Tóm tắt Luận án Nghiên cứu phân lập và thử nghệm hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ một số loài thực vật và nấm nội sinh thực vật

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM *** HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NGUYỄN NGỌC HIẾU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ NGHỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HOẠT CHẤT TỪ MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT VÀ NẤM NỘI SINH THỰC VẬT Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ Mã số: 62.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI – 2019 2 Công trình đƣợc hoàn thành tại: Viện Hoá học Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. TS. Dương Ngọc Tú Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2. PGS. TS. Dương Anh Tuấn Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Số 18 Hoàng Quốc Việt - Cầu Giấy - Hà Nội. Vào hồi giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam 3 I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Việt Nam vẫn nổi tiếng thế giới về tiềm năng đa dạng sinh học cac loài thực vật, với trên 12.000 loài thực vật bậc cao, không kể các loài nấm, tảo, rêu. rất nhiều loài là đặc hữu của Việt Nam. Từ kho tàng kinh nghiệm dân gian, chúng ta đã có rất nhiều kinh nghiệm sử dụng và kết hợp tài tình các nguyên liệu thực vật đa dạng này thành các bài thuốc dân gian hết sức quý giá, đặc sắc, có hiệu quả đặc biệt trong việc chữa bệnh, năng cao sức khỏe con người, bảo vệ mùa màng, diệt trừ sâu bệnh, côn trùng, động vật gây hại..... Với trình độ phát triển khoa học công nghệ hiện nay, cần thiết phải tiếp tục tim tòi, nghiên cứu, chọn lọc từ kinh nghiệm dân gian kết hợp với sự hỗ trợ của công nghệ, thiết bị hiện đại để tạo ra các sản phẩm mới, đưa giá trị sử dụng nguồn tài nguyên thực vật Việt Nam lên tầm cao mới, có giá trị hơn, hiệu quả hơn, được đánh giá cao cả về hàm lượng khoa học công nghệ cũng như giá trị sử dụng. Nấm nội sinh thực vật (NSTV) hiện đang được nghiên cứu sâu và rộng trên thế giới và được kỳ vọng là nguồn tài nguyên vô tận chưa khám phá hết với ngành công nghệ sinh học - dược phẩm. Kết quả thống kê gần đây, với ước lượng 51% số hợp chất có hoạt tính được phân lập từ các chủng nấm NSTV là hợp chất mới, đã cho thấy tiềm năng nghiên cứu và ứng dụng vô cùng to lớn của nấm NSTV. Triển khai tiếp chương trình hợp tác quốc tế giữa Viện Hóa học (Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam) và Viện Sinh dược và Công nghệ sinh học (Đại học Tổng hợp Heirich-Heine Duesseldorf, CHLB Đức) về việc nghiên cứu hệ thực vật Việt Nam để sàng lọc, phát hiện các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học, có tiềm năng sử dụng để chế tạo chế phẩm trừ sâu và nấm bệnh hại cây trồng, cũng như mở rộng sang hướng đối tượng nghiên cứu còn rất mới trên Thế giới cũng như tại Việt Nam là nấm NSTV, chúng tôi đề xuất đề tài nghiên cứu “ Nghiên cứu phân lập và thử nghiệm hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ một số loài thực vật và nấm nội sinh thực vật”. 