Tìm hiểu về hoạt tính 3 - Mcpd

 TÌM HIỂU VỀ HOẠT TÍNH 3-MCPD Sinh viên thực hiện :Trần Quang Trọng Giảng viên hướng dẫn :Phạm Thị Tuyết Mai Ngành : Bảo Quản Chế Biến Nông Sản Mở đầu Nội Dung Khái quát về 3-MCPD Cơ chế hình thành 3-MCPD 3-MCPD đối với sức khỏe Phương pháp xác định 3-MCPD trong thực phẩm Tiêu chuẩn sử dụng Phương pháp làm giảm lượng 3-MCPD trong nước tương Kết luận Tài liệu tham khảo TỔNG QUAN Mở đầu Thực phẩm là yếu tố quan trọng song hành với sự tồn tại và phát triển của loài người . Ngày nay con người không chỉ “ ăn no mặc ấm mà còn ăn ngon mặc đẹp , ăn đủ dinh dưỡng ”.Cùng với sự tiến triển của khoa học và công nghệ, công nghệ chế biến thực phẩm cũng phát triển .song hành với sự phát triển đó là vấn đề an toàn thực phẩm cũng được quan tâm . Nguồn thực phẩm ngày càng được chế biến đang dạng và phong phú đáp ứng nhu cầu thị hiếu của người tiêu dùng song vấn đề an toàn thì khó mà kiểm soát được .Nguồn thực phẩm không an toàn có thể do những lí do sau : nguy cơ tác hại đến sức khoẻ của con người từ nguồn thức ăn thô (nguy cơ tự nhiên) và nguy cơ phát sinh trong dây truyền chế biến . Ở đây chúng ta xét đến nguy cơ gây tác hại đến sức khoẻ của con người trong quá trình chế biến các sản phẩm có chứa chất 3-MCPD ảnh hưởng đến sức khoẻ của ngươi tiêu dùng . NỘI DUNG 1. KHÁI QUÁT VỀ 3-MCPD 1.1 Khái niệm, nguồn gốc của 3-MCPD trong thực phẩm 1.1.1. Khái niệm 3-MCPD - 3-MCPD là một chất thuộc nhóm chloropropanols có tên hoá học là 3-monochloro propane 1,2-diol. Chất Triglyceride (C3H5(OH)3) trong chất béo khi tác dụng vơí axit chlohydric (HCl) thì tạo thành 3-MCPD và 3 dẫn xuất khác (1,3-DCP; 2,3-DCP; và 2-MCPD). 3-MCPD được tạo thành do sự phản ứng giữa chất Clo và chất béo trong quá trình chế biến thực phẩm. Phản ứng được thúc đẩy nhanh hơn khi xảy ra ở nhiệt độ cao (gia nhiệt).. Là một chất hữu cơ có thể tạo thành trong thực phẩm bởi phản ứng của clo với các chất béo. 1.1.2. Nguồn gốc 3-MCPD 3-MCPD là chất phổ biến nhất trong tạp chất thực phẩm nhóm clopropanol. Chất này xuất hiện trong thực phẩm với hàm lượng thấp trong quá trình chế biến công nghiệp, tiếp xúc với vật liệu đóng gói, hoặc chế biến thức ăn trong gia đình. tất cả các loại thực phẩm nào hội đủ 3 điều kiện: “có chứa thành phần clorine + thành phần chất béo + nhiệt” đều có thể sản sinh ra 3-MCPD, tuy nhiên với hàm lượng từ mức độ vi lượng, vết hoặc nhiều vượt mức an toàn, rất khác nhau. Tuy nhiên, một khi đã sinh ra thì tính ổn định của cấu trúc 3-MCPD phụ thuộc vào độ pH và nhiệt độ môi trường. Độ pH càng cao (kiềm) và nhiệt độ càng cao thì tỷ lệ 3-MCPD bị phân huỷ tăng lên. Chế biến xì dầu hoặc sản phẩm nước chấm từ đậu nành (đậu tương) đầu tiên là phương pháp lên men hay còn gọi là phương pháp lên men truyền thống. Khi công nghệ phát triển, người ta thấy rằng chế biến xì dầu hoặc sản phẩm đậu tương bằng phương pháp thuỷ phân bằng acid