Tìm hiểu đặc tính phân tử salmonella enterica serovar typhi

BỘ CÔNG THƯƠNGTRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCMKHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨMGVHD: PHAN THỊ KIM LIÊN SVTH: Lớp 02DHLTP4NGUYỄN THỊ KIM LIÊN: 2205112012LÝ MINH TUẤN: 2205112205VÕ MINH QUỐC: 2205112212TẠ THỊ VUI: 2205112214TỔNG QUAN1VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁP2G3 KẾT LUẬN555BÀN LUẬN4KẾT QUẢMỤC ĐÍCH+Salmonella enterica serovar Typhi là 1 trong những nguyên nhân gián tiếp gây bệnh sốt thương hàn cho loài người trên phạm vi toàn cầu.+Công việc nghiên cứu này được thực hiện nhằm khám phá đặc điểm phân tử của Salmonella enterica serovar Typhi được phân lập từ người sốt thương hàn bằng phương pháp hóa sinh, sinh học và phát hiện gien độc hại dựa vào kỹ thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR). TỔNG QUANTỔNG QUAN+Việc phân lập chuyên sâu cũng khám phá ra loại thuốc kháng sinh nhạy với khuôn như là một tiêu chuẩn để đánh giá trong việc quản lý.TỔNG QUANPHƯƠNG PHÁP & KẾT QUẢ+Có tổng số 16 mẫu bệnh phẩm được thu nhận từ số người bệnh như nhau (7 nam và 9 nữ) từ các quận Coimbatore, Erode, Salem của Tamil Nadu và được xử lý bằng cách cho S.enterica serovar Typhi phát triển trên môi trường via dể nhận diện và phân lập.+Các nghiên cứu vi sinh và hóa sinh đã phát hiện sự hiện diện của S.Typhi từ 16 mẫu bệnh phẩm.TỔNG QUAN+Các biotype của các mẫu phân lập cho thấy tất cả đều thuộc biotype IV.+Phân tích PCR đã xác nhận sự có mặt của invA (gien xâm chiếm, 244bp), tyv (gien đồng tâm lập thể, 615bp), fliC-d (gien tiên mao thực khuẩn 1 sinh kháng thể d, 750bp) và viaB (gien kháng thể Vi, 439bp) trong tất cả 16 mẫu bệnh phẩm.TỔNG QUAN+Việc thử nghiệm thuốc kháng sinh nhạy cảm cũng được tiến hành tương phản riêng biệt giữa 12 tác nhân chống vi khuẩn, cho thấy 100% ampicillin có sức đề kháng tốt nhất, 100% carbenicillin, chloramphenicol, clindamycin, gentamycin, kanamycin và tetracycline có độ nhạy tốt nhất.KẾT LUẬN, Ý NGHĨA VÀ TÁC ĐỘNG CỦA NGHIÊN CỨU+Việc nghiên cứu đã xác nhận có sự liên hệ giữa giống S. enterica serovar Typhi từ bệnh sốt thương hàn với con người và cho rằng phương pháp chẩn đoán PCR sẽ mang lại nhiều lợi ích trong việc nhận diện nhanh các mẫu phân lập S.Typhi +Nghiên cứu cũng nhấn mạnh việc sử dụng thuốc kháng sinh như chloramphenicol hoặc kết hợp các loại thuốc kháng sinh khác nhau sẽ mang lại hiệu quả hơn trong việc chế ngự S.Typhi.TỔNG QUANVẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁPTHU THẬP MẪU+16 mẫu máu của bệnh nhân (7 nam và 9 nữ từ các bệnh viện và các phòng khám khác nhau ở các quận Coimbatore, Erode, Salem của Tamil Nadu, Ấn Độ) được thu thập trong trong suốt tháng 1 và tháng 2 phải được vô trùng trước khi điều trị bằng kháng sinh.