Tiểu luận Chuẩn đoán Vius PMWS bằng kỹ thuật Elisa

Chuẩn đoán PMWS bằng Elisa  Chuẩn đoán bệnh  Page 1  Đại Học Nông Lâm TP.HCM Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học HH Ö II Bài tiểu luận: GVHD: TS. Nguyễn Ngọc Hải SV: Nguyễn Thị Kim Ngân MSSV: 06126088 10-2009 Chuẩn đoán PMWS bằng Elisa  Chuẩn đoán bệnh  Page 2  I. Đặt vấn đề: Năm 1996 xuất hiện một bệnh truyền nhiễm mới trên heo với tác nhân gây bệnh chuyên biệt (specific-pathogen-free) được phát hiện và thông báo tại miền tây Canada. PMWS (Post - Weaning Multisystemic Wasting Syndrome) đã trở thành một vấn đề nhận được nhiều sự quan tâm trên thế giới trong những năm qua, đặc biệt là tại Canada, Mỹ, Châu Âu và Viễn Đông. Phân bố PMWS trên thế giới Căn bệnh xảy ra được biểu thị rõ ràng như tên gọi của nó. Đó là triệu chứng còi cọc ở heo cai sữa ở 5-6 tuần tuổi đến khoảng 12 tuần tuổi và hiện nay được xem như một bệnh hàng đầu. Chuẩn đoán PMWS bằng Elisa  Chuẩn đoán bệnh  Page 3  Mặc dù căn bệnh diễn biến chậm nhưng tăng dần lên với mức độ nguy hại cao. Sau khi đàn heo nhiễm bệnh thì tỷ lệ chết có khi lên đến 90%. Hội chứng suy nhược, còi cọc trên heo sau cai sữa xảy ra với tỷ lệ chết cao và thiệt hại nặng nề về kinh tế cho nhà chăn nuôi. Mặt khác, khi đàn heo bị nhiễm thì tất cả các biện pháp điều trị đều không có kết quả. Hiện nay, vấn đề cấp thiết là làm sao để đàn gia súc và gia cầm của chúng ta không bị nhiễm trong khi vaccin phòng bệnh vẫn đang được các nhà khoa học nghiên cứu và chưa có kết quả. Có nhiều phương pháp chuẩn đoán bệnh hiệu quả như PCR, hóa mô miễn dịch, in situ hybridization, nuôi cấy tế bào, chuẩn đoán huyết thanh học…. trong bài tiểu luận này giới thiệu về phương pháp ELISA để xét nghiệm kháng thể kháng PCV2, phục vụ cho các nghiên cứu điều tra dịch tễ và đáp ứng miễn dịch của PCV2. II. Tổng quan: 1. Khái niệm: PMWS là một bệnh truyền nhiễm do virus (porcine virus type 2 thuộc họ Circoviridae) gây ra trên heo cai sữa với biểu hiện đặc trưng là sự sụt giảm cân rất nhanh, kèm theo các biểu hiện hô hấp và da nhợt nhạt. Heo bệnh thường hạch hẹn bị sưng to và có thể sử dụng làm dấu hiệu nghi ngờ trong chuẩn đoán PMWS. Bệnh gây chết chủ yếu ở heo lứa tuổi từ 5-12 tuần tuổi. PMWS hiện tại đang hiện diện ở nhiều quốc gia và là một trong những nguyên nhân quan trọng gây tổn thất treo heo. 2. Tác nhân gây bệnh: − Virus PMWS là một DNA mạch vòng, sợ đơn bao gồm 1759 bases, kích thước 17 nm, thuộc họ Circoviridae, giống Circovirus thường được gọi là porcine circovirus (PVC). Gồm có 2 serotype được tìm thấy ở heo, bao gồm type 1 (PVC1) và type 2 (PVC2). PVC1 và PVC2 với bộ nhiễm sắc thể tương đồng khoảng 68-76%, trong đó ORF1 tương đồng khoảng 83% về trình tự nucleotide và 86% acid amin, ORF2 chỉ tương đồng khoảng 67% về trình tự nucleotide và 65% acid amin. − Bộ gen của PVC gồm có sáu khung đọc mở (open reading