HCl đem lại hiệu năng rất cao về mặt chất lượng (vị ngon) và hiệu suất thành phẩm, do đó phương pháp này dần dần chiếm ưu thế trong công nghệ chế biến xì dầu, dầu hào và các sản phẩm từ đậu tương có thông qua quá trình thuỷ phân. Cho đến tháng 11/2001, lần đầu tiên tại Việt nam, các kiểm nghiệm về chất 3-MCPD được tiến hành và cũng xác minh là nồng độ 3-MCPD có mặt trong một số sản phẩm nước tương bán ở thị trường Việt nam là cao quá ngưỡng cho phép rất nhiều (tiêu chuẩn châu Âu). 3-MCPD có trong các thực phẩm như: - 3-MCPD sẵn có tự nhiên trong nguyên liệu thô. - Bản quản thực phẩm chưa chế biến. - Sử dụng nước clo hóa để rửa. - Qúa trình chế biến công nghiệp như rang nướng, cô đặc, ủ mạch nha, tiệt khuẩn theo phương pháp Paster, rán, hun khói, sấy phun, tiệt trùng. - Tiếp xúc với vật liệu đóng gói . - Bản quản thực phẩm làm sẵn. - Chế tạo thức ăn gia đình như luộc, rán, quay. - 3-MCPD được tìm thấy trong nước tương, trong bánh mì, phô mai, bánh biscuit nướng , bánh cracker mặn , bánh cam vòng (doughnut), bơ- gơ (burger), xúc xích , trong đó hàm lượng của 3-MCPD trong nước tương là cao nhất.. Thực phẩm khác có thể chứa 3-MCPD: + Ngũ cốc rang (lạc, đậu). + Malt đen và dịch chiết malt đen. + Súc xích lên men. + 3-MCPD cũng có thể hình thành trong quá trình nấu nướng thông thường khí clo trong nước (nhiều hệ thống nước dùng khí clo để xử lý) tiếp xúc với chất béo và được gia nhiệt trong quá trình nấu nướng Độc tố 3-MCPD thuộc nhóm hóa chất gây độc có tên gọi chloropropanols, có công thức phân tử chung C3H7ClO2, khối lượng phân tử 110,5. Chloropropanols có các dẫn xuất 1,3-DCP; 2-MCPD; 2,3-DCP và 3-MCPD. Trong đó, 3-MCPD có hàm lượng cao nhất và tồn tại dưới dạng hỗn hợp racemic của 2 đồng phân (R) và (S) (hàm lượng của 2 đồng phân đối quang bằng nhau 50:50). 3-monoclorpropandiol 2-monochloropropane-1,3-diol 2,3-dichloro-2-propanol (3-MCPD)  (2-MCPD) 1.2 Công thức cấu tạo - CƠ CHẾ HÌNH THÀNH 3-MCPD Độc tố 3-MCPD được hình thành qua phản ứng giữa chất béo với các chất có chứa Clo. Phản ứng thường xảy ra trong quá trình thủy phân chất đạm thực vật bằng acid clohidric HCl. Do đó thường gặp trong nước tương, bánh mì, formage, xúc xích... nhất là trong nước tương, do nhà sản xuất dùng protein thực vật thủy phân bằng acid clohydric để làm tăng vị mặn và tăng hương vị (trong quy trình sản xuất nước tương, đây là khâu thủy phân đạm trong khô dầu đậu nành). Ví dụ: khi ướp thịt cá với muối có tên hóa học là Natri Clorua (NaCl), gốc Clo kết hợp với chất béo có trong thịt cá cũng sẽ sản xuất ra chất 3 MCPD. Điều kiện hình thành độc tố  Nghiên cứu phản ứng hình thành và phân hủy 3-MCPD thấy rằng: Phản ứng này tạo ra các sản phẩm: monochloropropanol, dichloropropanol, monochloropropanediol, nhưng nhiều nhất là 1,3- dichloro- 2- propanol (1,3- DCP) và 3- monochloropropanol (3- MCPD). Cường độ phản ứng tạo 3-MCPD phụ thuộc mạnh vào nhiệt độ. Ở điều kiện tối ưu là 2300C thì lượng 3-MCPD tạo thành là 50 mg/kg glycerol tham gia phản ứng. Ở 1000C hàm lượng 3-MCPD sinh ra chỉ là 0,6mg/kg.  - Sự hình thành 3-MCPD trong thực phẩm do quá trình sử dụng acid clorhydric (HCl) thuỷ phân protein thực vật (hay còn gọi là acid-HPV) đã được phát hiện từ những năm 1980 nhưng các kết quả khảo sát lần đầu tiên được công bố được Collier và đồng nghiệp lần đầu tiên mô tả vào năm 1991. Và theo khảo sát và những năm 1990 và 1992 của MAFF (Bộ Nông-Lâm-Ngư nghiệp) của Anh khảo sát và công bố cho thấy gần như nồng độ của 3-MCPD cao ở mức 100mg/kg thực phẩm là rất phổ biến vào thời đó nhưng đã giảm đi rất nhiều vào các thời điểm sau này. Một trong những sản phẩm công nghiệp có sử dụng acid thuỷ phân protein thực vật đó là sản phẩm xì dầu (nước tương) và dầu hào 3 . 3-MCPD VỚI SỨC KHỎE Không được xem nhẹ, nhưng cũng đừng quá hoang mang. Đó là lời khuyên đầu tiên của PGS-BS Nguyễn Chấn Hùng, khi nhận định mối liên quan giữa chất 3-MCPD với sức khoẻ người dân. Trong chuyên môn, chất 3-MCDP là viết tắt của chữ 3 Mono-Chloro Propane 1,2 Diol Giới khoa học cảnh báo, 3-MCPD là chất có nguy cơ gây ung thư là nhờ vào việc xác định theo phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm ở một số động vật như chuột, thỏ... Theo đó cho thấy, 3-MCPD là chất có thể gây biến đổi gene - một trong những nguyên nhân hàng đầu gây nên ung thư. Nếu nồng độ axít thấp (nồng độ của hóa chất thực phẩm) thì độc tố 3-MCPD không có hoặc sẽ đúng với hàm lượng cho phép khi sản xuất nước tương. Hiện nay, chỉ bằng việc phân tích, chúng ta mới phát hiện được chất 3-MCPD có trong nước tương  Tác hại của 3-MCPD: Nếu cho chuột cống dùng liều lặp lại (ngắn hạn) ở nồng độ 1mg/kg thể trọng thì có biểu hiện giảm độ di chuyển của tinh trùng, thay đổi hình dạng tinh trùng và gây suy giảm khả năng sinh sản ở chuột cống đực cũng như các loài có vú khác. Nếu cho chuột nhà (mouse) và chuột cống tiếp xúc với liều 25mg/kg cơ thể thì có thấy xuất hiện các thương tổn ở hệ thần kinh trung ương.  Nghiên cứu quan sát trên người Cho đến nay, vẫn chưa có một nghiên cứu dịch tễ học hay lâm sàng nào về tác hại của 3-MCPD trên người cả. Tuy nhiên, nghiên cứu trên tế bào tinh trùng người trong phòng thí nghiệm cho thấy có hiệu ứng hiệp lực giữa 3-MCPD với nguyên tố đồng (Cu) làm giảm khả năng di chuyển củ Tóm lại: uỷ ban khoa học hiện thời kết luận 3-MCPD chưa phải là độc tố gây tổn hại gen trong cơ thể.  