+Các mẫu máu được vận chuyển trong thùng đá lạnh và được xử lý ngay lập tức để nghiên cứu. +Các dữ liệu của mỗi bệnh nhân cũng được gửi đi.PHÂN LẬP&NHẬN DẠNG+Cho 3÷5ml máu vào 30ml nước thịt pha với dịch tim óc (tỷ lệ tối thiểu huyết và nước thịt phải được duy trì với tỉ lệ 1:10)+Máu sau khi cấy vào nước thịt sẽ được ủ ở 370C trong 7 ngày+Tất cả các ống nghiệm đều được kiểm tra hằng ngày và nếu quan sát thấy có sự phát triển của vi sinh vật thì cấy sang môi trường XLD trong đĩa petri và ủ tiếp ở 370C trong 24 giờ.VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁPVẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁP+Nhóm vi khuẩn được chọn lọc căn cứ vào kích cỡ, hình dạng, màu sắc trên thạch XLD và sự tan máu trên thạch máu và phải bắt màu Gram.+Vi sinh vật phân lập được nhận dạng dựa vào tiêu chuẩn xét nghiệm hóa sinh như: thử nghiệm tính di động, khả năng sử dụng citrate, thử nghiệm methyl red và VP, sinh khí H2S, khả năng lên men mannitol, arabinose, sorbitol, dulcitol, lactose, sucrose, glucose.CHỦNG PHÂN LẬP+Việc phân lập nhằm thử nghiệm khả năng lên men L-arabinose và xylose.+Các giống S.Typhi có thể được phân loại như sau: byotypes I (arabinose-, xylose+), II ( arabinose-, xylose-), III ( arabinose+, xylose+) và IV ( arabinose+, xylose-).VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁPVẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁPMÁY QUÉT ĐIỆN TỬ+Các vi khuẩn được cho phân lập trên đĩa thạch dinh dưỡng, sẽ được cố định bằng chất hãm màu Karnovsky (pH 7.3) và được ủ ở 4oC trong 4 giờ.+Mẫu được rửa 2 lần bằng dung dịch đệm Sodium Cocodylate 0,1M (pH 7.4); mỗi lần rửa ở 40C trong 15 giây, mỗi dung dịch rửa được ổn định trong 12 giờ ở 40C, khử nước từ 30÷100% ở nhóm acetone, mỗi lần khử trong 15 giây ở 4oC.+Các mẫu được làm khô bằng dung dịch tetra methyl silane trong 15 giây ở 4oC và bao kín không khí khô trong 15 giây.VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁP+Các mẫu được cho vào khung nhôm, mẫu sẽ bám vào và phủ lớp carbon trong 5 giây, và được máy quét điện tử phân tích bằng tia polaron.VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁPPHÁT HIỆN GIEN ĐỘC BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR+Gien độc của vi sinh vật được nghiên cứu bằng cách phát hiện gien xâm chiếm (invA), gien tiên mao thực khuẩn 1 của kháng nguyên d (fliC-d), gien đồng tâm lập thể tyvelose (tyv) và gien kháng nguyên Vi (viaB) bằng phương pháp PCR.