Tóm tắt Luận án Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus (Mont.) Murrill) và nấm vân chi (Trametes cubensis (Mont.) Sacc.) ở vùng Bắc Trung Bộ

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC VINH NGUYỄN THỊ NGẦN NGHIÊN CỨU CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ QUẢ THỂ NẤM ĐA NIÊN LỖ ĐEN (Nigrofomes melanoporus (Mont.) Murrll) VÀ NẤM VÂN CHI (Tramites cubensis (Mont.) Sacc.) Ở VÙNG BẮC TRUNG BỘ TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA HỮU CƠ MÃ SỐ: 62. 44. 01. 14 Nghệ An-2015 2 Công trình đƣơc̣ hoàn thành taị: Trƣờng Đaị hoc̣ Vinh, Đại học Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan Ngƣời hƣớng dẫn khoa hoc̣: 1. PGS. TS. Trần Điǹh Thắng 2. GS. TS. Tian Shung-Wu Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luâṇ án đƣơc̣ bảo vê ̣taị Hôị đồng đánh giá luâṇ án cấp Trƣờng họp tại: vào hồi giờ phút, ngày tháng năm 20 Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện: 1. Thƣ viêṇ Quốc gia Viêṭ Nam 2. Trung tâm Thông tin & Thƣ viêṇ Nguyêñ Thúc Hào – Trƣờng Đaị học Vinh. 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, thời tiết thuận lợi nên là một trong những quốc gia có sự đa dạng sinh học cao so với các quốc gia khác trên thế giới với khoảng 12000 loài thực vật bậc cao và 3000 loài động vật có xƣơng sống đã đƣợc mô tả. Số loài nấm trên lãnh thổ Việt Nam ƣớc lƣợng gấp 6 lần số loài thực vật bậc cao, khoảng 80.000 loài trong đó có 2500 loài nấm đã đƣợc định danh, nấm lớn chiếm 1400 loài thuộc 120 chi. Nấm đảm (Basidiomycota) chiếm ƣu thế với hơn 90% tổng số loài, nấm nang (Ascomycota) chiếm 8%; nấm nhầy (Myxomycota) chiếm 1,5%; nấm nội cộng sinh (Glomeromycota) chiếm khoảng 0,5% đã đƣợc ghi nhận. Nấm dƣợc liệu ở Việt Nam có khoảng hơn 700 loài trong đó có rất nhiều các loài dƣợc liệu quý nhƣ Linh chi (Ganoderma), nấm Vân chi (Trametes), đông trùng hạ thảo (Cordycep) Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật đã cho thấy nấm lớn là nguồn tài nguyên vô tận ẩn chứa các hợp chất có tác dụng dƣợc liệu (polysaccarit, polysaccarit-protein..) dùng để điều trị bệnh. Ở Việt Nam có ít nhất 651 loài thuộc 182 chi có chứa các hợp chất polysaccarit có tác dụng dƣợc liệu, chúng hầu hết là các glucan với nhiều kiểu liên kết glucosit khác nhau, những hợp chất này có khả năng chống ung thƣ, diệt virut HIV hay hỗ trợ cho hệ miễn dịch của cơ thể con ngƣời. Ngoài những hợp chất có khối lƣợng lớn, những hợp chất chuyển hoá thứ cấp có khối lƣợng nhỏ nhƣ triterpenoit, flavonoit,đƣợc phân lập từ nấm lớn, nhiều hợp chất đã đƣợc ghi nhận có khả năng kháng ung thƣ, kháng khối u, kháng virut hay kháng khuẩn, kháng nấm. Nấm dƣợc liệu ở Việt Nam phong phú, nhiều loài là thuốc quý trong y học cổ truyền, là nguồn tài nguyên vô cùng quý giá cho khoa học và thực tiễn nhƣng chƣa đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu nhiều, chỉ chủ yếu nghiên cứu về sự đa dạng sinh học. Hợp chất thiên nhiên đang tiếp tục đóng vai trò quan trọng trong chƣơng trình tìm kiếm thuốc mới của ngành công nghiệp dƣợc và những ngành nghiên cứu khác. Một lý do quan trọng trong việc sử dụng các sản phẩm thiên nhiên nhƣ nguồn của các hợp chất dẫn đƣờng là phong phú và rất đa dạng cấu trúc của các hợp chất đƣợc phân lập từ thiên nhiên. Hơn nũa, các hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc tìm thấy từ thiên nhiên có thể dùng trực