Tiểu luận Chẩn đoán virus cúm gia cầm (avian influenza hoặc bird flu) bằng kỹ thuật gen

1 TIỂU LUẬN CHẨN ĐOÁN VIRUS CÚM GIA CẦM (AVIAN INFLUENZA HOẶC BIRD FLU) BẰNG KỸ THUẬT GEN 2 I. Đặt vấn đề Virus cúm là thành viên chính của họ orthomyxoviridae và là căn nguyên gây bệnh cúm. Bệnh cúm là một nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính tạo thành dịch do virus Virus cúm đã gây nhiều vụ dịch lớn trên thế giới với tỉ lệ tử vong cao. Có 3 týp vi rút cúm là A, B và C, trong đó vi rút cúm A hay gây đại dịch.Bệnh cúm gia cầm đã bùng phát trở lại ở một số địa phương nước ta. Cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm nhất hiện nay đối với ngành chăn nuôi, bệnh diễn biến phức tạp, thường ở thể quá cấp và cấp tính gây chết nhanh chóng, hàng loạt khi nhiễm phải, làm thiệt hại lớn cho người chăn nuôi. Việc xác định các bệnh nhân đang nằm viện bị H5N1 là khó khăn, nhất là khi không biết được mối liên hệ dịch tễ và khi có các triệu chứng không đặc hiệu. trong những năm gần đây, nhờ sự phát triển của công nghệ gen và công nghệ sinh hoc...nhiều phương pháp chẩn đoán mới đã được xây dựng, áp dụng trong chẩn đoán virus, cho phép xác định kết quả nhanh. những phương pháp mới này có ưu điểm là nhanh,đơn giản, nhạy, chính xác và chi phí thấp... II. Virus cúm gia cầm 1.Giới thiệu về virus cúm gia cầm Cúm gà hay Cúm gia cầm là một loại bệnh truyền nhiễm gây ra bởi các virus thường chỉ gây bệnh cho gia cầm ( gồm cả chim) và có thể xâm nhiễm một số loài có vú. Tuy nhiên, các virus cúm gia cầm cũng có thể gây bệnh cho người, thậm chí gây tử vong. Virus H5N1 là một loại virus cúm gia cầm đặc biệt, mà gần đây đã lan truyền rộng rãi ở nhiều quốc gia. Virus này được phát hiện lần đầu tiên là tại Ý vào thập niên 1900 và giờ đây phát hiện ở hầu hết các nơi trên thế giới Virus cúm có tên khoa học là avian influenza (AI) thuộc nhóm virus cúm A của họ Orthomyxociridae đây là những retrovirus, mang vật liệu di truyền là những đoạn phân tử RNA, sợi đối mã (sợi âm tính). Dòng H5N1 gây bệnh trên chim, được gọi là HPAIA(H5N1) được viết tắt từ cụm từ “ highly pathogenic avian influenza virus of type A of subtype H5N1”, là tác nhân gây ra cúm H5N1, được gọi với tên thông thường là cúm gia cầm hay cúm chim. Dòng virus này gây dịch bệnh ở nhiều loại chim, đặc biệt ở vùng Đông Nam Á. Loại này có tính “Epizootic” (gây bệnh cho nhiều loại đông vật, và hàng trăm ngàn gia súc khác). Vì độc lực và khả năng gây chết người cao của HPAI A(H5N1), sự hiện diện theo địa phương, việc tăng nhanh số lượng các ký chủ và khả năng đột biến đang diễn tiến đáng ngại, virus H5H1 trở thành mối đe dọa về một đại dịch khủng khiếp nhất trên toàn cầu và hàng tỷ đô la đã được đổ ra để nghiên cứu về H5N1 và chuẩn bị cho khả năng tiềm tàng của một đại dịch cúm. 3 2.Những đại dịch cúm