+Gien invA được phát hiện bằng gien đơn PCR, ngược lại nhiều thành phần PCR được sử dụng để phát hiện fliC-d, tyv và gien viaB.VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁP+Các gien xuôi và gien ngược luôn đi đôi với nhau như gien invA của 244bp là 5’-acagtgctcgttacgacctgaat-3’ và 5’-agacgactggtactgatcgataat-3’; các gien fliC-d của 750bp là 5’-aatcaacaacaacctgcagcg-3’ và 5’-gcatagccaccatcaataacc-3’; gien tyv của 615bp là 5’-gaggaagggaaatgaagctttt-3’ và 5’-tagcaaactgtctcccaccatac-3’ và gien viaB của 439bp là 5’gttatttcagcataaggag-3’ và 5’-cttccataccactttccg-3’ bằng cách tổng hợp thương mại.VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁP+S. enterica serovar Typhi (MTCC 733) và Aeromonas hydrophila (MTCC 646) được dùng để nhận biết dương tính hay âm tính.+ Cho vi sinh vật phát triển trong 200µl nước cất vô trùng trong 1 ống ly tâm nhỏ, sẽ được ly tâm nhẹ và đun sôi 10 giây trong bể nước.+Các vi sinh vật sẽ xuất hiện trên bề mặt sau khi ly tâm ở 10000rpm trong 5 giây và sẽ được dùng như là 1 mẫu DNA.VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁP+Khuếch đại 25µl của 2 hỗn hợp PCR chứa 4mM MgCl2 + 0,4mM dNTPs + 0,5U Taq DNA polymerase + 150mM tris HCl, pH 8,5 + 1µM mồi đặc hiệu (tyv-F, tyv-R, fliC-d-F và fliC-d-R) và 0,2µM mồi đặc hiệu (viaB-F và viaB-Lane P: đối chứng khẳng định (S. enterica serovar Typhi MTCC 733)) và 2,5µl mẫu DNA . +Các phản ứng PCR sẽ được thực hiện trong một chu kỳ nhiệt.+Gien invA sau khi được biến tính ban đầu ở 94oC trong 4 giây sẽ được khuếch đại trong 1 chu kỳ gồm các bước: biến tính ở 94oC trong 30 giây, lai ở 56oC trong 30 giây, tổng hợp ở 72oC trong 2 giây.VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁP+Đối với gien fliC-d, tyv và viaB, sau khi được biến tính ban đầu ở 95oC trong 4 giây thì được khuếch đại trong 1 chu kỳ gồm các bước: biến tính ở 95oC trong 30 giây, lai ở 55oC trong 60 giây, tổng hợp ở 72oC trong 90 giây.+Cuối cùng là tổng hợp ở 72oC trong 10 giây.+Mẫu sản phẩm PCR (5µl) được điện di trên gel agarose 1,5% trong dung dịch đệm TAE (Tris-acetic acid-EDTA, pH 8) bị đổi màu bởi dung dịch ethidium bromide và được quan sát bằng máy gel doc system.THỬ NGHIỆM THUỐC KHÁNG SINH NHẠY CẢM +Thử nghiệm kháng sinh nhạy cảm được thực hiện bằng phương pháp đĩa khuếch tán ánh sáng với biến đổi nhỏ. +Vi sinh vật được cấy vào dung dịch đệm peptone sẽ được trải mỏng trên môi trường thạch dinh dưỡng trong đĩa.VẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁPVẬT LIỆU&PHƯƠNG PHÁP+Thành phần của đĩa kháng sinh gồm có các chất sau: Gentamycin 10g), Cefuroxime (30g), Penicillin-G (2U/ml), acid nalidixic (30g), Clindamycin (10g), Carbenicillin (100g), Cephalothin (30g), Kanamycin (30g), Nitrofurantoin (100g), Tetracylin (30g), Ampillicin (10g) và Chloramphenicol (30g).+Mức độ kháng được đưa ra bởi Ủy ban Quốc gia về tiêu chuẩn phòng thí nghiệm được sử dụng như là 1 tiêu chuẩn để đối chứng Gram âm của S. enterica serovar Typhi (MTCC 733) và A. hydrophila (MTCC 646).PHÂN LẬP&NHẬN DẠNG+Sự phát triển của vi sinh vật có thể quan sát thấy được trong môi trường BHI ở ngày thứ 7 giai đoạn ủ.