tiếp trong y học, nhiều hợp chất khác đƣợc dùng nhƣ chất dẫn đƣờng hoặc phân tử hiên đại 2 (mẫu) trong lĩnh vực tổng hợp và bán tổng hợp thuốc. Ngày nay, các hợp chất thiên nhiên và dẫn xuất của chúng chiếm 50% lƣợng thuốc điều trị lâm sàng. Trong đó các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ thực vật bậc cao chiếm 25%. Theo các nghiên cứu gần đây của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) khoảng 80% dân số thế giới lựa chọn các bài thuốc y học cổ truyền nhằm chăm sóc sức khoẻ. Chúng tôi nhận thấy việc nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học của các loài nấm dƣợc liệu rất cần thiết, giúp cho chúng ta hiểu hơn về giá trị dƣợc học cũng nhƣ kinh tế và tầm quan trọng của nguồn nấm dƣợc liệu ở nƣớc ta. Chính vì vậy mà chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus (Mont.) Murrill) và nấm vân chi (Trametes cubensis (Mont.) Sacc.) ở vùng Bắc Trung Bộ” nhằm nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên bằng cách sử dụng các kỹ thuật hiện đại nhằm phân tích, phân lập và xác định cấu trúc hiện đại. Đồng thời, thử nghiệm hoạt tính sinh học gây độc tế bào ung thƣ và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các hợp chất này. 2. Đối tƣợng nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu của luận án là quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus (Mont.) Murrill) và quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis (Mont.) Sacc.) đƣợc thu hái ở vùng Bắc Trung Bộ, Việt Nam. 3. Nhiệm vụ nghiên cứu - Chiết hỗn hợp các chất từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) và quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis); - Sử dụng các phƣơng pháp sắc ký để phân lập các hợp chất từ dịch chiết của hai loại nấm trên; - Xác định cấu trúc của những hợp chất phân lập đƣợc; - Thử hoạt tính sinh học của một số hợp chất phân lập đƣợc. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu - Phƣơng pháp lấy mẫu: mẫu sau khi lấy về đƣợc rửa sạch, sấy khô ở 400C. Việc xử lý tiếp các mẫu bằng phƣơng pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu đƣợc hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu đƣợc nêu ở phần thực nghiệm. - Phƣơng pháp phân tích, tách các hỗn hợp và phân lập các chất: sử dụng các phƣơng pháp sắc ký cột thƣờng (CC), sắc ký lớp mỏng phân tích và điều chế, sắc ký cột nhanh (FC) với các pha tĩnh khác nhau nhƣ silica gel, sephadex LH-20, RP18, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích và điều chế trên các pha đảo, pha silica gel. 3 - Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: cấu trúc hoá học các hợp chất đƣợc phân lập đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp vật lý hiện đại nhƣ phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lƣợng va chạm electron (EI- MS), phổ khối lƣợng phun mù electron (ESI-MS), phổ khối lƣợng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) với các kỹ thuật khác nhau nhƣ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC và HMBC. - Cấu trúc lập thể tƣơng đối của các hợp chất này đƣợc xác định bằng các phƣơng pháp phổ NMR với các kỹ thuật NOE, NOESY và phƣơng pháp nhiễu xạ tia X (X-Ray). - Thăm dò các hoạt tính sinh học gây độc tế bào ung thƣ và hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm. 5. Những đóng góp mới của luận án Đây là công trình nghiên cứu về thành phần