frames-ORFs). ORF aa 1 51-992 2 671-360 3 565-389 4 553-729 5 1016-1174 6 1735-1037 Chuẩn đoán PMWS bằng Elisa  Chuẩn đoán bệnh  Page 4  − ORF1 mã hóa cho protein tham gia vào quá trình nhân lên của virus và ORF2 mã hóa cho protein cấu trúc của virus. Chuẩn đoán PMWS bằng Elisa  Chuẩn đoán bệnh  Page 5  − Là loại virus nhỏ nhất được biết đến và có khả năng sống sót cao trong môi trường. − PCV có khả năng đề kháng với môi trường acid (pH=3), chloroform hay nhiệt độ cao 56-70oC (virus chịu được 70oC trong 15 phút). − PCV tồn tại lâu dài trong sản phẩm thịt heo, quần áo và những vật liệu tiếp xúc với heo bị nhiễm virus này. − PCV1 được xem như là virus nhiễm thường xuyên và tự nhiên trên các tế bào thận heo PK15 và là virus không gây bệnh. Ngược lại PCV2 được xem là tác nhân gây PMWS. a. Circovirus type 1 (PVC-1): − Năm 1974, các nhà khoa học đã phân lập được Circovirus type 1 từ tế bào thận heo PK15. − Hiện nay, chúng không gây bệnh cho heo. b. Circovirus type 2 (PVC-2): porcine circovirus type 2 − Được ghi nhận đầu tiên vào 1991 tại Tây Canada, phát hiện ở vết thương Chuẩn đoán PMWS bằng Elisa  Chuẩn đoán bệnh  Page 6  − Bao gồm nhiều chủng khác nhau (kiểu sinh học và kiểu gen). Kháng thể trên PVC-2 đã được phát hiện ở huyết thanh heo nuôi tại Bỉ năm 1985. − Từ những kinh nghiệm nghiên cứu ban đầu cho thấy, khi gây nhiễm virus type 2 lên heo, heo sẽ biểu hiện những tổn thương đặc trưng của bệnh. Tuy nhiên, nếu một loại virus khác như Parvovirus heo (PPV) hay PRRSV được tiêm vào cùng một lúc thì heo cũng mang những biểu hiện tương tự. Những nguyên nhân gây ra bệnh thường là do nhiễm PCV type 2 hay một vài loại virus khác nhưng không phải tất cả heo bị nhiễm PCV và PPRS không có biểu hiện bệnh lý PMWS. − Những nghiên cứu về huyết thanh tại Châu Âu và Bắc Mỹ cho thấy, sự lây nhiễm lan rộng trong đàn heo nhưng chỉ một phần nhỏ đàn có huyết thanh dương tính là từng biểu hiện bệnh lý. Điều này có vẻ như hầu hết những ca lây nhiễm có biểu hiện ngầm với bệnh. Heo con có thể bị nhiễm trước khi cai sữa. − Không phải heo nào nhiễm PCV2 cũng đều đưa đến bệnh PMWS, thường nó kết hợp với nhiều yếu tố. ¾ PCV2 kết hợp với tác nhân virus: PRRS, SIV (Swine Influenza Virus), PPV (Procine Parvo Virus). ¾ PCV2 kết hợp với tác nhân vi khuẩn: Mycoplasma hyopneumoniae. Streptococcus suis, Pasteurella multocida,… ¾ Những cuộc nghiên cứu cho rằng heo bị nhiễm PCV2 đều gây ra sự thiếu hụt miễn dịch. Nét đặc trưng của miễn dịch ở thể lâm sàng trong bệnh PMWS là sự suy yếu rõ ràng của tế bào lympho từ mô lympho và đại thực bào. Nghiện cứu của Darwin, cho rằng các tế bào CD4+, tế bào CD8+ giảm đáng kề trên heo nhiễm. Những nghiên cứu khác thì thấy giãm cả hai loại tế bào lympho B và T. porcine circovirus infection Chuẩn đoán PMWS bằng Elisa  Chuẩn đoán bệnh  Page 7  3. Nguyên nhân lây nhiễm: − Nhiễm từ tinh dịch heo