Các chất sinh ra từ 3-MCPD đều gây hại Khi vào cơ thể người, 3-MCPD sẽ biến đổi thành một số chất khác, và tất cả chúng đều gây nguy hiểm cho sức khoẻ con người, bao gồm: - 1,3-DCP: Có khả năng gây biến đổi gene và nhiễm sắc thể, làm tổn thương gan (thậm chí khiến gan bị hoại tử), viêm phế quản và dạ dày. Không đợi khi bạn đã đưa nước tương vào cơ thể, chất này xuất hiện ngay trong nước tương nếu sản phẩm chứa 3-MCPD nồng độ cao. Cứ 20 phân tử 3-MCPD thì sẽ có một phân tử 1,3-DCP xuất hiện. - Mercapturic acid: Gây hại rất mạnh đối với thận. - Axit Beta – chlorolactic: Làm giảm khả năng di chuyển của tinh trùng, giảm pH môi trường mào tinh dẫn đến hiếm muộn. - Axit oxalic: Là chất độc đối với thận, vì dạng tinh thể canxi oxalat gây viêm cầu thận, tắc nghẽn vùng tủy tuyến thượng thận - tuyến nội tiết quan trọng đối với con người. - Glycidol: Làm biến đổi gene và nhiễm sắc thể, gây ung thư.  Đánh giá mức độ phơi nhiễm - Mức độ hiện diện trong thực phẩm Một số thực phẩm có thể bị nhiễm 3-MCPD do tiếp xúc với màng bao có nước chứa epichlorhyrin như xúc-xích, trà túi lọc, lọc cà phê. Tuy nhiên, với công nghệ cải tiến các màng bao bọc, việc tiếp xúc với chất liệu có thể gây nhiễm 3-MCPD có thể coi như ít gây hại cho người.  Ước tính lượng thu nạp của cơ thể mỗi ngày Như đã nêu trên, sản phẩm nước tương và tương tự là những thực phẩm phổ biến có chứa hàm lượng 3-MCPD cao nhất, do đó việc ước tính mức độ thu nạp cho cơ thể mỗi ngày chủ yếu dựa trên số liệu tiêu thụ loại thực phẩm này do các nước cung cấp. Có nghĩa là, mỗi quốc gia cần phải có một khảo sát riêng cho nước mình về lượng nước tương tiêu thụ trung bình cho mỗi người dân . Nước tương càng để lâu càng nhiều 3-MCPD - Hàm lượng 3-MCPD trong nước tương phụ thuộc một phần vào thời gian bảo quản, nghĩa là sản phẩm để lâu sẽ có lượng chất gây ung thư cao hơn so với sản phẩm mới ra lò. 3-MCPD trong nước tương chủ yếu được tạo ra khi dùng axit HCl để thuỷ phân protein trong nguyên liệu (hạt đậu nành) ở nhiệt độ cao, tạo thành axit hydrolysed vegetable proteinamin (HPV). Lý do axit này được sử dụng là nó rút ngắn thời gian rất nhiều so với việc dùng bánh men để “xử lý” chất đạm, thậm chí chỉ mất 1 tuần nếu sử dụng kỹ thuật bioreactor (so với 6 đến 12 tháng nếu thủy phân đạm thực vật bằng vi sinh theo cách truyền thống). Tuy nhiên, khi phân huỷ các chất đạm, HCl cũng tác dụng với chất béo trong hạt đậu và tạo ra 3-MCPD. - Chất độc 3-MCPD cũng được tạo ra một cách gián tiếp khi nhà sản xuất nước tương, để tăng hương vị sản phẩm, đã thêm vào một lượng lớn axit HVP ngoại sinh (ví dụ: Monosodium glutamate – mì chính) vì lượng HVP bổ sung này cũng được sản xuất bằng cách dùng HCl để thủy phân protein. Đây cũng là lý do một số thực phẩm khác như xúc xích, kem, bánh bích quy, bơ… cũng có 3-MCPD nhưng với tỷ lệ rất thấp. - Có một yếu tố nữa góp phần gia tăng lượng 3-MCPD trong nước tương, đó là thời gian bảo quản sản phẩm sau khi xuất xưởng. Thời gian này càng dài, tỷ lệ 3- MCDP tạo ra từ phản ứng giữa muối (NaCl) và chất béo khi có sự hiện diện của axit (ví dụ như axit acetic) trong sản phẩm càng lớn. 3-MCPD cũng được tạo ra khi sử dụng nước có chlorine trong sản xuất nước tương, bột ngũ cốc rang (được trộn vào đậu trước khi thuỷ phân đạm bằng axit HCl hay lên men vi sinh), hay