trong lịch sử loài người Ngược lại lịch sử, đã có những ghi chép về các đại dịch cúm vào đầu những năm 1500. Có thể kể ra đây vụ dịch được coi là đầu tiên trong y văn xảy ra vào năm 1580 ở châu Âu sau đó lan sang châu Á và châu Phi. Thế kỷ 17 cũng ghi nhận có một số đại dịch cúm xảy ra. Sang thế kỷ 18, các vụ dịch cũng xảy ra vào các năm 1729-1730, 1732-1733 và 1781-1782. Sang thế kỷ 19, có ba vụ dịch năm vào những năm 1830 - 1831, 1833 - 1834, 1889 - 1890. Đặc biệt, đại dịch xảy ra năm 1889 bắt đầu ở Nga và lan tràn rất nhanh sang toàn bộ châu Âu. Đại dịch cúm Nga này lan sang Bắc Mỹ vào tháng 12/1889. Có khoảng một triệu người đã chết trong đại dịch này. Thế kỷ 20 đã chứng kiến 3 đại dịch cúm khủng khiếp, cướp đi sinh mạng của hàng triệu người trên toàn thế giới. Đại dịch đầu tiên được gọi là cúm Tây Ban Nha. Lúc đầu, người ta không biết chủng virus nào đã gây ra đại dịch này. Sau nhiều cố gắng của các nhà khoa học, gần đây, chúng ta đã dựng lại được cấu trúc của chủng virut này và đó chính là chủng H1N1. Dịch bắt đầu vào tháng 8/1918 đến năm 1919 và được coi là đại dịch có số người tử vong lớn nhất từ trước tới nay (hơn 50 triệu người chết). Trong số các nạn nhân, có 17 triệu người ở Ấn Độ, 500.000 người ở Mỹ và 200.000 ở Anh. Bệnh nhân tử vong rất nhanh chỉ trong vòng vài ngày sau khi bị bệnh. Hơn một nửa số nạn nhân là người trưởng thành, trẻ tuổi và khỏe mạnh. Đại dịch lần thứ hai - cúm châu Á bắt đầu ở Trung Quốc vào cuối tháng 2/1957 và lan sang Mỹ vào tháng 6 cùng năm. Chủng virut H2N2 đã gây tử vong cho 70.000 người ở Mỹ và hơn một triệu người khác trên toàn thế giới. Đại dịch thứ 3 và là đại dịch gần đây nhất xảy ra sau đó khoảng 10 năm, 1968-1969. Lần này, số người tử vong ít hơn hai lần trước. Thủ phạm của vụ dịch là chủng virut H3N2. Virus được phát hiện đầu tiên ở Hồng Kông, sau đó lan sang Mỹ vào cuối năm 1968. Qua nghiên cứu cấu trúc và đặc điểm của virut, các nhà khoa học thấy rằng, các chủng virus gây ra hai vụ dịch về sau này là sự tái hợp của một số virut có nguồn gốc từ người và một virus có nguồn gốc từ gia cầm. Trong vụ dịch 1957-1958, chủng virus gây bệnh đã lấy 3 đoạn gen của virut cúm từ vịt hoang dại tái hợp với 5 đoạn gen của chủng virus lưu hành trong quần thể người. Sang vụ dịch năm 1968-1969, chủng H3N2 đã thay đổi cấu trúc các protein hemaglutinin nhưng không thay đổi cấu trúc của neuramidase, nên chủng virus này được coi là có độc lực yếu hơn hai chủng của hai vụ dịch trước. 