2. Đối tƣợng nghiên cứu và nội dung của luận án - Đối tượng nghiên cứu của luận án là 4 loài thực vật bao gồm Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre), Gội ổi (Aglaia oligophylla Miq.), Trầu không (Piper betle L.) và Nghệ vàng (Curcuma longa L.) và nấm nội sinh của Ngâu ta, Nghệ vàng và Trầu không. - Nội dung chính của luận án là: + Chiết tách, xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ thành phần của bốn loài thực vật có tiềm năng trừ sâu và nấm bệnh hại cây.. + Phân lập nấm nội sinh từ các mẫu thực vật, chiết tách, xác định cấu trúc các hợp chất hữu cơ thành phần. + Thử nghiệm hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của các chiết phẩm và các hợp chất hữu cơ thành phần. 3. Ý nghĩa khoa học của Luận án: 3.1. Ý nghĩa lý thuyết: 4 Luận án bổ sung nguồn tư liệu và khả năng khai thác, ứng dụng một số loại thực vật và nấm nội sinh thực vật Việt Nam. Đồng thời kết quả của Luận án khẳng định xu hướng tìm kiếm, sử dụng các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học từ thực vật và nấm nội sinh thực vật là khả thi và có ý nghĩa thực tế cao. Luận án cũng là tư liệu giúp cho sinh viên và nhà khoa học quan tâm đến lĩnh vực này tham khảo. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả của Luận án đã được sử dụng để gia công chế tạo chế phẩm thảo mộc trừ sâu và nấm bệnh, đã được khảo nghiêm thành công hiệu lực trừ sâu và nấm bệnh trên đồng ruộng Việt Nam. 4. Những đóng góp mới của luận án 4.1. Lần đầu tiên ở Việt Nam, mối liên quan giữa thực vật và nấm nội sinh thực vật trên các loài Ngâu, Nghệ vàng và Trầu không về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học đã được nghiên cứu một cách có hệ thống. Đã phát hiện có những khác biệt giữa thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chiết phẩm thực vật và nấm nội sinh. Điều này khẳng định mối quan hệ cộng sinh, hỗ trợ giữa cây chủ và nấm nội sinh, cũng như tiềm năng tìm kiếm từ nấm nội sinh thực vật các hoạt chất thay thế để sản xuất chế phẩm sinh học. 4.2. Tổng số có 19 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc (bao gồm: 7 hợp chất từ cây Ngâu ta (A. duperreana Pierre) và cây Gội ổi (A. oligophylla Miq.) gồm 6 hợp chất đã biết rocaglamide A, I, W, AB, J, rocaglaol và 1 hợp chất mới rocaglamide AY; 2 hợp chất đã biết ar-tumeron, curcumin từ cây Nghệ vàng (C. longa L.); 3 hợp chất đã biết eugenol, chavicol, 4-Allylpyrocatechol từ cây Trầu không (P. betle L.); 2 hợp chất đã biết scopararane C, diaporthein B từ nấm nội sinh cây Ngâu (M. hawaiiensis); 4 hợp chất đã biết β-sitosterol, 4R,4aS,9aR)-1,9a-dihydronidulalin A, 4S,4aR, 9aR)-4a-carbomethoxy-1,4,4a,9a-tetrahydro-4,8-dihydroxy- 6- methylxanthone, (24R)-methylcholesta-7,22-diene-3β,5α,6β-triol từ nấm nội sinh cây Nghệ vàng (F. oxysporum); và ergosterol từ nấm nội sinh cây Trầu không (F. solani) và đã nhận dạng 12 acid béo từ nấm nội sinh cây Nghệ vàng (F. oxysporum) bằng GC- MS. 4.3. Tổng số có 9 chủng nấm nội ký sinh thực vật đã được phân lập và định danh. Đây là những công bố đầu tiên về khu hệ các chủng nấm nội sinh trên cây ngâu ta, nghệ vàng và trầu không Việt Nam. 4.4. Các phần chiết cành lá và vỏ cây Ngâu ta thể hiện hoạt tính 100% ức chế sinh trưởng sâu khoang (Spodoptetra litura). Các phần chiết nghệ vàng, nấm nội sinh nghệ vàng, nấm nội sinh trầu không và tinh chất curcumin ức chế 100% sinh trưởng nấm gây bệnh thối xám (Botrytis cinera). Lần đầu tiên cây nghệ vàng và tinh chất curcumin được nghiên cứu một cách hệ thống để sử dụng làm nguyên liệu gia công chế phẩm thuốc trừ nấm sinh học. 5. Bố cục của luận án Luận án có 141 trang, gồm: Mở đầu (4 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (32 trang), Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (13 trang), Chương 3: Thực nghiệm (19 trang), Chương 4: Kết quả và thảo luận (44 trang), Kết luận (1 trang) và 5 Kiến nghị (1 trang), Danh mục các công trình đã công bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (16 trang) và Phụ lục (43 trang). Phần Tài liệu tham khảo có 159 tài liệu về lĩnh vực liên quan đến luận án, được cập nhật đến năm 2018. Phần Phụ lục gồm 43 trang, gồm các loại phổ của các hợp chất phân lập được trong luận án. II. NỘI DUNG LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính cấp thiết và thực tiễn, đối tượng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của luận án. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Côn trùng, nấm bệnh gây hại và vai trò của thuốc bảo vệ thực vật 1.2. Xu hướng thay thế thuốc BVTV hóa học bằng thuốc BVTV gốc sinh học 1.3. Thuốc BVTV sinh học chiết xuất từ nguyên liệu thực vật 1.4. Nấm nội sinh thực vật và triển vọng tìm kiếm các hoạt chất BVTV sinh học thế hệ mới 1.5. Giới thiệu về loài Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre), Gội ổi (Aglaia oligophylla Miq.), Trầu không (Piper betle L.) và Nghệ vàng (Curcuma longa L.) ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Đối tượng nghiên cứu 4 loại thực vật gồm cây Ngâu ta, Gội nếp, Trầu không và Nghệ vàng và 3 chủng nấm nội sinh phân lập từ cây Ngâu, Nghệ và Trầu không. 2.2.Phương pháp nghiên cứu 2.2.1.Phương pháp phân lập, tinh chế các hợp chất 2.2.2.Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất 2.2.3.Phương pháp phân lập và sinh khối nấm nội sinh thực vật 2.2.4. Phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của dịch chiết, phân đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Kết quả phân lập nấm nội sinh từ các mẫu thực vật + Bốn (04) chủng nấm nội sinh đã được phân lập từ nghệ vàng là Fusarium solani, Fusarium sp., Trichoderma atroviride và Fusarium oxysporum. + Ba (03) chủng nấm nội sinh, được phân lập từ cây ngâu là Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum crassipes và Microdiplodia hawaiiensis. + Hai (02) chủng nấm nội sinh đã được phân lập từ cây trầu không là Colletotrichum sp. và Fusarium solani. 3.2. Kết quả phân lập các hợp chất từ thực vật 3.2.1. Phân lập hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia duperreana) 3.2.1.1. Xử lý mẫu thực vật 6 Mẫu vỏ cây Ngâu ta khô (3kg) được ngâm chiết 3 lần metanol trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch tổng thu được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ 45 oC thu được 115g cặn cô metanol. Cặn cô metanol được thêm nước và chiết với dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan và etyl axetat. Sau khi đuổi dung môi thu được cặn dịch n-hexan (25g), etyl axetat (20g) và metanol (65g) tương ứng. 3.2.1.2. Phân lập các hợp chất từ cặn etyl axetat vỏ cây Ngâu ta Cặn etyl axetat (AD.E, 20g) được phân tách bằng sắc ký cột VLC với hệ dung môi rửa giải gradien n-hexan:EtOAc:MeOH (hệ dung môi 4:2:1 đến 0:1:1) thu được 8 phân đoạn ký hiệu từ ADE1 đến ADE8. Sơ đồ 3.2.