khi dùng nguyên liệu tồn kho lâu. Tuy nhiên, hàm lượng 3-MCPD sinh ra theo con đường này rất thấp. Theo kiến thức hiện hành, 3-MCPD được xem là hoá chất có thể gây ung thư nhưng hoạt năng theo cơ chế không gây độc cho gen trong nghiên cứu trên cơ thể sống (tìm thấy cơ chế này trên thực nghiệm mô biệt lập với liều tiếp xúc cao). - Cho đến hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu tác hại của 3-MCPD trên người, nên chưa có cơ sở dữ liệu để có thể thiết lập mối quan hệ liều lượng tiếp xúc. Trong tình cảnh đó, dựa trên nguyên lý bất định, liều lượng độc tính chuyển đổi giữa các chủng loại khác nhau (mô hình chuột và người) thì chấp nhận hệ số chuyển đổi là 20 lần giữa hai chủng loại đối với động năng độc lực và hiệu số động độc lực (toxicokinetic difference); ngoài ra cũng còn phải hiệu chỉnh thêm có các yếu tố phụ nếu cho là cần thiết, ví dụ như phải tính đến cả tình trạng thiếu dữ kiện. Độ dung sai của phương pháp 15- 20% với hàm lượng 3-MCPD từ 20- 100 microgam/kg. Phương pháp phân tích mẫu nước tương có chứa 3-MCPD 3-MCPD đầu tiên sẽ được tách khỏi thực phẩm, sau đó cho tác dụng với một chất trung gian để tạo thành một dẫn xuất, dẫn xuất này sau đó được tách trên hệ thống sắc kí khí và phân tích bằng phương pháp phổ khối (GC/MS & GC/MS/MS). Do phản ứng chuyển đổi trung gian có hiệu suất thấp và không cố định với các lần lặp lại khác nhau, để xác định chính xác hàm lượng 3-MCPD người ta phải sử dụng cả nội chuẩn (internal standard) và ngoại chuẩn (external standard) Với thực phẩm ở dạng lỏng như tương thì người ta có thể hấp phụ 3-MCPD (mẫu và nội chuẩn đã đánh dẫu) lên chất hoạt động bề mặt (diatomacous earth, zeolite) sau đó trích li bằng diethyl ether, sau đó cô đặc rồi phân tích trên hệ thống GC/MS. TIÊU CHUẨN SỬ DỤNG Chất 3-MCPD được Tổ chức Y tế thế giới - WHO và Tổ chức Lương nông thế giới - FAO đưa ra bàn luận lần đầu vào năm 1993, nhân dịp hội nghị về chất phụ gia thực phẩm. Khi ấy, các nhà chuyên môn đã xác nhận khả năng gây độc trên thận và nguy cơ gây ung thư trên động vật của 3-MCPD. Năm 1996, nước Anh cũng đã cảnh báo về nguy cơ gây hại của 3-MCPD. Và năm 2001, WHO và FAO đã đưa ra lượng dung nạp tối đa mỗi ngày đối với chất 3-MCPD là 2 microgram/kg thể trọng/ngày. Tiêu chuẩn Uỷ ban Châu Âu (EC) NO 466/2001 ra ngày 8/3/2001 và áp dụng từ ngày 15/4/2002 cho phép hàm lượng 3-MCPD tối đa trong sản phẩm đạm thực vật thủy phân gồm cả nước tương là 0.02mg/kg (20microgam/kg) với sản phẩm chứa 40% lượng chất khô (tương ứng 0.05 mg/kg) tính theo chất khô. Tiêu chuẩn Uỷ ban Châu Âu (EC) NO 466/2001 ra ngày 8/3/2001 và áp dụng từ ngày 15/4/2002 cho phép hàm lượng 3-MCPD tối đa trong sản phẩm đạm thực vật thủy phân gồm cả nước tương là 0.02mg/kg, (20microgam/kg) với sản phẩm chứa 40% lượng chất khô (tương ứng 0.05 mg/kg) tính theo chất khô. Không được vượt quá ngưỡng cho phép: Đối với 3-chloro-1, 