Thư viện bộ gen và thư viện cdna

THƯ VIỆN BỘ GENVÀTHƯ VIỆN cDNATRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNGNGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌCMH. KỸ THUẬT DI TRUYỀNGVHD: TS. Trần Thị DungNỘI DUNG CHÍNHTHƯ VIỆNcDNATHƯ VIỆN BỘ GENTHƯ VIỆN BỘ GENKHÁI NIỆMQUÁ TRÌNH THÀNH LẬPKHÁI NIỆMChia nhỏ DNA bộ gen và chèn chúng vào tế bào chủ.Chứa tất cả DNA bộ gen của sinh vật .Thư viện gen(Ngân hàng gen)QUÁ TRÌNH THÀNH LẬPTÁCH CHIẾT DNACẮT GẮN VECTOR ĐƯA VÀO TẾ BÀO TẠO DÒNGSÀNG LỌCTÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH DNALấy mẫu vật (nuôi cấy vi sinh vật, nghiền mẫu mô động vật, thực vật ở nhiệt độ thấp).Phá vỡ màng tế bào và màng nhân.Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu chủ yếu là protein.(chiết xuất bằng phenol).Cô đặc DNA lại bằng ethanol hay iso-propanol lạnh.Rửa lại DNA bằng ethanol lạnh và đem bảo quản DNA trong dung dịch TE (ở nhiệt độ thấp).PHÂN CẮT DNA BỘ GENSử dụng enzyme cắt giới hạn RT (Reverse Transcriptase)Mỗi loại enzyme cắt tại một vị trí đặc hiệu trên DNA và vector chuyển gen.=> Tạo ra 2 thư viện gen khác nhau khi cắt bằng 2 loại enzyme RT.Sử dụng enzyme Alkaline phosphataseEnzyme được dùng để :Loại nhóm 5’ phosphate của DNA hay RNA trước khi đánh dấu phóng xạ.Loại nhóm 5’ phosphate của DNA hay RNA. Không bị nối vòng khi cắt bằng RTT4 polinucleotide kinase và alkaline phosphatase thường được sử dụng đồng thời trên vector và đoạn DNA cần gắn xen trong kỉ thuật tạo dòng.TẠO DNA TÁI TỔ HỢPSử dụng enzyme nối LigaseENZYME LIGASEE.Coli DNA ligase T4 DNA ligase T4 RNA ligase T4 POLYNUCLEOTIDE KINASE ĐƯA DNA TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦMục đích:Sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao .Tuỳ thuộc loại tế bào chủ , người ta sử dụng một kĩ thuật chuyển thích hợp. Tách chiết plasmid cho thí nghiệm tạo dòng.ĐƯA DNA TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦLoại tế bào chủE. coli EukaryoteĐƯA DNA TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦPhương pháp thực hiện:Hóa biến nạp: CaCl2 + sốc nhiệtĐiện biến nạp: dòng điện cao thế cục bộTẠO DÒNGTế bào được nuôi cấy tạo thành những dòng mới chứa DNA tái tổ hợp.Môi trường nuôi cấy tạo dòng thường là:M9 (Thành phần dinh dưỡng xác định)LB (Thành phần dinh dưỡng chưa xác định)Chuẩn bị cho giai đoạn sàng lọcSÀNG LỌC THƯ VIỆN ĐỂ NHẬN TRÌNH TỰ ĐÍCHSau khi thư viện gen được tạo ra. Các phương pháp thông dụng được sử dụng để nhận dạng:Lai DNA với mẫu dò DNA đánh dấu sau đó sàng lọc để chọn dấu mẫu dò bằng phép chụp ảnh phóng xạ.Sàng lọc để chọn sản phẩm protein bằng phương pháp miễn dịch, thử hoạt tính protein, hoặc thử nghiệm bổ trợ (di truyền) chức năng.THƯ VIỆN cDNAKHÁI NIỆMPHƯƠNG PHÁPĐÁNH GIÁỨNG DỤNG VÀ THÀNH TỰUKHÁI NIỆMDNA bổ trợ (complementary DNA)DNA tổng