+Chất không tan máu được tìm thấy trong mẫu trên môi trường thạch XLD xuất hiện các quầng màu hồng, tâm đen. +Các vi sinh vật phân lập đều lên men glucose, mannitol , L-arabinose và sorbitol.KẾT QUẢKý hiệu mẫuKý hiệu phân lậpTuổiBệnhNgày bắt đầu bệnhNơi lấy mẫuBiotypePhát hiện gien độc bằng PCRM4367HST112 (Nam)Sốt thương hàn7Phòng khámSalemIVĐều dương tính với gien invA, tyv, fliC-d, viaBF5673HST250 (Nữ)7M5778HST323 (Nam)872632BCHST416 (Nam)574675BCHST518 (Nữ)5Bệnh việnCoimbatore7489BCHST615 (Nam)875034BCHST722 (Nữ)5F7861HST820 (Nữ)5F7968HST916 (Nữ)7Phòng khámErodeM7988HST1021 (Nam)6M8011HST1117 (Nam)875267BCHST1222 (Nữ)8F8567HST1350 (Nữ)7Bệnh viện CoimbatoreM8876HST1423 (Nam)8Phòng khámSalem7568BCHST1516 (Nữ)5Phòng khámCoimbatore75899BCHST1618 (Nữ)5KẾT QUẢ+Trên môi trường thạch nghiêng, ở góc nghiêng xuất hiện 2 màu vàng và đỏ riêng biệt, cho thấy chỉ có glucose lên men và tạo môi trường acid. +Sinh ra khí H2S trên thạch XLD nhưng trên thạch TSI thì lại không sinh khí H2S.+Các vi khuẩn phân lập cho kết quả: dương tính với thử nghiệm oxy, methyl red; âm tính với thử nghiệm sinh indol, sinh ure và khả năng sử dụng citrate.+Tất cả các phân lập được tìm thấy là Gram âm , có tiên mao di động. +Theo nhiều chi tiết trong nghiên cứu vi sinh vật dựa vào thử nghiệm hóa sinh, thì 16 mẫu thí nghiệm được nhận biết là S.Typhi.*KẾT QUẢHình 1: S.Typhi trên môi trường thạch XLD xuất hiện các quầng màu hồng có tâm đenCHỦNG PHÂN LẬPVi sinh vật trong 16 mẫu đều lên men L – arabinose nhưng không lên men xylose.Giống S.Typhi được phân lập thuộc loại biotype IV. KẾT QUẢKẾT QUẢKHẢO SÁT BẰNG MÁY QUÉT ĐIỆN TỬ+Các nghiên cứu phi cấu trúc của S.Typhi bằng máy quét quan sát được cho thấy có dạng hình que.+Các vi khuẩn hình que quan sát được cho thấy có sự thay đổi chiều dài, đôi khi xuất hiện chồi đơn hoặc chồi đôi và thỉnh thoảng cũng xuất hiện chuỗi xoắn.PHÁT HIỆN GIEN ĐỘC BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR+Trong phân tích PCR, sự khuếch đại các gien độc từ 16 mẫu thí nghiệm bằng các mồi của gien invA, tyv, viaB, fliC-d tạo các vạch riêng biệt tại 244bp, 615bp, 439bp, 750bp.Hình 2: Siêu cấu trúc của S.Typhi dưới kính quét điện tửPhát hiện gen invA (244bp) bằng PCRPhát hiện gen tyv (615bp), fliC-d (750bp) và viaB (439bp) bằng mPCRCột N: đối chứng âm (A.hydrophila MTCC 646)Cột 1÷5: khu vực dương tính với gien độc Cột M: dãy DNA gốcHình 3: Phát hiện các gen độc từ S.Typhi bằng phương pháp PCRThử nghiêm tính nhạy cảm kháng sinh +Trong nghiên cứu này, tất cả 16 mẫu (100%) đều kháng với ampillicin, nhạy vừa phải với acid nalidixic, nitrofurantoin, carbenicillin, chloramphenicol, clindamycin, gentamycin, kanamycin và tetracycline . +13 mẫu (81,25%) kháng cefuroxime, 3 mẫu (18,75%) là