2-propanediol (3-MCPD) là 0.2 mg/kg tính dựa trên 40% trọng lượng khô (40% dry matter content). Đối với 1, 3-dichloro-2-propanol (1, 3-DCP) là 0.005 mg/kg tính dựa trên 40% trọng lượng khô (40% dry matter content). Đối với các sản phẩm có chứa 3-MCPD khác không phải nước tương, thì Bộ Nông-Lâm-Ngư nghiệp của Anh và các nước Âu châu chấp nhận giả định là 1/8 trọng lượng thức ăn đó; có nghĩa là 180g/ngày trên 1500g của lượng thực phẩm khô đó, bao gồm các gia vị có khả năng chứa 3-MCPD. Dựa trên số liệu khảo sát của Anh quốc, nồng độ tồn lưu trung bình của 3-MCPD được tính là 0.012mg/kg, nên có thể ước tính mức tiêu thụ trên mỗi đầu người/ngày cho các thực phẩm khác có chứa 3-MCPD là 2 microgam. Tổng kết 3-MCPD về cơ bản sẽ thành hình trong tất cả các loại thực phẩm khi hội đủ các yếu tố chính yếu: chất béo, chất muối và nhiệt độ cao hơn 100°C ( bánh nướng) . Với các loại bánh mì, pizza nếu có thì 3-MCPD chỉ hình thành ở vỏ bánh nướng dòn với số lượng rất nhỏ và khi ăn nhiều vẫn không phải là vấn đề để lo lắng .. Kết quả kiểm mẫu nước tương chứng minh được các nhà sản xuất có thể sản xuất loại nước tương không có 3-MCPD và mức qui định của Âu Châu có thể giữ được với kỹ thuật hiện nay. Về phía người tiêu dùng; càng ít 3-MCPD càng có lợi .Mức qui định 2 µg/kg trọng lượng cơ thể có thể bị vượt qua một cách dễ dàng, nếu người ta dùng nhiều loại thực phẩm như kể trên … Châu Âu quy định hàm lượng tối đa 3-MCPD cho phép là 20 microgram/kg nước tương có độ khô rắn là 40%. Việt Nam, Thái Lan, Đài Loan, Mỹ ấn định 1.000 microgram/kg. Theo thông tin mới nhất thì Ủy ban Codex về các chất ô nhiễm trong thực phẩm sẽ đệ trình vào phiên họp lần thứ 30 của Hội đồng Codex Alimentarius một dự thảo cho phép hàm lượng tối đa 3-MCPD trong nước tương sẽ là 0,4 mg/kg. Chính vì sự khác biệt mức độ tiêu thụ (hay còn gọi là mức phơi nhiễm) với sản phẩm có chứa 3-MPCD ở từng nước và từng vùng khác nhau nên mới có những nồng độ cho phép sự hiện diện của 3-MCPD trong thực phẩm khác nhau, như xem ở bảng dưới đây. 6. PHƯƠNG PHÁP LÀM GIẢM LƯỢNG 3-MCPD TRONG NƯỚC TƯƠNG   Làm giảm 3-MCPD trong chế biến nước tương bằng phương pháp thủy phân Bao gồm 3 phương thức: Thứ nhất, giám sát cẩn thận bước thủy phân bằng acid; thứ hai, cần phải có bước áp dụng nguyên tắc trung hòa để làm giảm nồng độ 3-MCPD; thứ ba, sử dụng acid sulfuric thay thế acid clohidric (HCl) trong khâu thủy phân. Giám sát nhiệt độ: Nhiệt độ trong suốt quá trình đun nấu ở khâu thủy phân phải được giám sát chặt và chú ý đến các điều kiện phản ứng trong khâu trung hòa tiếp theo. Nhiệt độ duy trì trong quá trình thủy phân tối ưu nên thực hiện ở mức 600C - 950C. Nhiệt độ phản ứng sẽ tăng lên ở mức từ 0.010C đến 0.30C trong một phút và nhiệt độ sẽ dần đạt đến 1100C. Khi nhiệt độ đạt đến mức này, phải giữ ổn định suốt trong 2 giờ tiếp và sau đó là quá trình làm nguội, rồi trung hòa và