3.Cấu tạo virus cúm gia cầm 4 3. Cấu tạo của virus cúm A virus_di_tipo_a Mô hình virut cúm H5N1 virus typ-A Dưới kính hiển vi điện tử,. Virus cúm hình cầu, Đường kính khoảng 100-120nm. Các hạt virus cúm có cấu trúc phức tạp. Các protein capsid virut cúm, cùng với ARN, tạo thành nucleocapsid đối xứng xoắn. Vỏ của virus cúm được cấu tạo bởi hai lớp lipid, trên bề mặt hai lớp lipid đó có những vị trí trồi lên giống như những gai. Các gai này cấu tạo bởi glycoprotein và có hai loại hemaglutinin và neuraminidase ký hiệu là H và N. Mỗi cấu trúc H và N dài 8-10nm, cách nhau 8nm. Hemaglutinin có chức năng giúp virus bám vào các receptor trên bề mặt tế bào cảm thụ và đó là yếu tố quyết định kháng nguyên rất quan trọng trong sản xuất vacxin. Chức năng của neuraminidase chưa được hiểu rõ hoàn toàn, nhưng nhiều nghiên cứu cho thấy chúng bổ sung cho chức năng của hemaglutinin, thúc đẩy sự lắp ráp và giải phóng của virus từ tế bào cảm thụ. Hai cấu trúc glycoprotein H và N xác định kháng nguyên đặc hiệu của từng týp virus. Hiện nay có 16 cấu trúc kháng nguyên H và 9 cấu trúc kháng nguyên N khác nhau đặc hiệu cho từng thứ týp của virut cúm. Chúng được ký hiệu kháng nguyên H1-H16, và N1-N9. Protein M2 của virut chỉ có ở một số ít các chủng virut cúm A. Chúng có tác dụng điều hòa pH bên trong hạt virut. Nó có vai trò cởi bỏ lớp vỏ của virut trong giai đoạn đầu nhân lên trong tế bào cảm thụ. Chức năng này bị bất hoạt bởi các thuốc chống virut như amantadine và rimantadine. Cấu trúc ARN của cúm A và B phân làm 8 đoạn gen, còn cúm C phân làm 7 đoạn. Mỗi đoạn gen có vai trò mã hóa cho các thông tin di truyền đặc trưng của virut đó. ARN của virut được bao bọc bởi các nucleoprotein và vỏ 5 bao của virut. Dựa vào sự khác biệt về kháng nguyên của các nucleoprotein, protein M, các virut cúm được phân loại thành cúm A, B và C. Virut cúm B và C không phân chia thành các thứ týp. Tất cả các virut gây bệnh cúm ở chim được xếp vào loại virut cúm A. Các thứ týp của virut cúm A được phân loại dựa vào sự khác biệt của các yếu tố H và N. Các thứ týp H và N khác nhau của các virut cúm có thể gây bệnh cho người và nhiều động vật khác nhau. Ví dụ: H1N1 gây bệnh cho người và cũng gây bệnh được cho lợn, H1N3 có thể gây bệnh cho cá voi, H3N2 gây bệnh cho người; H4N5 gây bệnh cho hải cẩu... Như các loại cúm gia cầm khác, H5N1 có những dòng "độc lực cao" (HP) và "độc lực thấp" (LP). Virus HPAI có độc tính rất cao và tỷ lệ gây chết trong bầy gia cầm bị nhiễm thường gần 100%. Virus LPAI (Virus cúm gia cầm độc lực thấp) có độ độc không đáng kể, nhưng những virus này có thể cung cấp nguyên bản cho dòng virus độc lực cao. Dòng H5N1 hiện tại là nguyên nhân gây chết ở các loài chim trên khắp thế giới là một dòng HPAI; các dòng hiện tại khác của H5N1, bao gồm cả dòng Bắc Mỹ không gây bệnh ở bất kỳ loài nào, là những dòng LPAI. Tất cả các dòng HPAI được xác định đến giờ đều có liên quan đến phân nhóm H5 và H7. Điều khác biệt là sự phát sinh bệnh liên quan đến các loài gia cầm chứ không phải con người. Thông thường một loài virus cúm gia cầm độc lực cao thì không gây bệnh nặng trên cả người và những loài không phải gia