Tóm tắt Luận án Khảo sát một số đặc điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng trị

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM HUỲNH VĂN CHƢƠNG KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CỦA BỆNH CẦU TRÙNG Ở GÀ VÀ NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO CHẾ PHẨM SINH HỌC SỬ DỤNG TRONG PHÒNG TRỊ CHUYÊN NGÀNH: BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI MÃ SỐ : 62 64 01 02 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2017 Công trình hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Ngƣời hƣớng dẫn: 1. PGS.TS. ĐINH THỊ BÍCH LÂN 2. PGS.TS. NGUYỄN HỮU NAM Phản biện 1: GS.TS. NGUYỄN THỊ KIM LAN Trƣờng Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên Phản biện 2: TS. BÙI KHÁNH LINH Học viện Nông nghiệp Việt Nam Phản biện 3: TS. NGUYỄN THỊ LAN ANH Viện Thú y Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Thƣ viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bệnh cầu trùng gà là nguyên nhân chính gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi gia cầm (Allen and Fetterer, 2002). Hiện nay, để phòng trị bệnh cầu trùng người chăn nuôi chủ yếu dùng kháng sinh bổ sung vào trong thức ăn và nước uống. Tuy nhiên, phương pháp này còn nhiều hạn chế như: Xuất hiện một số chủng Eimeria có khả năng kháng kháng sinh (Chapman, 1997), tạo ra một loại thuốc mới đòi hỏi chi phí cao (Lillehoj and Lillehoj, 2000), bổ sung kháng sinh kéo dài dẫn đến tồn dư trong sản phẩm gia cầm làm ảnh hưởng đến người tiêu dùng. Vì vậy, tạo ra các chế phẩm có tác dụng phòng và trị bệnh cầu trùng, thay thế kháng sinh là nhu cầu cấp bách của thực tiễn. Protein 3-1E là một kháng nguyên ề m t c khung đ c mở dài 513 p, mã h a đoạn polypeptide dài 170 amino a xít với khối lư ng ph n t là 18.523 kDa, tồn tại ở giai đoạn Sporozoite và Merozoite của một số loài như E. acervulina, E.tenella, E. maxima. Đã c những nghiên cứu s dụng kháng nguyên 3-1E tái tổ h p làm vắc xin chống lại E. acervulina, E. tenella và E. maxima (Lillehoj et al., 2000). Tiêm chủng ng vắc xin DN dựa trên gene 3-1E c ng g y đư c đáp ứng miễn dịch chống lại cầu trùng gà (Lillehoj et al., 2000; Ma et al., 2011). Áp dụng công nghệ protein tái tổ h p để sản xuất kháng nguyên tái tổ h p 3-1E và dùng kháng nguyên này để gây tối miễn dịch cho gà sẽ tạo đư c kháng thể có khả năng chống lại đồng thời nhiều loài cầu trùng. Đ y là l i thế của phương pháp tiếp cận mới có áp dụng công nghệ cao so với các phương pháp tách chiết kháng nguyên truyền thống. Kháng thể lòng đỏ trứng gà đã đư c nhiều tác giả quan t m nghiên cứu và hiệu quả của n trong phòng và trị ệnh nhiều ệnh truyền nhiễm đã đư c chứng minh. M t khác, kháng thể lòng đỏ c giá thành thấp, dễ ảo quản, c độ an toàn và tính đ c hiệu cao, đ c iệt là chỉ tác động lên mầm ệnh, không ảnh hưởng đến vi sinh vật c l i trong cơ thể, không g y ra hiện tư ng kháng thuốc và không làm ảnh hưởng đến chất lư ng của thực phẩm. Bên cạnh đ việc dùng kháng thể trong phòng và điều trị ệnh là một giải pháp đư c lựa ch n hàng đầu trong định hướng phát triển của ngành chăn nuôi, để hạn chế lạm dụng kháng sinh trong phòng trị ệnh ở vật nuôi. 