh học Ưu điểm :có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên những lý do sau: F Tổng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và điều kiện đất trồng; F Phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng) F Có thể chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau F Với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng của tế bào và điều hòa quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên. Bên cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy nuôi cấy tế bào huyền phù của thực vật cũng được sử dụng để sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp (Fisher và cs 1999). Phương pháp làm tăng sản lượng các hợp chất tự nhiên trong nuôi cấy tế bào F Chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp F Chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao, F Bổ sung tiền chất nuôi cấy và các chất kích kháng bảo vệ thực vật (Mulbagal and Tsay 2004). Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy. Các sản phẩm tích lũy có trong tế bào có thể cao hơn khi ta tối ưu các điều kiện nuôi cấy.Nên việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng của môi trường đã được nghiên cứu nhiều như các thông số hóa học và vật lý như thành phần và pH môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặc khuấy, và ánh sáng. Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có thể gần như là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy. Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao. Các tế bào thực vật trong nuôi cấy là một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập. Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong nuôi cấy đã được Berlin và Sasse công bố năm 1985, và sau đó phương thức này đã được ứng dụng rộng rãi. Chẳng hạn, một dòng tế bào của cây bát tiên (Euphorbia milli) sau 24 lần chọn lọc đã tích lũy gấp khoảng 7 lần lượng anthocyanin được sản xuất từ nuôi cấy tế bào bố mẹ (Yamamoto và cs 1982). Yamada và Sato (1981) đã chọn lọc được một dòng tế bào của Coptis japonica có khả năng sinh trưởng gấp 6 lần trước đây sau 3 tuần nuôi cấy và lượng berberin đạt tới 1,2 g/L. Cung cấp tiền chất (precursor feeding). Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 5 Bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp nội bào vào môi trường nuôi cấy cũng có thể tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số hợp chất trung gian nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng lượng sản phẩm cuối cùng. Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành rẻ. Tăng cường kích thích hoặc bổ sung tiền chất hoặc các hợp chất tương tự mang lại hiệu quả trong nhiều trường hợp (Silvestrini và cs 2002; Moreno và cs 1993). Chẳng hạn, bổ sung phenylalanine khi nuôi cấy tế bào huyền phù cây Salvia officinalis đã kích thích tạo ra rosmarinic acid, cung cấp ferulic acid trong nuôi cấy tế bào cây Vanilla planifolia đã tăng tích lũy valnillin, hoặc bổ sung leucine dẫn đến việc tăng các monoterpen dễ bay hơi trong nuôi ấy Perilla frutiscens (Mulbagal and Tsay 2004). Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation). Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ chống lại các yếu tố gây bệnh. Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp. Sử dụng các elicitor của bộ máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử dụng các elicitor sinh học và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thích hình thành các hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao (DiCosmo và Tallevi, 1985). 