hoá học và cả về hoạt tính sinh học của một số chất phân lập đƣợc từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) và quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) lần đầu tiên ở Việt Nam. * Từ dịch chiết quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) đã phân lập và xác định cấu trúc 11 hợp chất: - 04 hợp chất secquiterpenoit: nigrofomin A, nigrofomin B, madolin A và dehydrovomifoliol. Nigrofomin A và nigrofomin B là các hợp chất mới; - 02 hợp chất steroit: ergosterol và ergosterol peroxit; - 03 hợp chất phenolic: trans-p-hydroxycoumaric, metyl ferulat và (2- hydroxy-phenyl) axetat; - 01 hợp chất lacton: γ-(4-metyphenyl)-γ-metyl-γ-butyrolacton; - 01 hợp chất axit benzoic; Các hợp chất này lần đầu tiên đƣợc phân lập từ loài nấm này. * Xác định đƣợc các thông số cấu trúc tinh thể của hợp chất nigrofomin A. Các số liệu về tinh thể học của hợp chất này hiện đƣợc lƣu trữ tại Trung tâm dữ liệu Cambridge. * Hai hợp chất nigrofomin A và nigrofomin B đều có khả năng gây độc các dòng tế bào bệnh bạch cầu cấp tính (Jurkat), ung thƣ biểu bì vòm họng ở ngƣời (NPC-TW01), ung thƣ phổi (NCI-H661). * Từ dịch chiết quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) phân lập đƣợc 8 hợp chất: - 04 hợp chất triterpenoit: tramecubin A, tramecubin B, axit eburicoic, 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic. Tramecubin A và tramecubin B là các hợp chất mới; 4 - 02 hợp chất steroit: ergosterol, ergosterol peroxit; - 02 hợp chất coumarin: oospolacton và oospoglycol; Các hợp chất này lần đầu tiên đƣợc phân lập từ loài nấm này. * Hợp chất mới tramecubin A và tramecubin B tiến hành thử hoạt tính khả năng gây độc tế bào ung thƣ gan (Hep-G2), ung thƣ phổi (Lu), ung thƣ biểu mô liên kết (RD); hoạt tính kháng khuẩn với các chủng vi khuẩn Gr (-) (ATCC 25922), vi khuẩn Gr (+) (ATCC 25923); hoạt tính kháng nấm với chủng nấm sợi (439, M42), nấm men (ATCC 7754, SH 20) với các kết quả âm tính. Kết quả thử sơ bộ hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập gợi mở khả năng ứng dụng là nguồn nguyên liệu cho thực phẩm chức năng. 6. Cấu trúc của luận án Luận án bao gồm 131 trang với 21 bảng số liệu, 39 hình và 5 sơ đồ với 127 tài liệu tham khảo. Kết cấu của luận án gồm: mở đầu (4 trang), tổng quan (25 trang), phƣơng pháp và thực nghiệm (25 trang), kết quả và thảo luận (61 trang), kết luận (2 trang), danh mục công trình công bố (1 trang), tài liệu tham khảo (13 trang). Ngoài ra còn có phần phụ lục gồm 110 phổ của một số hợp chất chọn lọc. Chƣơng 1: TỔNG QUAN Luận án đã tiến hành tổng quan tài liệu các nội dung: 1. Những hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn - Giới thiệu về nấm lớn. - Những hợp chất có hoạt tính sinh học từ nấm lớn: kháng khuẩn và kháng nấm; khả năng kháng virut; gây độc tế bào, chống ung thƣ và tăng cƣờng hệ thống miễn dịch và những hoạt tính khác. 2. Nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) - Đặc điểm và sự phân bố. - Thành phần hoá học và hoạt tính của các chất đã đƣợc phân lập 3. Nấm vân chi (Trametes cubensis) - Đặc điểm và sự phân bố. - Thành phần hoá học và hoạt tính sinh học. Chƣơng 2: PHƢƠNG PHÁP VÀ THƢC̣ NGHIÊṂ 2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.1.1. Phƣơng pháp lấy mẫu: Mẫu nấm đƣợc thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm. Mẫu tƣơi sau khi lấy về đƣợc rửa sạch, để nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở 40-600C. Bảo quản ở điều kiện thích hợp dùng để thí nghiệm. 