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Xác định đư c các đ c điểm ệnh lý của ệnh cầu trùng ở gà trên đàn gà đư c nuôi tại Phú Vang- Thừa Thiên Huế. Sản xuất đư c kháng nguyên tái tổ h p 3-1E làm nguyên liệu tạo kháng thể kháng cầu trùng gà. Xác định đư c hiệu quả phòng trị ệnh cầu trùng gà của chế phẩm sinh 2 h c chứa kháng thể IgY đ c hiệu kháng kháng nguyên 3-1E. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU Về thời gian: Các nghiên cứu đư c thực hiện từ 2012-2015, tại Viện công nghệ sinh h c- Đại h c Huế và Bộ môn bệnh lý, Khoa thú y- H c viện Nông nghiệp Việt Nam. Về không gian: Đề tài tiến hành khảo sát một số đ c điểm ệnh lý của ệnh cầu trùng ở gà Tre nuôi thịt tại địa àn tỉnh Thừa Thiên Huế và nghiên cứu chế tạo chế phẩm sinh h c s dụng trong phòng trị. 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Kết quả luận án cho thấy triệu chứng l m sàng, tổn thương đại thể, vi thể và thay đổi các chỉ tiêu huyết h c của gà Tre mắc ệnh cầu trùng tại thừa Thiên Huế. Đồng thời, xuất phát từ l i thế của công nghệ sản xuất glo ulin miễn dịch từ lòng đỏ trứng (kháng thể IgY), từ nhu cầu c các chế phẩm kháng thể đ c hiệu thay thế cho thuốc kháng sinh chống lại ệnh cầu trùng gà. Đề tài đư c tiến hành để tạo ra một chế phẩm sinh h c c chứa kháng thể đ c hiệu kháng kháng nguyên 3-1E của cầu trùng gà. Điểm mới trong nghiên cứu này là ứng dụng công nghệ sinh h c để tạo ra kháng nguyên tái tổ h p 3- 1E và g y miễn dịch cho gà mái đẻ. Sau đ thu trứng c chứa kháng thể đ c hiệu kháng kháng nguyên 3-1E. Thành công trong nghiên cứu này là đã chế tạo đư c ột lòng đỏ trứng c chứa kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E của cầu trùng gà và s dụng trong phòng và điều trị ệnh cho kết quả tốt như: Làm giảm tỷ lệ mắc ệnh, giảm tỷ lệ chết, giảm thải Oocyst, tăng tỷ lệ khỏi ệnh và tăng khả năng sinh trưởng của gà. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Đ y là một công trình nghiên cứu trong lĩnh vực sinh h c phân t để tạo ra kháng nguyên tái tổ h p 3-1E, làm nguyên liệu cho việc sản xuất kháng thể để phòng và điều trị bệnh cầu trùng cho gà, góp phần làm giảm thiệt hại kinh tế và nâng cao hiệu quả cho ngành chăn nuôi gia cầm. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. GIỚI THIỆU VỀ BỆNH CẦU TRÙNG GÀ Bệnh cầu trùng đã đư c phát hiện bởi ivolta (1983), căn ệnh là một loại ký sinh trùng c trong ph n gà, đến năm 1864 mới xác định đư c Eimeria là nguyên sinh động vật sinh sản theo bào t thuộc lớp Sporozoa, bộ Cocoidie, h Eimeriaidae. Ngày nay bệnh cầu trùng ở gà thế giới đã xác định có khoảng 12 loài Eimeria. Trong đ c 9 loài đã đư c xác định rõ tên, kích thước, màu sắc gồm E. tenella, E. acervulina, E. mitis, E. brunetti, E. necatrix, E. maxima, E. praecox, 3 E. hagani, E. mivatti. Có 7 loài cầu trùng gà trong số 9 loài trên gây bệnh phổ biến (trừ Eimeria hagani, Eimeria mivatti) (Conway and Mckenzie, 2007). 2.2. TỔNG QUAN VỀ CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP Công nghệ ADN tái tổ h p đư c hình thành từ những năm 1970 nhờ sự phát triển các phương pháp và kỹ thuật dùng trong nghiên cứu các quá trình sinh h c ở mức độ phân t . ADN tái tổ h p (còn g i là công nghệ di truyền, công nghệ gene hay kỹ thuật gene) là tập h p các kỹ thuật phân t để định vị, phân lập, biến đổi và nghiên cứu các đoạn ADN. Thuật ngữ tái tổ h p đư c dùng thường xuyên do mục tiêu của nó là kết h p ADN từ hai nguồn xa nhau. Ví dụ: các gene từ hai nguồn vi khuẩn khác nhau có thể đư c liên kết lại, ho c một gene người có thể đư c đưa vào nhiễm sắc thể vi khuẩn (Nguyễn Hoàng Lộc và cs., 2007). 2.3. CÔNG NGHỆ CHẾ TẠO KHÁNG THỂ LÕNG ĐỎ TRỨNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP GÂY MIỄN DỊCH CHO GÀ MÁI Thành phần chính của lòng đỏ trứng gà là lipid và protein. Phần lipid, bao gồm triglyceride, phospholipid và cholesterol, chiếm khoảng 30% lòng đỏ trứng. Protein bao gồm 15 đến 17% của lòng đỏ, c thể chia các thành phần này thành 2 loại: phần hạt và phần plasma, trong đ phần plasma lại ao gồm phần lipoprotein tỷ tr ng thấp và thành phần hòa tan trong nước. IgY n m trong phần hòa tan trong nước (Schade et al., 2005). Do đ việc tách chiết IgY yêu cầu phải loại bỏ các lipoprotein và thu nhận phần hòa tan trong nước (WSF) tiếp theo làm sạch IgY (Poison et al., 1980). PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Địa điểm lấy mẫu: Các trang trại và hộ chăn nuôi gia đình tại huyện Phú Vang- Thừa Thiên Huế. Phòng Thí nghiệm bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y - H c viện Nông nghiệp Việt Nam, Trâu Quỳ- Gia Lâm- Hà Nội. Phòng Thí nghiệm Bộ môn Miễn dịch h c và vắc xin- Viện công nghệ sinh h c- Đại h c Huế, Phú Vang- Thừa Thiên Huế. 3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Từ năm 2012-2015. 3.3. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 3.3.1. Vật liệu nghiên cứu Gà mắc bệnh cầu trùng ở địa bàn Tỉnh Thừa Thin Huế. Gà mái đẻ trứng chuyên dụng đư c tiêm đầy đủ các loại vắc xin, gà không nhiễm cầu trùng và một số vật liệu thiết yếu khác. 4 3.3.2. Thiết bị và hóa chất dùng cho nghiên cứu Máy ly tâm Eppendorf, hệ thống máy đông khô lạnh Thermo Savant, máy Vortex - genic 2, máy ELISA tự động, khuấy từ IKA C-MAG HS 7, máy đúc Block, máy cắt Microton, máy phân tích huyết h c tự động Cell Dyn 3700, máy soi gel Dolphin- Doc, máy lắc c điều nhiệt để nuôi tế bào và một số trang thiết bị và hóa chất thiết yếu khác. 