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta Tiến hành chạy cột sắc ký cột phân đoạn ADE3 (5,4 g) trên silica gel (40-63µm) với hệ dung môi gradient CH2Cl2-MeOH (từ 100:0 đến 0:100) thu được 9 phân đoạn, ký hiệu là ADE3.1-ADE3.9. Phân đoạn từ ADE3.1 (1,29 g) tiến hành chạy cột CC với dung môi CH2Cl2:isopropanol thu được 9 phân đoạn (ADE3.1.1 đến ADE3.1.9). Gom các phân đoạn ADE3.1.4-ADE3.1.7 (412mg) tiến hành chạy cột sephadex với dung môi methanol, thu được 36 phân đoạn nhỏ. Sử dụng TLC và HPLC gom các ống 1-36 thu được 6 chất sạch thu được dưới dạng bột màu trắng vô định hình. Quy trình phân tách các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia dupperreana Pierre) được miêu tả trên sơ đồ 3.2.1. • Hợp chất 1: Hợp chất 1 (3,9 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20D-90.5 (c, 0.25, CHCl3). UV (MeOH) λmax 219.7 và 273.0 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 561,1 (M+H)+, 528,4 (M+Na)+ 1H-NMR (MeOD): δ ppm 4,95 (d, J = 6.9 Hz, H-1), 4,11 (dd, J = 6.9 Hz, 13,8 Hz , H- 2), 4,36 (d, J =13,8 Hz, H-3), 6,30 (d, J =1,9Hz, H-5), 6,17 (d, J =1,9 Hz, H-7), 7,12 (d, J=8,8 Hz, H-2’), 6,64 (d, J=8,8 Hz, H-3’), 6,64 (d, J =8,8 Hz, H-5’), 7,12 (d, J = 8,8 Hz, H-6’), 6,86 (m, H-2”), 6,98 (m, H-3”), 6,98 (m, H-4”), 6,98 (m, H-5”), 6,86 7 (m, H-6”), 3,81 (s, OMe-6), 3,84 (s, OMe-8), 3,66 (s, OMe-4’), 3,34 (s) & 2,86 (s) NMe. • Hợp chất 2: Hợp chất 2 (3,8 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20D-80 (c, 0.45, CHCl3). Dữ kiện phổ hợp chất 2. UV (MeOH) λmax 209 và 279 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 564,1 (M+H)+, 586,4 (M+Na)+ 1H-NMR (MeOD): δ ppm 6,03 (d, J = 5,0 Hz, H1), 4,29 (dd, J = 5,0 Hz, 14,5 Hz , H2), 4,29 (d, J =14,5 Hz, H3), 6,26 (d, J =1,9 Hz, H5), 6,11(d, J =1,9 Hz, H7), 6,78 (d, J=1,9 Hz, H-2’), 6,62 (d, J =8,2 Hz, H-5’), 6,70 (d, J = 6,9 Hz, H-6’), 7,02 (m, H-2”), 6,98 (m, H-3”), 6,98 (m, H-4”), 6,98 (m, H-5”), 7,02 (m, H-6”), 3,81 (s, OMe-6), 3,73 (s, OMe-8), 3,71 (s, OMe-4’), 3,37 (s) & 2,79 (s) NMe, 1,81 (s, OCOCH3) • Hợp chất 3: Hợp chất 3 (2,1 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20D-55,0 (c, 0.45, CHCl3). Dữ kiện phổ hợp chất 3. UV (MeOH) λmax 210 và 272,5 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 534,1 (M+H)+, 556,4 (M+Na)+ 1H-NMR (MeOD): δ ppm 5,99 (d, J = 6,3 Hz, H1), 3,94 (dd, J = 5,9 Hz, 14,5 Hz , H2), 4,19 (d, J =14,5 Hz, H3), 6,26 (d, J =1,9 Hz, H5), 6,12 (d, J =1,9 Hz, H7), 7,17 (d, J=8,8 Hz, H-2’), 6,61 (d, J =8,8 Hz, H-3’), 6,61 (d, J = 8,8 Hz, H-5’), 7,17 (d, J=8,8 Hz, H-6’), 6,91 (m, H-2’), 7,00 (m, H-3”), 7,00 (m, H- 4”), 7,00 (m, H-5”), 6,91 (m, H-6”), 3,74 (s, OMe-6), 3,81 (s, OMe-8), 3,65 (s, OMe-4’), 2,57 (s, NMe), 1,84 (s, OCOCH3) . • Hợp chất 4; Hợp chất 4 (7,2 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu ta (A. dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20D-110,0 (c, 0.45, CHCl3). Phổ UV (MeOH) λmax 210,4 và 272,6 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 548,2 (M+H)+, 570,4 (M+Na)+ 1H-NMR (MeOD): δ ppm 5,95 (m, H1), 4,21 (m, H2), 4,21 (m, H3), 6,18 (d, J =1,9 Hz, H5), 6,03 (d, J =1,9 Hz, H7), 7,08 (d, J=8,8 Hz, H-2’), 6,54 (d, J =8,8 Hz, H-3’), 6,54 (d, J = 8,8 Hz, H-5’), 7,08 (d, J=8,8 Hz, H-6’), 6,80 (m, H-2”), 6,92 (m, H-3”), 6,92 (m, H-4”), 6,92 (m, H-5”), 6,80 (m, H-6”), 3,64 (s, OMe-6), 3,72 (s, OMe-8), 3,56 (s, OMe-4’), 3,27 (s) & 2,69 (s) NMe, 1,71 (s, OCOCH3) . • Hợp chất 5: Hợp chất 5 (1,9 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20D-41,1 (c, 0.22, CHCl3). 