Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thu nhận fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ Sargassum tại Nha Trang - Khánh Hòa bằng phương pháp hóa học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÊ XUÂN SƠN NGHIÊN CỨU THU NHẬN FUCOIDAN KHỐI LƢỢNG PHÂN TỬ THẤP TỪ RONG MƠ SARGASSUM TẠI NHA TRANG - KHÁNH HÒA BẰNG PHƢƠNG PHÁP HÓA HỌC TÓM TĂT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Công nghệ chế biến thủy sản Mã số : 9540105 KHÁNH HÒA - 2018 Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Nha Trang Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Vũ Ngọc Bội 2. TS. Nguyễn Duy Nhứt Phản biện 1: GS.TS Trần Thị Luyến Phản biện 2: TS. Khổng Trung Thắng Phản biện 3: PGS.TS. Nguyễn Hữu Đại Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại Trường Đại học Nha Trang vào hồi .... giờ .... ngày ..... tháng ..... năm 2018 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia và Thư viện Trường Đại học Nha Trang 1 TÓM TẮT NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Đề tài luận án: Nghiên cứu thu nhận fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ Sargassum tại Nha Trang - Khánh Hòa bằng phương pháp hóa học Chuyên ngành: Công nghệ Chế biến thủy sản Mã số: 9540105 Nghiên cứu sinh: ThS. Lê Xuân Sơn Khóa: 2011 Ngƣời hƣớng dẫn: 1) PGS. TS. Vũ Ngọc Bội Đại học Nha Trang 2) TS. Nguyễn Duy Nhứt Viện nghiên cứu ứng dụng công nghệ Nha Trang Cơ sở đào tạo: Trường Đại học Nha Trang Nội dung: Luận án đã thu được một số kết quả mới bổ sung vào lĩnh vực nghiên cứu, sản xuất fucoidan và fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ: 1) Luận án đã khảo sát hàm lượng fucoidan từ 5 loài rong mơ Sargassum thu mẫu ở vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa cho thấy rong mơ S. polycystum có hàm lượng fucoidan (so với hàm lượng chất khô) cao nhất và đạt mức 3,54 ± 0,02%, tiếp theo thứ tự hàm lượng fucoidan giảm dần là các loài rong: S. oligocystum với hàm lượng 3,23 ± 0,02%, S. swartzii với hàm lượng 2,94 ± 0,01%, S. deticarpum với hàm lượng: 2,04 ± 0,00%, S. mcclurei với hàm lượng 1,34 ± 0,06%. 2) Luận án đã xác định được các điều kiện tối ưu hóa cho quá trình chiết fucoidan từ rong S. polycystum: chiết bằng dung dịch HCl 2M tỉ lệ dung môi/nguyên liệu: 16/1, pH tối ưu của dung môi chiết là 3,4, nhiệt độ chiết tối ưu là 770C, trong thời gian chiết tối ưu là 48 phút và phương thức chiết sử dụng là xay - chiết với hiệu suất chiết đạt 84,17%. 3) Luận án đã xác định được các điều kiện thích hợp cho quá trình phân cắt fucoidan tự nhiên từ rong S. polycystum tạo thành fucoidan khối lượng phân tử thấp (Khối lượng phân tử ≤100kDa) có hoạt tính làm giảm lipid máu: phân cắt bằng hỗn hợp H2O2/ascorbic acid với nồng độ tối ưu là 37,5/37,5 (mmol/mmol, ở nhiệt độ tối ưu là 680, thời gian cắt mạch tối ưu là 96 phút và hiệu suất cắt mạch đạt 85,18%. 4) Luận án đã đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của sản phẩm F- KLPTT từ rong S. polycystum cho thấy ở liều dùng F-KLPTT 2580 mg/kg/ngày và sử dụng liên tục trong 7 ngày thì sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp không gây độc với chuột thí nghiệm, ở liều dùng 1.400mg/kg khối lượng/ngày trong thời gian 90 ngày không gây bất cứ một ảnh hưởng nào tới trạng thái sinh lý của chuột lang thí nghiệm. 5) Luận án đã đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của fucoidan khối lượng phân tử thấp từ 05 loài rong mơ (S. polycystum, S. oligocystum, S. mcclurei, S. denticarpum, S. swartzii) ở phân đoạn có khối lượng phân tử 10÷100kDa và phân đoạn có khối lượng phân tử nhỏ hơn 10kDa cho thấy fucoidan khối lượng phân tử thấp 10÷100kDa từ 03 loài S. polycystum, S. oligocystum, S. mcclurei có hoạt tính làm giảm lipid máu của chuột lang sau 2 28 ngày nuôi thử nghiệm. 6) Luận án đã xác định cấu trúc của fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ S. polycystum sinh trưởng ở vịnh Nha Trang - Khánh Hòa cho thấy cấu trúc một mảnh đại diện của phân đoạn là: fuc-uro-hexSO3H-hex. 7) Luận án đã nghiên cứu sản xuất thử nghiệm sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ S. polycystum sinh trưởng ở vịnh Nha Trang - Khánh Hòa. Kết quả đánh giá sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp được sản xuất theo quy trình luận án đạt tiêu chuẩn an toàn thực phẩm về các chỉ tiêu kim loại nặng và vi sinh vật. CÁN BỘ HƢỚNG DẪN NGHIÊN CỨU SINH PGS. TS. Vũ Ngọc Bội TS. Nguyễn Duy Nhứt Lê Xuân Sơn 3 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Rong mơ có chứa nhiều hợp chất sinh học có giá trị dược dụng cao. Trong số đó, fucoidan là polysaccharid có nhiều hoạt tính sinh học có giá trị như hoạt tính chống đông máu, kháng khuẩn, kháng vi rút, chống ung thư, chống oxy hóa, kháng viêm, miễn dịch và có hoạt tính làm giảm