3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Khảo sát các đ c điểm bệnh lý của bệnh cầu trùng ở gà - Nghiên cứu tách dòng gene mã hóa kháng nguyên, tạo plasmid mang gene kháng nguyên, biến nạp vào tế bào E. coli - Nghiên cứu biểu hiện gene kháng nguyên, tách chiết, tinh khiết và định lư ng kháng nguyên tái tổ h p - Kiểm tra độ tinh khiết và tính đ c hiệu của kháng nguyên tái tổ h p - Nghiên cứu sản xuất bột lòng đỏ trứng gà có kháng thể phòng trị bệnh 3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phƣơng pháp theo dõi triệu chứng lâm sàng và xác định bệnh tích đại thể, vi thể của gà mắc cầu trùng 3.5.1.1. Phương pháp xác định tỷ lệ nhiễm, cường độ nhiễm và theo dõi triệu chứng lâm sàng Các mẫu ph n đư c xét nghiệm theo phương pháp phù nổi, đánh giá mức độ cảm nhiễm của gà. Cường độ nhiễm đư c tính b ng mật độ Oocyst trên vi trường kính hiển vi: vi trường có từ 1 - 3 Oocyst 1 (+); 4 - 6 Oocyst 2 (+); 7 - 10 Oocyst 3 (+); trên 10 Oocyst 4 (+). Theo dõi triệu chứng lâm sàng b ng phương pháp thường quy. 3.5.1.2. Phương pháp xác định bệnh tích đại thể Tất cả các gà nhỏ và gà lớn ốm chết nghi mắc cầu trùng đều tiến hành mổ khám theo phương pháp của Skrja in để kiểm tra bệnh tích đại thể, kiểm tra đường tiêu hóa ở a đoạn: Manh tràng, ruột non và trực tràng, nạo niêm mạc soi tươi dưới kính hiển vi để tìm và quan sát Oocyst. 3.5.1.3. Phương pháp xác định bệnh tích vi thể Mẫu tiêu bản vi thể đư c làm theo quy trình tấm đúc ng Parafin, nhuộm tiêu bản b ng Haematoxylin - Eosin (HE) tại Bộ môn Bệnh lý, Khoa Thú y, H c viện Nông nghiệp Việt Nam. 3.5.2. Phương pháp xác định chỉ tiêu huyết học của gà mắc bệnh cầu trùng Máu gà lấy vào buổi sáng trước khi cho ăn cho vào ống có chứa chất chống đông để phân tích các chỉ tiêu về hệ hồng cầu gồm: Số lư ng hồng cầu (triệu/mm 3 máu); Hàm lư ng Hemoglobin (g/l); Tỷ khối huyết cầu (%); Nồng 5 độ huyết sắc tố trung bình của hồng cầu (g/dl); Lư ng huyết sắc tố trung bình của hồng cầu (pg) và thể tích trung bình của hồng cầu (fl),các chỉ tiêu về hệ bạch cầu: Số lư ng bạch cầu (nghìn/mm 3 ), công thức bạch cầu (%) và hàm lư ng protein huyết thanh đư c xác định b ng máy tự động Celldyn -3700 3.5.3. Phƣơng pháp tách chiết ADN để xác định loài cầu trùng gây bệnh ở gà 3.5.3.1. Thu thập và tinh sạch Oocyst cầu trùng gà Mẫu phân gà nghi nhiễm Eimeria đư c thu nhận từ nhiều địa phương khác nhau trên địa bàn Thừa Thiên Huế. Oocyst của ký sinh trùng đư c thu theo phương pháp phù nổi, sau đ soi dưới kính hiển vi quang h c với độ ph ng đại 40x để kh ng định sự c m t của cầu trùng. Dịch thu đư c từ phương pháp phù nổi đư c x lý với chất diệt khuẩn NaClO 5,7 sau đ đư c r a lại nhiều lần b ng nước cất vô trùng và một lần với phosphat buffer saline 1X (PBS 1X) (Ding et al., 2012). 