bệnh, phân, phương tiện, vật dụng (quần áo, xe đẩy,…) hay từ những loài khác (Chuột, Chim,…) − Tiếp xúc giữa heo bệnh với heo khỏe mạnh. − Do Stress (trong quá trình vận chuyển, thay đổi môi trường, thay đổi chuồng trại,… − Do nhập nhiều heo với các độ tuổi khác nhau và chăn nuôi với mật độ dày đặc − Do thú sản xuất liên tục. 4. Triệu chứng: a. Heo cai sữa và heo trưởng thành: − Sốt 41 - 42 oC, đột tử, có thể xuất hiện những triệu chứng thần kinh. − Sụt cân, hốc hác, lông thô ráp, da tái nhợt, đôi khi bị vàng da, chậm phát triển (giai đoạn 6-8 tuần tuổi) và tai bị đổi màu. − Một số trường hợp, bệnh thường kèm với một số triệu chứng về hô hấp (khó thở do viêm phổi) và tiêu hóa (30% trường hợp bị tiêu chảy và loét dạ dày. − Ngoại vi hạch bạch huyết sưng to, đặc biệt là giữa hai chân sau của heo. Nếu ta dựng đỡ heo lên thì có thể thấy hạch bẹn có kích cỡ lớn như một quả banh golf. − Thường phát hiện triệu chứng viêm da suy thận (PDNS) trong những đàn bị PMWS. − Tỉ lệ heo cai sữa chết khoảng từ 6-10% nhưng thông thường cao hơn (20%). Tỉ lệ chết ở heo lớn hơn có thể lên đến 10%. − Những ca bệnh có thể kéo dài trong một đàn nhiều tháng. Chúng thường đạt đến đỉnh điểm sau 6-12 tháng và sau đó giảm từ từ. PVC2 Severe Systemic Infection Clinical Signs Chuẩn đoán PMWS bằng Elisa  Chuẩn đoán bệnh  Page 8  Heo chết PMWS PVC2 Severe Systemic Infection Clinical Signs b. Heo nái và heo con: − Những con heo trưởng thành, heo nái và heo con không bị ảnh hưởng . − Hiếm khi một con heo mới thôi bú bị ảnh hưởng bệnh cho đến khi nó được 6 tuần tuổi. Chuẩn đoán PMWS bằng Elisa  Chuẩn đoán bệnh  Page 9  − Đôi khi những triệu chứng xảy ra tương tự như trên nhưng là do thú bị suy sinh dưỡng, thiếu nước, loét dạ dày, viêm ruột non do trực khuẩn, bệnh lý, PRRS và những bệnh khác… Lúc đó, chúng ta phải biết loại trừ nếu bệnh xảy ra cùng lúc hay theo sau PMWS. Mối quan hệ của hệ bệnh này không được hiểu rõ nhưng mỗi bệnh có thể xuất hiện trong các đàn mà không cần có bệnh kia. 5. Bệnh tích đại thể: − Xác súc vật bị gầy và da vàng hay xanh xao, hoàng đản, viêm gan, thận sưng lớn đồng thời phù thủng. − Lách và nhiều hạch bạch huyết sưng to. Tuy nhiên, vẫn phải đặt nghi vấn trong những trường hợp hình ảnh tuyến bạch huyết sưng to. − Thân bị sưng phồng với những đốm trắng nhỏ có thể quan sát bằng mắt từ bề mặt. − Phổi thường dính, có đốm phù nề, có vằn và dai. − Ngực, mô và cơ quan ổ bụng bị phù nề hay úng nước. Phổi cứng cáp có tính chất giống như cao su, có vằn nâu nhạt, có màu nâu của PCV2 antigen Chuẩn đoán PMWS bằng Elisa  Chuẩn đoán bệnh  Page 10  6. Bệnh tích vi thể: Bệnh tích thường thấy ở tế bào lympho….. III. Phương pháp chuẩn đoán: Chuẩn đoán bệnh PMWS hơi khó khăn hơn vì bản thân PCV2 có thể hiện diện cả trên heo khỏe (dựa trên kết quả các điều tra hồi cứu, với kỹ thuật lai in situ người ta đã xác định sự xuất