cầm. Dòng H5N1 chết người hiện tại lại có dấu hiệu gây chết bất thường cho nhiều loài, bao gồm cả những loài như mèo nhà, vốn chưa từng mắc bệnh cúm với bất cứ loại virus cúm nào trước đây 4.Cấu trúc di truyền và các typ liên quan Kí tự N trong H5N1 là viết tắt của “"Neuraminidase", H5N1 là phân nhóm của loài virus cúm A thuộc Chi “Influenzavirus” A trong họ Orthomyxoviridae Giống như các phân nhóm cúm A khác, phân nhóm H5N1 là một virus RNA, nó có 8 đoạn gen mạch RNA dương viết tắt là PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, MP và NS HA là ký hiệu của hemagglutinin, một loại kháng nguyên glycoprotein được tìm thấy trên bề mặt virus cúm và chịu trách nhiệm liên kết virus với tế bào vật chủ. NA là lý hiệu của neuraminidase, một kháng nguyên enzym tan nhầy được tìm thấy trên bề mặt virus cúm. Enzym này có vai trò hỗ trợ giải phóng các tiểu virus khỏi tế bào vật chủ. Mạch RNA của hemagglutinin (HA) và neuraminidas (NA) có cấu trúc protein khiến chúng trở thành mục tiêu của các loại thuốc chống virus và các kháng thể. HA và NA cũng được dùng để làm cơ sở cho việc đặt tên các phân nhóm cúm A. Nó trở thành ký tự H và N trong tên H5N1. Các virus cúm A rõ ràng có khả năng tiềm tàng gây bệnh và gây chết người và các động vật khác. Các phân nhóm virus cúm A đã được khẳng định trên người đã gây ra số lượng người chết ở tầm cỡ đại dịch. Đối với dòng virus cúm gia cầm có độc lực thấp (LPAIH5N1) còn gọi là H5N1 Bắc Mỹ thường hiện trong các loại chim hoang dã. Trong hầu hết các trường hợp, nó chỉ gây ra những bệnh nhẹ hoặc những dấu hiệu không đáng chú ý ở các loài chim. Nó không gây bệnh trên người. điều lo lắng duy nhất về dòng này là nó có thể truyền sang gia cầm và biến đổi thành dòng có độc lực cao. Trong cấu trúc của virus H5N1 có 8 phân tử ARN với các chức năng như sau: - 1 gen HA: điều khiển quá trình tổng hợp hemagglutinin( chất ngưng kết hồng cầu). có 16 loại gen HA, trong đó chỉ có H1,H2,H3 tìm thấy ở các virus gây bệnh cho người. virus mang gen H5,H7,H9 có thể lây từ chim qua người. gen H16 được phát hiện năm 2005 tại Bắc Âu. - 1 gen NA: điều khiển quá trình tổng hợp neuraminidase( enzym tan nhầy), có 9 loại gen NA, trong đó chỉ có N1,N2 tìm thấy ở các virus gây bệnh cho người. Các gen HA và NA đặc trưng cho loại virus, các gen này vẫn đang được hình thành thêm. 6 - 1 gen NP điều khiển quá trình tổng hợp nucleoprotein (giúp phân biệt 3 loại A,B,C) - 1 gen M: điều khiển quá trình tổng hợp matrix protein - 1 gen NS: điều khiển quá trình tổng hợp non-structural protein - 3 gen còn lại là PA,PB1,PB2 là các thành phần tạo nên RNA polymerase Vậy có thể có 144 phân nhóm virus loại A (16 gen HA * gen NA). Virus H5N1 thuộc dòng virus cúm loại A có gen HA là H5 và gen NA1 là N1. để tiêu diệt H5N1 người ta tác động vào các gen HA và NA gây ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp các protein đặc hiệu của virus. Đây là cơ chế tác động của tamiflu. Gen Kích thước (nt) Polypeptide Chức năng 1 2341 PB2 Là tiểu đơn vị của polymerase (RNA transcriptase), nhận diện mũ chụp M7- GpppXm Nm của RNA tế bào chủ 2 2341 PB1 Là tiểu đơn vị xúc tác của polymerase (RNA transcriptase) 3 2233 PA Là tiểu đơn vị của polymerase (RNA transcriptase), tham gia tổng hợp RNA. 4 1778 HA Gắn kết virút vào thụ thể của tế bào (làm đông máu) (Hemagglutinin) 5 1565 NP Nucleo rotein: là thành phần của phức hiên mã, vận chuyển vRNA giữa nhân và tế bào chất. 6 1413 NA Phóng thích virút (Neuraminidase) M1 Protein nề , là thành phần chính của virion. 7 1027 M2 Protein nội màng, kênh ion. 7 5.Các tính chất của virus Sức đề kháng với các tác nhân lý hóa học: - Hạt virus bị phá hủy bởi ether và deoxycholate natri do nó có 20-30% lipid. - Ph thích hợp nhất là 6,5 – 7,9 - Virus chiệu nhiệt kém: ở 56oC – 60oC tính xâm nhiễm bị phá hủy trong một vài phút, nhưng hoạt tính ngưng kết hồng cầu vẫn được duy trì. Virus cúm có thể sống và truyền bệnh Bản chất của virus cúm là lipoprotein nên có sức đề kháng yếu và dễ bị mất hoạt bởi bức xạ mặt trời mặt trời có chứa tia tử ngoại , bởi nhiệt độ trên 56oC (trong vòng vài chục phút) và bởi các chất dung môi hòa tan lipid, chất khử trùng như formaldehyde, chloramin, cồn…tuy nhiên, virus cúm thường lẫn trong dịch xuất tiết của đường hô hấp và được bao bọc trong màng nhầy của chất này nên có thể sống lâu hơn ở môi trường bên ngoài, nhất là trong mùa lanh. Trong điều kiện này, nó có thể duy trì hoạt lực ở môi trường nhiều giờ hoặc 1-2 ngày. Với virus H5N1, có thể là đã thích ứng cao trên các loài chim hoang dã nên khả năng tồn tại ở môi trường có thể cao hơn:trong phân gia cầm tới hàng tháng, trong sản phẩm gia cầm bảo quản lạnh tới hàng năm. Chúng chỉ bị diệt ở 70oC trong 30 phút, hoặc ở môi trường acid, kiềm sau nhiều giờ. 6. khả năng gây bệnh của virus Virus cúm type A,B,C là tác nhân gây bệnh cúm ở người với những đặc điểm rất đặc biệt như: tính cảm thụ cao, thời gian ủ bệnh rất ngắn từ 1-2 ngày, bệnh diễn tiến nhanh chóng, gây ra một sức miễn dịch cao nhưung không lâu bền, lây truyền trực tiếp qua đường hô hấp. đó là những nguyên nhân làm cho bệnh cúm dễ lan tràn thành các vụ dịch lớn. a.sự lan truyền của virus trong cơ thể Virus vào cơ thể bằng đường hô hấp, nó xâm nhiễm các tế bào niêm mạc đương hô hấp trên gây thương tổn niêm mạc làm xuất hiện các phản xạ ho và hắt hơi. Quá trình phát triển của virus ở đường hô hấp trên dẫn tới sự phá hủy của các tổ chức liên bào, mở đường cho virus vào đường phế quản và vào phổi hay cũng có thể mở đường cho các vi khuẩn gây xâm nhiễm thứ phát khi các tổ chức tế bào đã mất hết khả năng tự vệ bình thường của nó. Đó là các thể viêm phổi do virus hay các biến chứng khác do nhiễm khuẩn thứ phát. Sơ đồ cách thức vi-rút cúm A tấn công vào tế bào của người bệnh và tiếp tục sinh sôi nảy nở NS1 Vận chuyển mRNA ra tế bào chất, dịch mã, là protein kháng interferon. 