3.5.3.2. Phương pháp tách ADN tổng số của cầu trùng gà DN đư c tách từ Oocyst cầu trùng theo phương pháp của Carvalho et al. (2010) có sự cải tiến, 3.5.3.3. Phương pháp PCR xác định các loài cầu trùng gà ADN tổng số đư c s dụng làm khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR xác định sự có m t của các loài cầu trùng. Các c p mồi đ c hiệu cho từng loài cầu trùng giống Eimeria đư c tham khảo theo (Carvalho et al., 2011). 3.5.4. Phƣơng pháp phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E 3.5.4.1. Thiết kế mồi phân lập gene mã hóa kháng nguyên 3-1E Gen 3-1E đư c phân lập với c p mồi có trình tự như sau topo3- 1E.F: 5’-CACCATGGGTGAAGAGGCTGATAC-3’; topo3-1E.R: 5’- TTAGAAGCCGCCCTGGTACA-3’. 3.5.4.2. Tách chiết ARN tổng số ARN tổng số của cầu trùng gà Eimeria đư c tách chiết b ng Kit “SV Total N Isolation System”. S i ADN bổ sung đầu tiên đư c tổng h p dựa trên Kit “First Strand cDN Synthesis”. Sản phẩm ARN sau khi tách chiết đư c ghi kí hiệu mẫu và bảo quản -70ºC để s dụng cho các thí nghiệm sau. 3.5.4.3. u tr nh ph n ứng tổng hợp sợi ADN bổ sung S dụng bộ Kit của hãng Fermentas (Nhật Bản) và đư c thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 3.5.4.4. u tr nh ph n ứng PCR ph n ập gene 3-1E S i ADN bổ sung thứ nhất sau khi đư c tổng h p s dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR phân lập gene mã hóa tạo kháng nguyên 3-1E với c p mồi topo3-1E.F và topo3-1E.R. 6 3.5.4.5. Tinh sạch s n phẩm PCR Sản phẩm PCR đư c tinh sạch theo hướng dẫn của bộ Kit (Wizard ® SV Gel and PCR CleanUp System). Sản phẩm gene 3-1E sau khi tinh sạch đư c ký hiệu và bảo quản ở -20 o C cho đến khi thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. 3.5.4.6. Kỹ thuật điện i iểm tr s n phẩm ARN, PCR Kiểm tra sản phẩm ARN tổng số trên agarose gel 1% có s dụng formaldehyde để biến tính, trong điện trường hiệu điện thế 60 V, cường độ 250 m , trong thời gian 120 phút và ADN đư c điện di trên agarose gel 1%. 3.5.5. Nghiên cứu tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên trong vector tạo dòng và biến nạp vào tế bào vật chủ E. coli TOP10. 3.5.5.1. Gắn s n phẩm PCR có chứa gene 3-1E vào vector tạo dòng pGEM ® - T Easy Sản phẩm phản ứng PC sau khi đư c tinh sạch b ng Kit “Wizard ® SV Gel and PCR CleanUp System” sau đ đư c gắn vào vector pGEM ® -T Easy theo phương pháp dòng h a T (T -cloning) của hãng Invitrogen, c enzym T4 DN ligase làm enzym nối, kỹ thuật gắn theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 3.5.5.2. Biến nạp v ctor tái tổ hợp v o tế o E. co i T P1 Biến nạp là quá trình chuyển sản phẩm gắn vào tế ào chủ E. coli TOP10, các tế ào dương tính đư c ch n l c và nuôi cấy trong môi trường thích h p để thu nhận đư c một lư ng lớn tế ào đư c chuyển nạp vector tái tổ h p, sau đ thông qua tách chiết DN tái tổ h p sẽ thu đư c một lư ng lớn DN của vector tái tổ h p. 2.5.5.3. Chọn lọc khuẩn lạc ương tính Các khuẩn lạc dương tính (khuẩn lạc trắng) đư c chúng