8 Phổ UV (MeOH) λmax 211,3 và 278,7 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 509,0 (M+H)+, 531,2 (M+Na)+ 1H-NMR (MeOD): δ ppm 5,00 (d, J =5,7 Hz, H1), 3,96 (dd, J =5,7 Hz & 13,9 Hz, H2), 4,21 (d, J = 13,9, H3), 6,27 (d, J =1,9 Hz, H5), 6,15 (d, J =1,9 Hz, H7), 6,70 (d, J=1,9 Hz, H-2’), 6,64 (d, J = 8,8 Hz, H-5’), 6,64 (d, J=8,8 Hz, H-6’), 6,91 (m, H-2”), 7,00 (m, H-3”), 7,00 (m, H-4”), 7,00 (m, H-5”), 6,91 (m, H-6”), 3,81 (s, OMe-6), 3,82 (s, OMe-8), 3,67 (s, OMe-4’), 3,61 (s, OCOCH3) . • Hợp chất 6; Hợp chất 6 (10 mg) được phân lập từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia dupperreana) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20D-125 (c, 0.48, CHCl3). UV (MeOH) λmax 212,8 và 272,3 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 457,10 (M+H)+, 890,9 (2M+Na)+ 1H-NMR (MeOD): δ ppm 4,69 (d, J =5,5 Hz, H1), 2,80 (ddd, J =6,3 Hz & 13,5 Hz, 14, 0 Hz, H-2α), 2,06 (ddd, J =1,1 Hz & 6,2 Hz, 11,8 Hz, H-2β) 3,89 (dd, J = 13,5 & 14,0 Hz, H3), 6,28 (d, J =1,9 Hz, H5), 6,17 (d, J =1,9 Hz, H7), 7,10 (d, J=8,8 Hz, H- 2’), 6,61 (d, J = 8,8 Hz, H-3’), 6,61 (d, J=8,8 Hz, H-5’), 7,10 (d, J = 8,8 Hz, H-6’), 7,00 (m, H-2”), 7,00 (m, H-3”), 7,00 (m, H-4”), 7,00 (m, H-5”), 7,00 (m, H-6”), 3,87 (s, OMe-6), 3,85 (s, OMe-8), 3,81 (s, OMe-4’). 3.2.2. Phân lập hợp chất từ lá cây Gội ổi (Aglaia oligophylla) 3.2.2.1. Xử lý mẫu thực vật Mẫu lá cây Aglaia oligophylla (3kg) được ngâm chiết 3 lần metanol trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch tổng thu được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ 45 oC thu được 100g cặn cô metanol. Cặn cô metanol được thêm nước và chiết với dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan, diclometan và etyl axetat. Sau khi đuổi dung môi thu được cặn dịch n-hexan (20g), diclometan (3.6g), etyl axetat (18g) và metanol (55g) tương ứng. 3.2.2.2. Phân lập các hợp chất từ cặn diclometan lá cây Gội ổi Cặn chiết diclomethan của lá gội ổi (AO.D, 3.6 g) được tiến hành tách với cột VLC silicagel 60 thu được 7 phân đoạn (AOD1 đến AOD7). Phân đoạn OAD3 được tiếp tục chạy CC sử dụng hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (10:1) thu được 3 phân đoạn (OAD3.1 đến OAD3.3). Hợp chất 7 thu được bằng chạy HPLC điều chế phân đoạn OAD3.2, detector λ=210 nm với hệ dung môi MeOH:H2O (3:7). Sơ đồ 3.2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây Gội 9 • Hợp chất 7 (chất mới); Hợp chất 7 (3,3 mg) được phân lập từ lá cây gội ổi (Aglaia oligophylla Muq.) dưới dạng vô định hình màu trắng, [α]20D-50,5 (c, 0.45, CHCl3). UV (MeOH) λmax 210,4 và 271,1 nm. Phổ khối bụi electron ESI-MS (positive mode): m/z 528,1650 (M+Na)+ tương ứng với C28H27NO8Na. Dữ liệu phổ của hợp chất 7 xem bảng 4.3.1.1 3.2.3. Phân lập hợp chất từ củ Nghệ vàng (Curcuma longa) 3.2.3.1. Xử lý mẫu thực vật Củ nghệ vàng sau khi sấy khô được nghiền mịn, chiết với dung môi ethyl acetate, loại dung môi sau đó cất lôi cuốn hơi nước thu được tinh dầu. 3.2.3.2. Phân lập các hợp chất Tinh dầu nghệ (TDN, 30.8g) được phân tách trên sắc ký cột silica gel với hệ dung môi gradient n-hexan-ethyl acetate thu được 12 phân đoạn. Phân đoạn 3 được tinh chế lại bằng sephadex LH20 với dung môi rửa giải MeOH thu được hợp chất 8 (2.8mg). Sơ đồ 3.2.