8 890 NS2 Vận chuyển RNP ra khỏi nhân 8 Định danh thủ phạm cúm gia cầm Vi-rút H5N1 nhìn dưới kính hiển vi điện tử b.hình ảnh lâm sàng Thường gặp là thể điển hình với các đặc điểm là: sau 1-2 ngày ủ bệnh xuất hiện sốt 38oC, rét run, sốt, đau khắp mình mẩy, suy nhược, tổn thương bộ máy hô hấp,khó thở, tím tái,cảm giác hụt hơi,thiếu hơi,giảm độ bão hòa oxi máu, tiêu chảy, phân nước, nhiều lần, bệnh khởi phát nhanh nhưng mệt mỏi kéo dài. Ngoài ra có thể gặp thể nặng với các triệu chứng của bệnh phế quản: phế viêm do virus hoặc nhiễm các vỉ khuẩn tụ cầu, liên cầu, phế cầu, Klebsiella pneumoniae… thường gặp ở người già và trẻ nhỏ với tỷ lệ tử vong cao. c.dịch tễ học Tiếp xúc trực tiếp với gia cầm như gà, vịt, chim bị bệnh trong vòng 7 ngày trước đó hoặc sống ở vùng gia cầm bị bệnh hơcj có tiếp xúc với người bị bệnh cúm. Bệnh lây trực tiếp qua đường hô hấp, thường gây dịch lớn, nhất là type A. dịch cúm thường xảy ra vào mùa đông xuân: vì bệnh cúm là bệnh của đường hô hấp, vị trí đột nhập đầu tiên của virus cúm là các tế bào đường hô hấp. trong điều kiện lạnh và ẩm thấp, các tế bào hô hấp của người dễ bị tổn thương, tạo diều kiện tốt cho bệnh cúm phát triển. Sau khi nhiễm bệnh cúm sẽ có miễn dịch đặc hiệu type kéo dài từ 6 tháng đến 3 năm. các type H và N khác nhau của các virus cúm có thể gây bệnh 9 cho người và nhiều động vật khác nhau. Một số thứ type thường gây bệnh ở người như H3N2, H1N1…riêng thứ type H5N1 của virus cúm A là loại bệnh ở gia cầm nhưng hiện nay đã vượt qua rào cản giới hạn thụ thể đặc hiệu loài để gây nhiễm ở động vật có vú và cả người. từ năm 1997 đến nay, dịch cúm A (H5N1) xảy ra liên tiếp ở nhiều nước Châu Á đặc biệt là Trung Quốc, Thái Lan, Việt Nam,… d.xét nghiệm X quang phổi: tổn thương là hình ảnh viêm phổi mô kẽ khu trú một bên, hoặc có hình ảnh tổn thương giống viêm phổi thùy,nhưng ranh giới không rõ, sau đó tiến triển nhanh lan tỏa sang hai bên. Cần chụp phổi nhiều lần(ít nhất 2 lần) trong ngày ở giai đoạn cấp. Xét nghiệm máu: Công thức máu: số lượng bạch cầu giảm (<3000/ml) với tế bào lympho giảm, tỉ lệ CD4,CD8 giảm. có thể có thiểu cầu giảm. Sinh hóa: Có tình trạng giảm oxi máu PaO2<85 mmHg (trường hợp nặng suy hô hấp PaO2<60mmHg) Nồng độ các cytokine trong máu tăng: IL6,IL8,IL1,a TNF,INF g… Vi sinh: Lấy dịch mũi họng hoặc nội khí quản và máu: làm PCR để định virus cúm cúm A,làm ELISA và ngưng kết hồng cầu thụ động để định dưới nhóm H5N1. Cấy máu, cấy dịch màng phổi, dịch nội khí quản khi nghi ngờ bội nhiễm. III. Phương pháp chẩn đoán bệnh 1.các xét nghiệm chân đoán Chẩn đoán chỉ dựa vào yếu tố dịch tể học, dấu hiệu lâm sàng và các dấu hiệu huyết học-sinh hóa vì độ nhạy của các test nhanh quá thấp. Các kỹ thuật để xác định chẩn đoán: xét nghiệm phân tử Phân lập virus Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang 2.