tôi tiến hành ch n l c ngẫu nhiên và kiểm tra b ng phản ứng PCR với c p mồi đ c hiệu cho gene 3-1E ho c c p mồi (M13) đư c thiết kế sẵn trên vector. Các khuẩn lạc dương tính với sản phẩm PC đư c nuôi cấy trong ống nghiệm chứa 5 ml môi trường LB lỏng có chứa 50 µg/ml kháng sinh ampicillin, ở 37°C qua đêm. 3.5.5.4. Tách ADN p smi tái tổ hợp Các dòng khuẩn lạc dương tính nuôi cấy trong ống nghiệm qua đêm đư c s dụng để tách chiết plasmid theo bộ Kit tách chiết plasmid tái tổ h p của hãng Invitrogen. 3.5.5.5. iểm tr ADN p smi tái tổ hợp Plasmid pGEM ® -T Easy của hãng Promega c độ dài 3015 bp, trong vector này có chứa vị trí liên kết của gen pUC cho sự khuếch đại của c p primer M13, do vậy khi tiến hành phản ứng PC của plasmid tái tổ h p ng c p mồi này, chúng ta sẽ thu đư c một đoạn DN cho độ dài tương ứng 713 7 bp (bao gồm kích thước của gene và một đoạn khoảng 200 bp n m trên vector pGEM ® -T Easy do c p primer M13 khuếch đại. 3.5.6. Nghiên cứu tạo dòng gene 3-1E trong vector pET200/D-TOPO và biểu hiện gene kháng nguyên 3-1E 3.5.6.1. Nghiên cứu tạo dòng gene 3-1E trong vector pET200/D-TOPO và biến nạp vào tế bào vật chủ E. coli BL21 (DE3) Sản phẩm PCR từ vector pGEM ® -T Easy đư c cắt ra khỏi agarose gelvà tinh sạch b ng Kit “Wizard ® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)”, sau đ gắn vào vector pET200/D-TOPO (Invitrogen, Mỹ). Các bước thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 3.5.6.2. Nghiên cứu biểu hiện gene kháng nguyên 3-1E Các tế bào E. coli BL21(DE3) có chứa vector biểu hiện mang gene 3- 1E đư c nuôi trong bình tam giác chứa 10 ml môi trường LB lỏng có bổ sung 1% glucose và 50 μg/ml kanamycin ở 37 o C, tốc độ lắc 200 vòng/phút. Khi mật độ tế bào của dịch nuôi cấy (OD600) đạt tới 0,8 thì bổ sung IPTG đến nồng độ 0,5 mM và nuôi tiếp ở 20 o C, sau đ thu sinh khối. 3.5.6.3.Phương pháp điện di SDS-PAGE Điện di protein tái tổ h p trên polyacrylamide gel 15% và kháng thể lòng đỏ trứng trên gel 12%. 3.5.7. Phƣơng pháp tách chiết tinh khiết, xác định tính đặc hiệu và định lƣợng của kháng nguyên 3-1E tái tổ hợp 3.5.7.1. Tách chiết tinh khiết kháng nguyên 3-1E Kháng nguyên 3-1E đư c tinh sạch b ng Kit “ProBond TM Purification System (Invitrogen, USA)” theo nguyên lý sắc ký ái lực giữa đuôi 6×His trên protein dung h p và phối t Ni 2+ trên cột sắc ký. 3.5.7.2. Kiểm tr tính đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp Để kiểm tra tính đ c hiệu của kháng nguyên 3-1E tái tổ h p, chúng tôi s dụng phương pháp Western lot để xác định sự kết h p đ c hiệu của kháng nguyên 3-1E với kháng thể đư c sản xuất từ kháng nguyên 3-1E. 3.5.8. Phƣơng pháp chế tạo chế phẩm sinh học sử dụng trong phòng và trị bệnh cầu trùng gà 3.5.8.1. Phương pháp xác định liều ượng kháng nguyên thích hợp để gây miễn dịch S dụng 18 gà mái chia thành 6 lô thí nghiệm: Lô 1 là lô đối chứng (không