lọc. Nếu khâu thủy phân này được giám sát cẩn thận, thì nồng độ 3-MCPD đã có thể giảm xuống được ở mức 10 mg/kg rồi. Thủy phân kiềm: Để loại bỏ 3-MCPD sinh ra trong quá trình thủy phân có thể tiến hành một bước thủy phân kiềm. Xử lý bằng kiềm là một bước mở rộng của quá trình trung hòa sau khi thủy phân nguyên liệu ban đầu, nó giúp làm thoái hóa các hợp chất chloropropanols hiện diện trong sản phẩm được thủy phân. Xử lý bằng kiềm có thể tiến hành trước giai đoạn lọc. Đạm (protein) thủy phân được xử lý bằng một hợp chất kiềm . như là potassium hydroxide hay sodium carbonate với mục đích để làm tăng độ pH lên mức 9 - 13. Sau đó hỗn hợp thành phẩm này đem đun, giữ ở nhiệt độ dao động từ 1100C - 1400C trong 5 phút. Sau khi làm lạnh, thì độ pH của sản phẩm thủy phân phải là kiềm, lý tưởng là ở mức pH8 trong điều kiện nhiệt độ 250C. Nếu sau khi đã xử lý khâu này mà độ pH thấp hơn, thì có nghĩa quá trình xử lý này chưa đạt .   Phương pháp công nghệ vi sinh   Sản xuất nước tương bằng phương pháp lên men này gần như là rất an toàn; các kiểm nghiệm gần như không thấy có 3-MCPD hoặc nếu có cũng rất thấp. Trong một khảo sát mới đây của Nhật, cho thấy trong 104 mẫu nước tương làm bằng phương pháp lên men được thử, có 93 mẫu chứa 3-MCPD ở nồng độ tối thiểu (0.004 mg/kg). Phương pháp này khởi đầu là ủ đậu nành với aspergillus oryzae và/hoặc aspergillus sojae. Sau khi ủ được 1 đến 3 ngày, ở nhiệt độ 250C - 30oC, cho thêm nước muối vào và trộn, giữ ở nhiệt độ dưới 40oC trong một thời gian tối thiểu là 90 ngày. Quá trình sản xuất lên men theo công đoạn ngắn ngày thì giai đoạn cho nước muối vào và giữ ở nhiệt độ trên 40oC, và công đoạn này kết thúc trong vòng 90 ngày. Các sản phẩm này nếu muốn giữ được hương vị sau khi đã mở chai, cần phải để tủ lạnh.  Phương pháp công nghệ enzym  Theo đề nghị của công ty Novo quy trình enzyme với 5 enzym được phối hợp sử dụng gồm protease, cellulase, amylase. Quy trình này có ưu điểm là điều kiện thủy phân ôn hòa, hoàn toàn không sử dụng hóa chất, không làm biến đổi thành phần axit amin ban đầu, nhưng hiệu suất tối đa chỉ đat 70%. Để khắc phục nhược điểm của cả hai phương pháp trên và bổ sung ưu điểm cho nhau, ta kết hợp thủy phân bằng axit với thủy phân bằng enzym Công nghệ enzyme kết hợp axit Có thể thực hiện thuỷ phân bằng enzym trước rồi sau đó mới thuỷ phân bằng axit hoặc thuỷ phân bằng axit rồi sau đó thuỷ phân bằng enzym. Quy trình được lựa chọn như sau:   Việc sử dụng enzym protease kết hợp axit xúc tác quá trình thủy phân có ưu điểm là giảm thiểu sử dụng hóa chất độc hại, giảm thiểu ô nhiễm môi trường, rút ngắn thời gian sản xuất. Có thể sản xuất trên hệ thống thiết bị sẵn có. Ngoài 3 phương pháp chính nêu trên còn có những phương pháp công nghệ tương tự sản xuất từ nguyên liệu đậu nành hạt bằng phương pháp vi sinh, hay thay đổi thành phần nguyên liệu bã dầu đậu nành, bã dầu đậu phụng, kết