nhạy vừa phải với cefuroxime. +11 mẫu (68,75%) kháng penicillin-G và cephalothin, 5 mẫu còn lại (31,25%) nhạy vừa phải với penicillin-G và cephalothin.KẾT QUẢ Hình 4: Độ nhạy kháng sinh của S.Typhi C: Chloramphenicol (30µg), Cu: Cefuroxime (30µg), A: Ampillicin (10µg), Na: Nalidixic acid (30µg), Ch: Cephalothin (30µg), T: Tetracycline (30µg), Cb: Carbenicillin (100µg), Cd: Clindamycin (10µg), G: Gentamycin (10µg), Nf: Nitrofurantoin (100µg), P: Penicillin-G (2 Units), K: Kanamycin (30µg)NHẠY CẢMKHÁNGNHẠY CẢM VỪA206080100 C: Chloramphenicol (30µg), Cu: Cefuroxime (30µg), A: Ampillicin (10µg), Na: Nalidixic acid (30µg), Ch: Cephalothin (30µg), T: Tetracycline (30µg), Cb: Carbenicillin (100µg), Cd: Clindamycin (10µg), G: Gentamycin (10µg), Nf: Nitrofurantoin (100µg), P: Penicillin-G (2 Units), K: Kanamycin (30µg)Hình 5: Kết quả thử nghiệm tính nhạy kháng sinh của S. enterica serovar TyphiPCCuANaTGNfKCdCbChNhạyKhángNhạy vừa40100060BÀN LUẬN+Trong nghiên cứu này, các mẫu máu được thu thập từ 16 bệnh nhân tuổi từ 12 đến 50 từ các quận Coimbatore, Erode, Salem của Tamil Nadu, Ấn Độ.+Tất cả các mẫu bệnh phẩm đều được thu thập trong suốt tháng 1, tháng 2 và cuối mùa khô, được xem là mùa cao điểm của sốt thương hàn.+ Các nguồn gốc gây bệnh và ảnh hưởng tới sức khỏe gồm 5 chữ F: food (thực phẩm), fingers (các ngón tay), flies (ruồi), fomites (mầm bệnh), faeces (phân) đóng vai trò quan trọng trong việc lây bệnh.BÀN LUẬN+Tất cả 16 bệnh nhân được chẩn đoán dương tính với bệnh thương hàn bắt đầu bệnh từ 5 đến 8 ngày, trong đó có 14 mẫu (87,5%) bị tấn công cao gồm những người dưới 30 tuổi.+Tương tự với báo cáo này thì những trường hợp tần số xảy ra bệnh thương hàn cao ở những bệnh nhân dưới 30 tuổi cũng được phát hiện trước báo cáo của Tamil Nadu.BÀN LUẬN+Tất cả các mẫu vi sinh vật phân lập đều tạo vùng màu hồng và tâm đen trên đĩa XLD và cho kết quả dương tính khi lên men mannitol, L-arabinose, sorbitol, glucose, thử nghiệm methyl red, thử nghiệm indol, thử nghiệm sinh khí H2S, khả năng sử dụng citrate, thử nghiệm oxy, thử nghiệm tính di động và thử nghiệm urease.+Nghiên cứu vi sinh cũng đã xác nhận việc phân lập để thăm dò S.Typhi từ các trường hợp bệnh thương hàn của người bệnh đã có trước báo cáo. BÀN LUẬN+Tất cả 16 mẫu được xếp vào biotype IV đều lên men L-arabinose nhưng không lên men xylose.+Biotype này được thêm vào dữ liệu nghiên cứu bệnh dịch dựa vào hệ thống sắp xếp theo khả năng lên men đường và dựa trên các thuộc tính hóa sinh khác.+Trong PCR thì gien invA, tyv, fliC và viaB được xem là mục tiêu cho gien độc, từ đó làm cơ sở cho việc nhận dạng S.Typhi, sẽ bộc lộ 100% điều cần khám phá trên các gien độc của mẫu bệnh phẩm phân lập từ người bệnh thương hàn. BÀN LUẬN+Mặc dù Salmonella gây bệnh gián tiếp bằng các yếu tố độc, nhưng vai trò của gien invA rất có ý nghĩa vì gien này giúp S.Typhi tham gia vào việc xâm chiếm các mô tế bào chủ chốt.