tiêm kháng nguyên), 5 lô nghiệm thức đư c g y đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên tái tổ h p 3-1E ở các liều lư ng khác nhau, lần lư t từ lô 2 đến lô 6 là 25; 50; 100; 150; 200 µg. So sánh kết quả để tìm ra liều lư ng kháng nguyên thấp nhất cho lư ng kháng thể cao nhất. 8 3.5.8.2. Phương pháp chọn tá chất thích hợp gây miễn dịch cho gà Gà mái Hy-line ở độ tuổi đẻ trứng 9 con đư c chia làm 3 lô (3con/lô). Gà các lô đư c gây miễn dịch như sau (Lô 1: 50 µg kháng nguyên, 300 µl Freund , s; Lô 2: 50 µg kháng nguyên, 300 µl Montanide ISA 201 VG; lô 3: 50 µg kháng nguyên, 300 µl Montanide ISA 50 V2 cùng với nước sinh lý vừa đủ 1ml). Gà đư c tiêm 1ml/con, m i tiêm thứ hai cách m i tiêm thứ nhất 10 ngày, m i tiêm lần thứ ba cách lần thứ hai 20 ngày. Thu thập trứng, tách chiết kháng thể và thực hiện phương pháp ELIS , để xác định lô gà cho lư ng kháng thể cao nhất. 3.5.8.3. Phương pháp ELISA xác định kháng thể Cho vào m i giếng 100 μl kháng nguyên cầu trùng (3-1E) tái tổ h p đã pha với dung dịch Carbonate-Bicarbonate (5 µg/ml). Mẫu chứa kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E đư c pha loãng ng PBS 0,01 M vào các giếng. Kháng thể IgY đ c hiệu đư c phát hiện b ng cách bổ sung kháng thể thỏ kháng IgY cộng h p (Horseradish peroxidase) và cơ chất OPD. Dừng phản ứng với 3M H2SO4 và đ c kết quả ở ước sóng 492 nm. 3.5.8.4. Tách chiết IgY từ òng đỏ trứng Kháng thể IgY đư c tách chiết từ lòng đỏ trứng và tinh sạch dựa theo Bizhanov and Vyshniauskis (2000) và Ko and Ahn (2006) mô tả có cải tiến. 3.5.8.5. Đông hô ột òng đỏ trứng Bột lòng đỏ trứng đư c đông khô dựa theo qui trình đã đư c Thomas Jaekel (2008) mô tả. Sau khi tách hết lòng trắng, lòng đỏ đư c đông lạnh trong tủ đông -20 o C trong 24 giờ và đư c đông khô ng hệ thống đông khô trong 36 giờ. 3.5.9. Phƣơng pháp đánh giá hiệu quả phòng và điều trị bệnh cầu trùng của chế phẩm 3.5.9.1. Phương pháp đánh giá hiệu qu phòng ệnh Thí nghiệm phòng bệnh đư c tiến hành trên 100 gà 30 ngày tuổi khỏe mạnh (không có biểu hiện l m sàng của ệnh cầu trùng, x t nghiệm phân không có Oocyst trùng, ăn uống hoạt động ình thường), c khối lư ng đồng đều. Gà đư c chia thành 2 lô. Lô đối chứng đư c ăn tự do thức ăn h n h p hoàn chỉnh của Công ty Cargill, không bổ sung bột lòng đỏ chứa kháng thể kháng kháng nguyên 3-1E của cầu trùng (sau đ y g i tắt là ột kháng thể). Lô thí nghiệm đư c ăn tự do thức ăn h n h p hoàn chỉnh của Công ty Cargill trộn bột kháng thể lư ng 5g bột lòng đỏ trong 25 kg thức ăn, cho ăn liên tục trong 10 ngày. Gây nhiễm thực nghiệm b ng cách cho uống 10 5 Oocyst/con (cầu trùng sau khi thu đư c ủ ở 29 o C trong 22 giờ với dung dịch 9 kali bichromate 2,5% trong tủ ấm lắc tự động để Oocyst phát triển thành dạng gây nhiễm). Tiếp tục cho gà ở lô thí nghiệm ăn thức ăn c trộn ột kháng thể thêm 5 ngày. Gà đư c theo dõi và so sá