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ củ Nghệ vàng Phần cặn nghệ sau khi chưng cất lôi cuốn hơi nước lấy tinh dầu được tiến hành chiết 3 lần với dung môi ethyl acetat hoặc cồn thực phẩm 960. Dịch chiết được cô chân không cho đến khi chỉ còn là dịch đặc thì được để ở nhiệt độ phòng để kết tủa curcuminoid. Sau 24 giờ tiến hành lọc được curcuminoit bán tinh. Curcuminoid thô được loại sáp 10 bằng cồn lạnh sau đó tiến hành tinh chế trong cồn (hòa tan curcumin bán tinh có khuấy trong cồn thực phẩm 960 ở nhiệt độ sôi), để nguội tới nhiệt độ phòng qua đêm để kết tinh curcuminoid. Hỗn hợp Curcuminoid kết tinh được lọc chân không thu được sản phẩm curcuminoit tinh. Curcumin tinh (chất 9, 12.3mg) được tinh chế bằng phương pháp sắc ký bản mỏng điều chế với hệ dung môi diclometan:metanol (98 : 2). • Hợp chất 8: Hợp chất 8 thu đươc dưới dang dầu, không màu, UV 234-235nm. Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz), δH ppm 1,23 (d, 3H, J = 7 Hz, 15-CH3); 1,84 (brs, 3H, 12-CH3); 2,1 (s, 3H, 13-CH3); 2,3 (s, 3H, 4-CH3); 2,61 (m, 1H, H-); 2,69 (m, 1H, H-8); 3,28 (m, 1H, H-7); 6,02 (s, 1H, =CH-C=0, H-10); 7,1 (m, 4H, H-2,3,5,6). 13C-NMR: (CDCl3, 125MHz) δC ppm 20,6 (C-12); 20,9 (C-15); 21,9 (C-14); 27,6 (C-13); 35,2 (C-7); 52,68 (C-8); 124,0 (C-10); 126,6 (C-2,C-6); 129,09 (C-3, C-5); 135,5 (C-4); 143,6 (C-1); 155,0 (C-11); 199,8 (C- 9). • Hợp chất 9: Curcumin tinh chất (hợp chất 9) được tinh chế bằng phương pháp sắc ký bản mỏng điều chế với hệ dung môi diclometan : metanol (98 : 2). Dữ liệu cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy đây là hỗn hợp 50:50 của hai cấu dạng enol và xeton của curcumin. 3.2.4. Phân lập hợp chất từ lá cây Trầu không (Piper betle L.) 3.2.4.1. Xử lý mẫu thực vật Mẫu lá Trầu không khô (5kg) được ngâm chiết 3 lần metanol trong thiết bị siêu âm ở nhiệt độ phòng. Dịch tổng thu được cất kiệt dung môi dưới áp suất giảm, nhiệt độ 45 oC thu được 240g cặn cô metanol. Cặn cô metanol được thêm nước và chiết với dung môi có độ phân cực tăng dần n-hexan và etyl axetat. Sau khi đuổi dung môi thu được cặn dịch n-hexan (55g), etyl axetat (50g) và metanol (130g) tương ứng. 3.2.4.2. Phân lập các hợp chất từ cặn n-hexan lá Trầu không Cặn chiết n-hexan (TKH, 50g) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel (63-100µm) với hệ dung môi rửa giải gradien n-hexan-etyl axetat (từ 100:0 đến 1:1) thu được 10 phân đoạn ký hiệu từ TKH1 đến TKH10. Sơ đồ 3.2.4 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây Trầu không Tiến hành chạy cột sắc ký cột phân đoạn TKH4 (1.2g) trên silica gel (40-63µm) với hệ dung môi gradien n-hexan-etyl axetat (từ 100:0 đến 80:20) thu được 4 phân đoạn, ký hiệu là TKH4.1-TKH4.4. Phân đoạn TKH4.4 (15 mg) được tinh chế bằng bản 11 mỏng điều chế với hệ dung môi n-hexan-etyl axetat 95:5 thu được chất sạch 10 (10mg). Phân đoạn TKH6 (3.99g) được tinh chế tiếp trên cột silica gel với hệ dung môi gradien n-hexan-etyl axetat (từ 95:5 đến 75:25) thu được 4 nhóm phân đoạn, ký hiệu là TKH6.1-TKH6.4. Phân đoạn TKH6.4 (0,797 g) được phân tách lặp lại trên cột CC thu được chất sạch 11 (150 mg). 15mg của phân đoạn TKH7 được tinh chế bằng phương pháp điều chế bản mỏng với hệ dung môi là n-hexan-etyl axetat (4:1) thu được chất sạch 12 (11,2 mg). Quy trình tách chiết các hợp chất từ cây Trầu không được mô tải tại sơ đồ 3.2.4. • Hợp chất 10: Hợp chất 10 thu được dưới dạ