+Nghiên cứu này cũng chứng minh gien invA chiếm ưu thế so với 3 gien còn lại trong phân lập S.Typhi, gien này có thể sử dụng như là 1 gien nổi bật để phát hiện nhanh S.Typhi bất chấp trong mẫu có nhiều loại vi sinh vật khác nhau.BÀN LUẬN+Tương tự 100% tần số phát hiện của gien inv giữa các giống S. enterica như Typhi, Virchow, Enteritidis, Typhimurium, Senftenberg, Strasbourg và Infantis bắt nguồn từ các sản phẩm gia cầm, nước thải, con người đã được báo cáo từ nhiều quốc gia khác nhau, gồm cả Ấn Độ. +Trong nghiên cứu mPCR, kháng nguyên O được mã hóa bởi gien tyv, kháng nguyên H được mã hóa bởi fliC-d, kháng nguyên Vi được mã hóa bởi gien độc viaB được sử dụng làm nền tảng cho việc nhận dạng S.Typhi từ trường hợp người bệnh thương hàn.BÀN LUẬN+Kết quả mPCR được mô tả trong thí nghiệm này là thiết lập được 3 loại gien có tính bảo tồn cao giữa các mẫu phân lập S.Typhi và có thể trở thành các gien trọng điểm để phát hiện nhanh S.Typhi phân lập.+Kết quả thử nghiệm kháng sinh nhạy cảm đã bộc lộ các S.Typhi phân lập kháng ampicillin (100%), cefuroxime (81,25%), penicillin-G (68,75%), cephalothin (68,75%).+Kết quả hiện tại cũng cho thấy rõ xu hướng các S.Typhi phân lập kháng nhiều loại thuốc.+Nhìn chung, các nhà nghiên cứu ở miền Nam Việt Nam đã báo cáo 90% S.Typhi phân lập kháng nhiều loại kháng sinh như ampicillin, chloramphenicol và co-trimoxazole.+Ở Ấn Độ, báo cáo S.Typhi kháng lại 29,47% ampicillin và 28,42% chloramphenicol. +Mặc dù các nhà nghiên cứu đã nhiều lần báo cáo chloramphenicol là chất kháng S.Typhi nhưng trong nghiên cứu này lại cho thấy 100% chloramphenicol cùng với kanamycin, clindamycin, carbenicillin, gentamycin, tetracycline nhạy với S.Typhi phân lập.BÀN LUẬNBÀN LUẬN+Trong sự thích hợp, 100% tính nhạy cảm của S.Typhi phân lập chống lại chloramphenicol, gentamycin, tetracycline cũng đã được phát hiện sớm hơn.+Trong nghiên cứu của chúng ta, acid nalidixic và nitrofurantoin được thấy là nhạy vừa đủ.+Gần đây nhất, 76% mẫu máu cấy vào S.Typhi được báo cáo là kháng acid nalidixic. KẾT LUẬN+Nghiên cứu khẳng định sự liên hệ giữa giống S.Typhi độc hại với sự kiện sốt thương hàn ở Tamil Nadu. +Nghiên cứu cũng chỉ ra kỹ thuật PCR là 1 công cụ có ích trong việc chuẩn đoán nhanh với số lượng lớn S.Typhi trong phòng thí nghiệm hoặc phòng khám bệnh.+Dù chloramphenicol và những thuốc kháng sinh khác cho thấy 100% đạt độ nhạy, nhưng vẫn cần có những đánh giá về độ nhạy – độ kháng của S.Typhi là rất cần thiết cho việc sử dụng thuốc kháng sinh ở mức vừa phải trong việc quản lý sốt thương hàn trong tương lai.THE ENDCẢM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE.?