4. Một số nghiên cứu về hợp chất thứ cấp @ Ngay từ năm 1971, Wani và các cộng sự đã tìm ra một diterpene amide mới có khả năng chống ung thư gọi là “taxol” chiết từ cây thông đỏ Pacific (Taxus brevifolia). Đến năm 1983, taxol được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư buồng trứng. Sau đó, FDA đã cho phép sử dụng taxol trong điều trị các trường hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú. Ngoài ra, taxol cũng có ác dụng đối với các bệnh nhân có khối u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu khác @ Neto và cs (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và một số yếu tố khác lên sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào T. cuspidata. Srinivasan và cs (1995) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào của T. baccata. Lee và cs (1995) đã nghiên cứu ản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây T. mairei, một loài được tìm thấy tại Đài Loan ở độ cao 2000 m so với mực nước biển. Các dòng tế bào thu được từ callus có nguồn gốc thân và lá, và một trong những dòng này sau khi được bổ sung các tiền Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 6 chất vào môi trường nuôi cấy, thì sau 6 tuần cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ có khoảng 200 mg taxol. @ Tsay và cs (1994) đã nghiên cứu sản xuất imperatorin từ nuôi cấy tế bào huyền phù của cây Angelica dahurica var. Formosana. Đây là một loài cây bản địa lâu năm ở Đài Loan, được sử dụng để chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến. Imperatorin được xem là thành phần hoạt động chính trong điều trị các bệnh về da. Nghiên cứu đã cho thấy trong chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù, sản phẩm imperatorin đạt giá trị cực đại trong khoảng giữa 10 và 14 ngày.Benzylamino purine ở nồng độ từ 0,5-1,0 mg/L đã kích thích tổng hợp imperatorin, một tỷ lệ thích hợp ammonium nitrate và nitrate (2:1) cũng như tăng nồng độ phosphate từ 1-2 mM sẽ làm tăng lượng impertatorin. Glucose là nguồn carbon tốt hơn saccharose và fructose về hiệu quả sản xuất imperatorin. Vai trò của elicitor cũng đã được khảo sát, bổ sung thêm vanadyl sulphate trong môi trường sẽ tăng tích lũy imperatorin, quyết định nồng độ và thời gian sinh trưởng của tế bào. Bổ sung vanadyl sulphate ở nồng độ 30 mg/L vào môi trường đã cho hiệu quả tốt nhất sau 10 ngày nuôi cấy. Hoặc bổ sung 20 g/L chất hấp phụ amberlite XAD-7 vào môi trường, quá trình tổng hợp imperatorin cũng tăng mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 10. Hàm lượng imperatorin sản xuất bởi phương thức này đạt 460 µg khối lượng tươi cao hơn đối chứng 140 lần. @ Yeh và cs (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây Dioscorea doryophora. Phương pháp này được sử dụng như một cách thay thế quá trình tổng hợp steroid. Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lập bằng cách đưa callus vào môi trường có 0,2 mg/L 2,4- Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Nồng độ saccharose tối thích cho tổng hợp diosgenin là 3%. Lượng diosgenin thu được trong trường hợp này đạt tới 3,2% khối lượng khô. Sản xuất diosgenin từ cây D. doryophora bằng nuôi cấy tế bào huyền phù hiện nay đã được ứng dụng trên quy mô công nghiệp. Gentiana davidii var. formosana là thảo mộc bản địa sống lâu năm ở Đài Loan. Từ xưa nó đã được sử dụng như một loại thuốc thô sơ trong y học cổ truyền Trung Quốc nhằm ngăn chặn béo phì và lão hóa, bảo vệ phổi khỏi các chất độc (Zheng và cs 1997). Secoiridoid glycoside là hợp chất chính với đặc tính y học ở trong rễ của chi Gentiana (Skrzypczak và cs 1993). Chueh và cs (2000) nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù của G. davidii var. formosa để sản xuất gentipicroside và swertiamarin, hai dược chất quan trọng. Tế bào huyền phù sinh trưởng tối ưu khi nuôi cấy callus trong môi trường bổ sung 1,2 mg/L kinetin và 3% saccharose, pH 4,2-5,2, tốc độ lắc 80-100 vòng/phút. Sự tích lũy cao nhất 2 hợp chất swertiamarin và gentipicroside trong tế bào được xác định lần lượt sau 12 và 24 ngày nuôi cấy. Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 7 @ Miyasaka và cs (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuôi cấy callus cây Salvia miltiorrhiza. Salvia là một chi quan trọng của họ Lamiaceae và một vài loài của Salvia mọc hoang dại trên khắp thế giới dùng làm thuốc dân gian. Hiệu quả của BA đối với việc hình thành cryptotanshinone trong nuôi cấy callus S.miltiorrhiza đã được khảo sát. Callus sơ cấp được tạo ra từ nuôi cấy mảnh lá ở trong tối trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D. Callus sau đó phát triển nhanh hơn trên môi trường có 1,0 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA. Kết quả phân tích HPLC cho thấy callus chứa một lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối lượng khô). Loại bỏ 2,4-D khỏi môi trường nuôi cấy cho kết quả là lượng cryptotanshinone trong callus tăng lên. Nồng độ cao nhất của cryptotanshione thu được trong callus nuôi cấy trên môi trường có 0,2 mg/L BA trong 6 ngày là 4,59 mg/g khối lượng khô (Wu và cs 2003).Podophyllotoxin là một aryltetralin lignan chống khối u được tìm thấy ở các cây Podophyllum peltatum và Podophyllum hexandrum. Nó cũng được dùng để tổng hợp các dẫn xuất etoposide và teniposide, sử dụng rộng rãi trong điều trị chống khối u (Issell và cs 1984). Tuy nhiên, trong tự nhiên những cây này sinh trưởng rất chậm và vì thế đã hạn chế việc cung cấp podophyllotoxin, bắt buộc chúng ta phải hướng tới một phương thức thay thế khác. Nuôi cấy tế bào để sản xuất podophyllotoxin đã được Kadkade và cs thực hiện lần đầu tiên vào năm 1981 và 1982. Woerdenberg và cs (1990) đã dùng một phức hợp precursor là coniferyl alcoholvà b-cyclodextrin bổ sung trong môi trường nuôi cấy tế bào huyền phù của P. hexandrum. Bổ sung phức hợp 3 mM coniferyl alcohol đã tăng hiệu suất podophyllotoxin lên 0.013% theo khối lương khô, trong khi các nuôi cấy không có precursor chỉ sản xuất được 0.0035% podophyllotoxin. Smollny và cs (1992) đã thông báo callus và tế bào huyền phù của Lilium album đã sản xuất được 0.3% podophyllotoxin. II. Thu nhận hợp chất shikonin từ cây Lithospermum erythrorhizon 1. Giới thiệu Shikonin Shikonin,được biết đến như một chất kháng khuẩn,chống viêm,chữa lành vết thương và khối u hoạt động,nó trở thành cây thuốc đầu tiên được sản xuất với quy mô công nghiệp bằng phương pháp nuôi cấy tế bào.Shikonin có trong rễ của cây Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 8 Lithospermum erythrorhizon. Cây này trồng 5-7 năm, chiết rễ lấy được 1-2% chất khô, giá 1 kg là 4.500 USD. Nhu cầu tiêu thụ shikonin cao. Ở Nhật Bản phải nhập thêm của Trung Quốc, Triều Tiên. Một đoạn rễ đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ để làm bài thuốc nhân gian và ngày nay được sử dụng làm thuốc mỡ chữa bỏng.Nó có công thức cấu tạo như sau: Chuỗi phản ứng tổng hợp một dẫn xuất có hoạt tính sinh học cao từ shikonin Bình thường shikonin tích lũy không nhiều trong rễ. Tuy nhiên, các nhà khoa học Nhật đã tạo được dòng tế bào rễ cây Lithospermum có khả năng tích lũy đến 15% shikonin và đã hoàn chỉnh công nghệ nuôi cấy tế bào sản xuất shikonin. Công nghệ này cho phép trong một chu kỳ nuôi cấy thu hoạchtới 5 kg hoạt chất và giúp giảm rất nhiều giá thành của shikonin. Sản phẩm công nghiệp đầu tiên từ nuôi cấy tế bào là shikonin được tập đoàn công nghiệp hóa dầu Mitsui (Nhật) sản xuất. Năm 1983, Mitsui thông báo về quá trình phát triển kỹ nghệ sản xuất công nghiệp chất shikonin bằng nuôi cấy tế bào trong thùng lên men loại nhỏ 750 lít. Thành công bước đầu là chọn được một dòng tế bào tích lũy shikonin gấp mười lần nhiều hơn so với nguồn nguyên liệu tự nhiên ở cây Lithospermum erythrozhizon (koshikon) và xây dựng phương pháp hai giai đoạn để sản xuất shikonin từ nuôi cấy tế bào 2. Phương pháp nuôi cấy tế bào. 2.1.Giới thiệu về nuôi cấy lông rễ Những vấn đề tồn tại trong nuôi cấy tế bào công nghiệp có thể được giải quyết thông qua kỹ thuật nuôi cấy rễ tơ. Cơ sở khoa học của giải pháp : Báo cáo môn công nghệ tế bào GVHD :Lê Thị Thủy Tiên Trang 9 Việc nhiễm callus với giống vi khuẩn đất Agrobacterium rhizogenes khiến cho tế bào callus đồng nhất phân hóa