Để xét nghiệm phát hiện virus H5N1, cần lấy bệnh phẩm gì? 10 Bệnh phẩm dùng cho xác định nhiễm H5N1 gồm: dịch hầu họng hoặc dịch phế quản; huyết thanh bệnh nhân trong giai đoạn cấp (huyết thanh 1), và giai đoạn hồi phục (huyết thanh 2, thu thập 10-15 ngày sau khi lấy huyết thanh 1). Những người thu thập bệnh phẩm là: Nhân viên phòng thí nghiệm đã được tập huấn về cách thu thập bệnh phẩm và phương pháp bảo hộ cá nhân; các bác sĩ lâm sàng (trong trường hợp bệnh nhân nặng cần hỗ trợ thở). 3.quy trình xét nghiệm để chẩn đoán (tại bệnh viện Nhiệt Đới) - A.xét nghiệm phân tử Có thể phát hiện RNA đặc hiệu cho H5N1 trong nhiều loại bệnh phẩm lâm sàng như máu, phân, chất tiết hô hấp hoặc các dịch cơ thể bằng phản ứng chuỗi polymerase (PCR). Một số cách thức tiến hành PCR do các thành viên của mạng lưới xét nghiệm WHO phát triển hiện sẵn cót trên website của WHO ( Hơn nữa, kit xét nghiệm RT-PCR 5’-nuclease chứa đoạn mồi và chứng dương tính và âm tính do Viện Bernhard Nocht ( et al.) phát triển hiện sẵn có trên thị trường ( Virus không có các AND nên cần có một giai đoạn tạo các AND. để làm đươc điều này ta dùng các enzym sao chép ngươc gọi là transcriptase inverse(retrotranscriptase). RT-PCR(Reverse transcrip – PCR) là phương pháp để phát hiện các ARN của virus. Hiện nay các phòng thí nghiệm trên thế giới và Việt Nam đang phát triển các phương pháp mới. real time PCR,...PCR có thể tiến hành ở các phòng thí nghiệm thông thường còn RT-PCR thường chỉ được thực hiện tại các phòng thí nhiệm có tổ chức chặt chẽ. Virus H5N1 trong các mẫu có tỉ lệ rất nhỏ do đó rất khó phát hiện, tuy nhiên nếu dùng các phương pháp nuôi cấy rất nguy hiểm vì dễ gây phát tán virus. Hiện nay đê phát hiện virus H5N1 trong mẫu cần khoảng 5-7 tiếng. Các nghiên cứu hiện nay đa số tìm cách giảm thời gian này. một phương pháp cải tiến là dùng một số đoạn AND mồi đặc hiệu. Real time RT-PCR -Đích: M gene -Probe IA Taqman -Độ nhạy: 10 copies -Chứng nội tại (EAV) -Bản định lượng. RT-PCR đặc hiệu với: - H5N1 - H3, N1 Real time PCR -đặc hiệu với H5 -Taqman độ nhạy 10 copies Vi trung hoà Phân lập Loại trừ cúm A huyết thanh 2 lần phết họng và mũi 11 A.1. Phản ứng chuỗi polime sao chép ngược (RT-PCR) Phản ứng chuỗi pôlime sao chép ngược (RT-PCR) là một kỹ thuật đầy tiềm năng để định loại kiểu gien của virus cúm. Kiểu gien của virut (gồm có chuỗi đơn RNA) trước hết phải được tách ra. Sau đó, trong sao chép ngược, các bản sao DNA của RNA nguyên gốc (cDNA) được tổng hợp nhờ một men sao chép ngược (RT). Trong bước tiếp theo, cDNA sử dụng polyme để khuyếch đại thành