5 2.1.2. Phƣơng pháp chiết xuất, phân lập, xác định cấu trúc các chất phân lập đƣợc: Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích và điều chế; sắc ký cột thƣờng (CC); sắc ký cột nhanh (FC); sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích và điều chế; các phƣơng pháp kết tinh. 2.1.3. Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất: Phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (IR); phổ khối lƣợng (EI-MS), (ESI- MS), (HR-ESI-MS); phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NMR; phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NMR; phổ cộng hƣởng từ hạt nhân DEPT, HMBC, HSQC; cấu trúc lập thể tƣơng của các hợp chất này đƣợc xác định các phƣơng pháp phổ NMR với các kỹ thuật NOE, NOESY và phƣơng pháp nhiễu xạ tia X (X-Ray). 2.1.4. Phuơng pháp thử hoạt tính sinh học Quá trình thử hoạt tính ở Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp Skehan, Likhitwitayawuid, Vander, Vlietlinck, McKane; quá trình tiến hành ở Đại học Y Trung Quốc, Đài Loan đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp Hansen. 2.2. Hóa chất và thiết bị 2.2.1. Hoá chất: Các dung môi để ngâm chiết mẫu nấm đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột nhanh sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). 2.2.2. Thiết bị: sắc ký lớp mỏng (TLC); sắc ký cột (CC); sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC); phổ tử ngoại (UV); phổ hồng ngoại (FT-IR); phổ khối lƣợng (MS); phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR); phổ X-ray; điểm nóng chảy; độ quay cực riêng 2.3. Nghiên cứu các hợp chất từ quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) 2.3.1. Mẫu nấm Quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) đƣợc thu hái ở Vƣờn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An vào tháng 11/2009. Mẫu đƣợc định danh bởi PGS. TS. Ngô Anh (khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế). Tiêu bản (ký hiệu Vinh- TSWu 200901) đƣợc lƣu tại khoa Hóa học, Trƣờng Đại học Vinh. 2.3.2. Phân lập các hợp chất Quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) (1350 g) thu hái tại Vƣờn Quốc gia Pù Mát đƣợc rửa sạch, phơi khô ở điều kiện thƣờng, xay nhỏ cho vào chiết 3 lần với hệ dung môi cloroform: metanol (CHCl3:MeOH = 1:1) ở nhiệt độ thƣờng. Dịch chiết sau khi cất quay chân không thu đƣợc cao chiết NDM (78,0 g). 6 Sơ đồ 2.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất (NDM) -1, -2, -3, -4, -8 và -9 Sơ đồ 2.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất (NDM) -7, -8, -9, -10, -11 7 2.3.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào của 2 hợp chất NDM-1, NDM-2 Tác dụng gây độc tế bào đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp MTT (Micoroculture Tetrazolium Assay) của Hansen. Hoạt tính gây độc tế bào đƣợc thử nghiệm cho hai hợp chất nigrofomin A (NDM-1) và nigrofomin B (NDM- 2) phân lập từ nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) với dòng tế bào bệnh bạch cầu (Jurkat), ung thƣ phổi (NCI H226) và ung thƣ biểu mô vòm họng ở ngƣời (NPC-TW01). 