hợp từ mRNA với xúc tác của enzyme RT (reverse transcriptase)cDNAKHÁI NIỆMTập hợp các cADN tổng hợp từ các mARN.Thiết lập trên vector (plasmid hoặc phage lambda)Đối tượng áp dụng: eukaryoteThư viện cDNA (Ngân hàng cDNA)KHÁI NIỆMTHƯ VIỆN GENTHƯ VIỆN cDNATập hợp các phân đoạn của DNA bộ genChứa toàn bộ DNA của sinh vậtTạo DNA tái tổ hợp đưa vào tế bào vật chủ.Vật chủ: E.coli, EukaryoteVector: plasmidtập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mARN thiết lập từ một tế bào xác địnhgen cần nghiên cứu phải biểu hiện thành mARN Vector: phage lambda; plasmidPHƯƠNG PHÁPPHÂN LẬP RNATÁCH CHIẾT mRNATỔNG HỢP cDNATẠO DÒNG cDNAXÁC ĐỊNH DÒNGTHÀNH LẬP DỮ LIỆU cDNAPHÂN LẬP RNATÁCH mRNA Thu mRNA trưởng thành từ nhiều loại RNA (tRNA, rRNA, mRNA chưa trưởng thành)Phương pháp: Cho đuôi poly(A) của phân tử mRNA liên kết bắt cặp base với chuỗi olygo(dT) trong cột.Các RNA khác trôi khỏi cột. mRNA được giữ lại.Biến tính để thu hồi mRNA.Nguyên liệu:Khuôn mRNA.Mồi oligo(dT)Enzyme RTdNTPsSINH TỔNG HỢP cDNANguyên tắcGắn mồiTổng hợp ss cDNATổng hợp ds cDNAHoàn chỉnhHOẠT ĐỘNG CỦA RTCẤU TRÚC “KẸP TÓC”GẮN BẰNGTERMINAL TRANSFERASERnase HTẠO DÒNG cDNAHai phương pháp liên kết ds cDNA với vectorBổ sung đuôi đồng trùng hợpBổ sung linker, có sự tham gia của enzyme giời hạn. cDNA linkercDNA adapterDNA ligaseCÁC VECTORBacteriophage lambda:Dung nạp đoạn gen có kích thước lớnVector lambda mang vùng đệm (suffer) nếu cắt bỏ sẽ không ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của phage lambda. Loại bỏ vùng này và thay bằng đoạn cDNA. Trong tạo dòng cDNA, thường dùng bacteriophage lambda gt10, gt11, và lambda ZAP I, II là thế hệ bacteriophage lambda mới. Plasmid:Dung nạp đoạn gen có kích thước dưới 3kbCÁC VECTORXÁC ĐỊNH DÒNGCác phương pháp thông dụng được sử dụng để nhận dạng:- Lai cDNA với mẫu dò DNA đánh dấu sau đó sàng lọc để chọn dấu mẫu dò bằng phép chụp ảnh phóng xạ.- Sàng lọc để chọn sản phẩm protein bằng phương pháp miễn dịch, thử hoạt tính protein, hoặc thử nghiệm bổ trợ (di truyền) chức năng.Phương pháp tương tự như với lập thư viện bộ gen.ĐÁNH GIÁƯU ĐIỂMCác dòng cDNA chứa trình tự liên tục mã hóa của một gen.Những tế bào chuyên hóa tạo ra một số lớn các protein một loại và mRNA tương ứng của protein giàu đó sẽ dễ tách ra để tạo ngân hàng cDNA. Biến nạp cDNA khắc phục được hiện tượng tế bào vi khuẩn không dung nạp gen có cấu trúc mang phần không mã hóa.KHUYẾT ĐIỂMKỹ thuật tạo cDNA cho ta nhiều gen khác nhau.Mỗi giai đoạn phát triển khác nhau của cơ thể thì sự phiên mã ngược của hệ gen là khác nhau.=> Thiết lập ngân hàng cDNA chọn lọc gen mong muốn đòi hỏi công phu tỷ mỉ và tốn nhiều thời gian.ĐÁNH GIÁỨNG DỤNGTạo dòng các gen mã hóa cho globin của người, động vật và chim, cho protein thủy phân ở mắt bò, cho ovalbumin, cho fibroin tơ tằm,