hiện của virus PCV2 từ những năm 1986, gần 10 năm trước khi người ta ghi nhận ca bệnh lâm sàng). Nên việc phát hiện PCV2 một mình không đủ cơ sở để kết luận thú bị PMWS. Vì thế trong chuẩn đoán PMWS cần đảm bảo 3 yêu cầu: i. Các dấu hiệu lâm sàng. ii. Bệnh tích vi thể. iii. PCV2 hiện diện trong mẫu bệnh phẩm. 1. Các phương pháp chuẩn đoán: − Biểu hiện lâm sàng thường gặp gồm thú gầy cồm, giảm tăng trọng, sức khỏe kém, có thể kèm theo chúng khó thở và hoàng đản. − Bệnh tích mổ khám bao gồm suy yếu các hạch lympho và tiêm nhiễm tại các cơ quan khác. Chuẩn đoán PMWS bằng Elisa  Chuẩn đoán bệnh  Page 11  − Chuẩn đoán huyết thanh học rất hữu ích để xác định tình trạng nhiễm PCV2. Kháng thể có thể được phát hiện bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, peroxidase miễn dịch gián tiếp và phương pháp ELISA. − Có thể phát hiện virus trong mẫu mô bằng kỹ thuật hóa học miễn dịch tế bào (IHC-Immunohistochemistry) và phương pháp nhân virus tại chỗ (ISH- In situ hybridisation) hoặc phương pháp nuôi cấy tế bào. − Phương pháp PCR. − Phương pháp phân lập virus cũng được áp dụng. 2. Chuẩn đoán virus PMWS bằng ELISA: a. Giới thiệu về Elisa: Elisa là phương pháp test phát hiện nhanh mầm bệnh và kháng thể dựa trên phản ứng kháng nguyên kháng thể. Phương pháp này nhanh và nhạy dễ thực hiện. Các phương pháp Elisa: 9 Elisa indirect. 9 Sandwich Elisa. 9 Elisa cạnh tranh. b. Phát hiện kháng thể cấu trúc protein PCV2 bằng ELISA indirect Kháng thể đặc hiệu PCV2 được phát hiện bằng Elisa pha đặc cứng, sử dụng Elisa 96 giếng màng mỏng với một phần nhỏ PCV2 được tinh sạch. Virus được tinh sạch dưới gradient CsCl gián đoạn. Chất lượng và nồng độ của virus được tinh sạch được đánh giá bởi thuật soi hiển vi điện tử (Electronic microscopy) và đọc quang phổ chất hấp thụ (Absorbance spectra reading). Trong một thời gian ngắn, 96 giếng vi tiêm màng mỏng (Corning, USA) được tẩm qua đêm ở 4oC với 1,25 µg/ml virus PCV2 được tinh sạch bởi màng carbonate trong 16 giờ. Sau thời gian ủ bệnh đĩa được rữa bằng PBST (PBS pH 7,4 và Tween-20 0,05%) và sau đó đĩa thí nghiệm được giữa nhiệt độ phòng cộng với 2% sodium casein trong buffer dùng để rửa. 100 µl mẫu huyết thanh được pha loãng tỷ lệ 1:20 trong PBST được thêm vào mỗi giếng. Huyết thanh mẫu được test in duplicate và mẫu huyết thanh đối chứng dương và đối chứng âm. Đối chứng dương bao gồm huyết thanh chuột siêu miễn dịch được tiêm virus tinh sạch và đối chứng âm bao gồm huyết thanh chuột được tiêm plasmid trống (plasmid không mang DNA của virus gây bệnh). Huyết thanh được ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ và sau đó rửa năm lần với buffer PSB bao gồm 0,1% Tween-20. Các đĩa được ủ thêm với peroxidase củ cải đen kết hợp với kháng thể thỏ kháng kháng thể chuột IgG pha loãng tỷ lệ 1:8000 để nhiệt độ phòng. Mỗi đĩa được rữa lại và được ủ với 0,1M Na2CO3 buffer (pH 5,0) gồm có 2,2nM O-phenylenediamine và 0,045% H2O2 ở Chuẩn đoán PMWS bằng Elisa  Chuẩn đoán bệnh  Page 12  nhiệt độ phòng trong 15 phút. Phản ứng được hoàn thành với 2M H2SO4 và mỗi đĩa được đọc ở bước sóng 492nm trong Microplate Reader 3550 (Bio-Rad). Ngưỡng giá trị OD (Optical Density) cho huyết thanh dương tính được xác định, tính toán dựa vào ý nghĩa mật độ quang học (OD) của huyết thanh đối chứng âm cộng với độ lệch hai chuẩn (S.D). ™ Các bước thực hiện: 1. Chuyển Kháng Nguyên (KN) đã biết lên bề mặt cứng ( được gọi chung là các đĩa). KN sẽ được cố định trên bề mặt. 2. Chuyển các mẫu KN chưa biết vào các giếng khác. KN chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu KN chuẩn. 3. Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết thanh bê (bovine serum albumin) hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa. 4. Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. Kháng Thể (KT) sẽ kết hợp với các KN đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết thanh. 5. Thêm KT thứ cấp (secondary antibody) kết hợp với enzyme phản ứng cơ chất. 6. Rửa đĩa, các kháng nguyên gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ. 7. Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại). 8. Đọc kết quả máy Elisa 490-495nm Chuẩn đoán PMWS bằng Elisa  Chuẩn đoán bệnh  Page 13  ™ Sơ đồ quy trình phản ứng: Kháng nguyên (PCV2) gắn vào bề mặt đĩa Ủ (qua đêm, 4oC) Rửa (PBST) Ủ (to phòng với 2% sodium casein) Mẫu+đối chứng dương, âm Thêm horseradish peroxidase + IgG Ủ (to phòng -2 Rửa Ủ (0,1M Na2CO3 buffer) Hoàn thành pứ với 2M H2SO4 Đọc kết quả ở 492nM (Microplate Reader 3550 (Bio-Rad)) Chuẩn đoán PMWS bằng Elisa  Chuẩn đoán bệnh  Page 14  Microtiter Máy đọc Elisa Máy pha loãng máu theo thể tích IV. Kết luận: PMWS là bệnh nguy hiểm treo heo gây thiệt hại nặng cho người chăn nuôi nên các biện pháp pháp hiện bệnh cần được nghiên cứu và pháp triển để góp phần chuẩn đoán sớm bệnh và điều trị bệnh. Một số kỹ thuật đã được sử dụng: − Kỹ thuật hóa mô miễn dịch − Bệnh tích mô − PCR (Polymerase Chain Reaction) − ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) − IFA (indirect fluorescent antibody) … Chuẩn đoán PMWS bằng Elisa  Chuẩn đoán bệnh  Page 15  Và để xác định chính xác bệnh PMWS thì cần kết hợp các phương pháp lại với nhau để cho kết quả chính xác. Ví dụ: phản ứng Elisa chỉ phát hiện ra kháng thể PCV2 nhầm phục vụ cho các nghiên cứu dịch tễ học và đáp ứng miển dịch của PCV2. V. Tài liệu tham khảo: 1. Công nghệ sinh học trong thú y - Nguyễn Ngọc Hải, nhà xuất bản nông nghiệp, tr 52-54, tr 103-107. 2. Luận văn tốt nghiệp: Phát hiện Porcine circovirus Type 2 bằng kỹ thuật PCR trên heo nghi mắc hội chứng gầy còm sau cai sữu. 3. Luận văn tốt nghiệp: Bước đầu khảo sát tình hình nhiễm Porcine circovirus trên đàn heo nuôi tại một số tĩnh thành phía nam. 4. 5. www.google.com