2.4. Nghiên cứu các hợp chất từ quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) 2.4.1. Mẫu nấm Quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) đƣợc thu hái vào tháng 08/2012 ở huyện Kỳ Sơn, tỉnh Nghệ An. Mẫu đƣợc định danh bởi PGS. TS. Ngô Anh (khoa Sinh, Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế). Tiêu bản (ký hiệu Vinh- TSWu 201208) đƣợc lƣu giữ tại khoa Hoá học, Trƣờng Đại học Vinh. 2.4.2. Phân lập các chất Quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) (6,4 kg) đƣợc thu hái, rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 40-50oC trong 48 giờ, toàn bộ mẫu nấm vân chi đƣợc ngâm chiết bằng dung môi metanol trong 14 ngày. Dịch lọc thu đƣợc sau khi ngâm chiết đƣợc cất thu hồi dung môi thu đƣợc cao tổng metanol (580 g). Sơ đồ 2.3. Sơ đồ chiết quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) 1.Chiết với dung môi MeOH 2. Cất giảm áp loại dung môi 1. Phân bố trong H2O. 2.Chiết lần lƣợt với hexan, EtOAc. 3. Cất giảm áp loại dung môi. Quả thể nấm vân chi (Trametes cubensis) Cao MeOH (580 g) Cao DQH (80 g) Cao DQE (380 g) 8 Sơ đồ 2.4: Sơ đồ phân lập các hợp chất DQE-2, DQE-6, DQE-7, DQE-8 Sơ đồ 2.5. Sơ đồ phân lập các hợp chất DQE-3, DQE-4, DQE-5 9 2.4.3. Thử hoạt tính các hợp chất phân lập từ quả thể nấm vân chi 2.4.3.1. Thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất DQE-1 Hợp chất triterpenoit đƣợc phân lập từ quả thể nấm Vân chi (Trametes cubensis) tramecubin A (DQE-1) đƣợc tiến hành thử hoạt tính in vitro với ba dòng tế bào ung thƣ trên ngƣời: ung thƣ gan (Hep-G2-Hepatocellular Carcinoma), ung thƣ phổi (Lu-Human Lung Adenocarcinoma) và ung thƣ mô liên kết (RD-Human Rhabdomycosarcoma). Tác dụng gây độc tế bào đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Skehan. 2.4.3.2. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật của hợp chất DQE-1 Hợp chất mới tramecubin A (DQE-1) đƣợc phân lập từ quả thể nấm Vân chi (Trametes cubensis), ngoài tiến hành thử hoạt tính gây độc một số dòng tế bào ung thƣ còn tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật với các dòng vi khuẩn: khuẩn Gr (-) (Escherichia coli-ATCC25922; Pseudomonas aeruginosa- ATCC25923); khuẩn Gr (+) (Bacillus subtillis- ATCC11774; Staphylococcus aureus subsp. Aureus- ATCC 11632);Hoạt tính kháng nấm với các chủng nấm: nấm sợi (Aspergillus nige- 439; Fusarium oxysporum- M42); nấm men (Cadida albicans- ATCC 7754; Saccharomyces cerevisiae- SH 20). Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUÂṆ 3.1. Nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) 3.1.1. Mẫu nấm Quả thể nấm đa niên lỗ đen (Nigrofomes melanoporus) đƣợc thu hái ở Vƣờn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An vào tháng 11/2011. Mẫu đƣợc định danh bởi PGS.TS Ngô Anh (khoa Sinh, Trƣờng Đại học Khoa học, Đại học Huế). Tiêu bản đƣợc lƣu giữ tại khoa Hoá, Trƣờng Đại học Vinh. 3.1.2. Phân lập các hợp chất Từ dịch chiết metanol của quả thể nấm đa niên lỗ đen bằng cách kết hợp các phƣơng pháp chiết, sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột silica gel, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) phân tích và điều chế với các hệ dung môi rửa giải khác nhau phù hợp với từng phân đoạn. Bảng 3.1. Các hợp chất phân lập từ quả thể nấm đa niên lỗ đen STT Ký hiệu Tên hợp chất Công thức phân tử Khối lƣợng (mg) 1 NDM-1 nigrofomin A C15H18O6 13,2 2 NDM-2 nigrofomin B C15H18O5 8,7 3 NDM-3 trans-p-hydroxycoumaric C9H8O3 32 4 NDM-4 metyl ferulat C11H12O4 15 10 5 NDM-5 -(4-methylphenyl)--methyl-- butyrolacton C12H15O2 37 6 NDM-6 Dehydrovomifoliol C13H22O2 76 7 NDM-7 madolin A C15H22O2 43 8 NDM-8 Ergosterol C28H44O 45 9 NDM-9 ergosterol peroxit C28H44O3 23 10 NDM-10 axit benzoic C7H8O3 128 11 NDM-11 metyl (2-hidroxyphenyl) axetat C9H10O3 750 3.1.3. Xác định cấu trúc các hợp chất 3.1.3.1. Hợp chất NDM-1 (chất mới) Chất NDM-1 là chất dạng tinh thể, không màu, nhiệt độ nóng chảy 208- 2100C, [α]D 25 -31,4° (c = 0,1, MeOH). Phổ ESI-MS (positive) của hợp chất NDM-1 xuất hiện pic m/z 317 [M+Na]+. Phổ khối lƣợng phân giải cao HR-ESI-MS của NDM-1 xuất hiện tín hiệu pic tại m/z 317,1002 [M+Na]+ theo tính toán là công thức C15H18O6Na m/z 317,1001 [M+Na]+, khẳng định công thức phân tử của NDM-1 là C15H18O6. Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy tín hiệu của 15 nguyên tử cacbon bao gồm 1 cacbon nhóm xeton vòng (δC 210,9 ppm); 1 cacbon nhóm cacbonyl của vòng lacton (δC 174,0 ppm); 2 cacbon olefin ở δC 126,3 ppm và 136,3 ppm; 4 cacbon bậc 4 (δC 82,1; 76,7; 60,0; và 45,7 ppm); 1 cacbon nhóm metin (δC 106,6 ppm); 4 nhóm metylen (δC 73,0, 52,5, 40,8 và 32,6 ppm) và 2 nhóm metyl (δC 25,4 ppm và 26,5 ppm). Phổ 1H-NMR, HSQC của hơp chất NDM-1 cho thấy tín hiệu singlet tại δH 1,31; 1,15 ppm của proton 2 nhóm metyl của H-13, H-14; 1 tín hiệu singlet tại δH 6,02 ppm (H-7) của proton liên kết đôi; nhóm metylen liên kết với oxi có tín hiệu doublet tại δH 4,79 ppm (1H) với giá trị J=10,4 Hz và 1 proton có tín hiệu doublet tại δH 4,50 ppm (1H) với J=10,4 Hz là tín hiệu của 2 proton H- 12 và H-12β; tín hiệu proton tại δH 3,53 ppm (1H, d, J= 13,2 Hz, H-1α), 2,19 ppm (1H, d, J= 13,2 Hz, H-1β); 1 nhóm metylen tín hiệu proton tại δH 3,08 (1H, d, J=3,8 Hz), 1,91 (1H, dd, J=3,8 Hz) là của hai proton H-3β, H-3α; tín hiệu singlet tại δH 2,60 ppm (2H) là tín hiệu của nhóm CH2 ở vị trí C-6; ngoài ra tín hiệu singlet của proton axetal tại δH 5,62 ppm (s,H-11). Các tín hiệu proton trên kết hợp với phổ 13C-NMR xuất hiện các tín hiệu tại δH 25,4; 26,5; 126,3; 40,8; 52,5; 70,3 và 32,6 ppm, so sánh với tài liệu cho thấy hợp chất này thuộc lớp chất secquiterpen có kiểu khung drimane và hợp phần dioxabixiclooctan rất hiếm gặp. 11 Phổ HMBC cho thấy vị trí chính xác các nhóm thế trong cấu trúc của NDM-1: tƣơng tác của proton H-3 (δH 3,10 ppm, 1,91 ppm)/ C-2 (δC 210,9 ppm), C-4 (δC 45,7 ppm), C-5 (δC 76,7 ppm), C-13 (δC 25,4 ppm), C-14 (δC 26,5 ppm) và H-13 (δH 3,31 ppm), H-14 (δH 1,15 ppm)/C-3 (δC 52,5 ppm), C-4 (δC 45,7 ppm), C-5 (δC 76,7 ppm). Độ dịch chuyển trƣờng thấp của C-5 và C-9 chứng tỏ có sự liên kết với nhóm OH. Hơn thế, hợp phần dioxabicyclooctan gồm C-8 (δC 136,3 ppm), C-9 (δC 82,1 ppm) và C-10 đƣợc xác định do có tín hiệu tƣơng tác xa trong phổ HMBC của H-11 (δH 5,62 ppm)/C-8, C-12 (δC 73,0 ppm), C-15 (δC 174,0 ppm); H-12 (δH 4,79; 4,50 ppm)/C-7 (δC 126,3 ppm), C- 8, C-9, và H-1/C-2, C-5, C-9, C-10, C-15. Phổ NOESY của chất NDM-1 cho thấy sự tƣơng quan giữa H-14/H-3α, H- 3β, H-6; H-13/H-3α; H-6/H-7. Sự tƣơng quan giữa các proton trong phân tử NDM-1 đƣợc khẳng định chắc chắn thêm bằng phƣơng pháp nhiễu xạ tia X. Một số thông số về hình học của tinh thể NDM-1 Bảng 3.2: Bảng số liệu phổ NMR của hợp chất NDM-1 STT DEPT δC (ppm) δH (ppm) 1 CH2 40,8 2,19 (1H, d, J=13,2 Hz, H-1β) 3,53 (1H, d, J=13,2 Hz, H-1α) 2 C=O 210,9 3 CH2 52,5 1,91 (1H, d, J=3,8 Hz, H-3β) 3,08 (1H, d, J=3,8 Hz, H-3) 4 C 45,7 5 C 76,7 6 CH2 32,6 2,60 (2H, br s) 7 CH 126,3 6,02