lipid máu. Nhiều kết quả nghiên cứu cũng đã chứng minh rằng fucoidan khối lượng phân tử thấp (F- KLPTT) có hoạt tính sinh học và đặc biệt là hoạt tính làm giảm lipid máu cao hơn so với fucoidan phân tử lượng lớn. Từ fucoidan tự nhiên, người ta có thể phân cắt thành (F- KLPTT). Quá trình phân cắt fucoidan có thể được thực hiện bằng một số phương pháp khác nhau như phương pháp enzyme, phương pháp hóa học. Trong đó, phương pháp phân cắt fucoidan bằng phương pháp hóa học sử dụng tác nhân H2O2 kết hợp với axit ascorbic được chứng minh là không ảnh hưởng đến cấu trúc tự nhiên của fucoidan. Vùng biển Nha Trang được coi là vùng biển ấm có nguồn lợi rong mơ Sargassum khá đa dạng về thành phần loài với trữ lượng lớn và có chứa fucoidan với hàm lượng cao. Hiện đã có một số công trình công bố nghiên cứu về fucoidan từ rong mơ thu mẫu tại vùng biển Nha Trang. Tuy vậy, chưa có công trình nào công bố về fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ Nha Trang - Khánh Hòa. Do vậy việc tiến hành nghiên cứu về fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ Khánh Hòa làm cơ sở cho việc phát triển thương mại hóa sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp dùng làm thực phẩm chức năng là hướng nghiên cứu cần thiết và có triển vọng. Chính vì thế, luận án thực hiện đề tài: “Nghiên cứu thu nhận fucoidan khối lượng phân tử thấp từ rong mơ Sargassum tại Nha Trang - Khánh Hòa bằng phương pháp hóa học”. 2. Mục đích của luận án Xây dựng qui trình sản xuất fucoidan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính sinh học làm giảm lipid máu bằng phương pháp hóa học từ nguyên liệu rong mơ Khánh Hòa. 3. Nguyên vật liệu và phạm vi nghiên cứu 3.1. Nguyên vật liệu + Nguyên liệu rong: 05 loài rong mơ S. polycystum, S. oligocystum, S. mcclurei, S. denticarpum, S. swartzii thu mẫu tại vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa. + Chuột thí nghiệm: Chuột lang (Cavia porcellus), có trọng lượng trung bình 300 ÷ 350g/con được sử dụng để đánh giá độc tính và hoạt tính làm giảm lipid máu của sản phẩm F- KLPT. Chuột lang do Viện Vaccine và Sinh phẩm Y tế Nha Trang cung cấp. 3.2. Phạm vi nghiên cứu 1) Đánh giá hàm lượng fucoidan của 05 loài rong mơ: S. polycystum, S. mcclurei, S. oligocystum, S. swartzii, S. denticarpum thu mẫu ở vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa. 2) Nghiên cứu điều kiện tối ưu tách chiết fucoidan tự nhiên từ loài rong mơ Sargassum có hàm lượng fucoidan cao nhất trong 05 loài đã được đánh giá. 3) Nghiên cứu điều kiện tối ưu cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành fucoidan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính làm giảm lipid máu bằng tác nhân hỗn hợp hydrogen peroxide và axit ascorbic. 4) Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn của fucoidan khối lượng phân tử thấp thu 4 nhận được trên chuột thí nghiệm. 5) Đánh giá hoạt tính làm giảm lipid máu của các phân đoạn fucoidan khối lượng phân tử thấp trên chuột thí nghiệm. 6) Phân tích đặc trưng cấu trúc của fucoidan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính làm giảm lipid máu. 7) Đề xuất quy trình và sản xuất thử sản phẩm fucoidan khối lượng phân tử thấp có hoạt tính làm giảm lipid máu. 4. Phƣơng pháp nghiên cứu Sử dụng các phương pháp phân tích hiện đại của Việt Nam và thế giới: Xác định hàm lượng fucoidan bằng phương pháp so màu của Dische và Shettles trên thiết bị ELISA MR- 96A (Mindray); Xác định thành phần đường đơn của fucoidan bằng phương pháp sắc ký khí thông qua phản ứng axetyl hóa các sản phẩm thủy phân fucoidan theo kỹ thuật của Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự trên máy GC17A Shimadzu FID; Các phương pháp các định cấu trúc của fucoidan: Phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) của fucoidan được đo trên máy Bruker AVANCE 500, Phổ hồng ngoại IR đo trên máy IMPACT 410 của hãng NICOLET (Mỹ), Phổ ESI-MS đo trên thiết bị LC/MSD ion trap 1100 tại Viện Hoá Học. Đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn và hoạt tính làm giảm lipid máu của (F- KLPTT) trên chuột thí nghiệm. Đồng thời, luận án cũng sử dụng các phương pháp toán học trong tối ưu hóa quá trình thí nghiệm nhằm đảm bảo kết quả thí nghiệm có độ tin cậy cao. Các kết quả thí nghiệm đều được xử lý thống kê, kiểm định so sánh các giá trị trung bình giữa các nhóm bằng phần mềm MS Excel 2010, SPSS 18. Phân tích dữ liệu và tiên đoán bề mặt đáp ứng bằng phần mềm Modde 5.0 5. Kết cấu của luận án Luận án bao gồm 170 trang, trong đó: mở đầu: 3 trang, tổng quan: 36 trang, phương pháp nghiên cứu: 23 trang, kết quả nghiên cứu: 84 trang, kết luận và kiến nghị: 2 trang, danh mục công trình đã công bố của luận án: 1 trang, tài liệu tham khảo 21 trang. Luận án có 35 bảng, 86 hình, 164 tài liệu tham khảo (tiếng Việt: 13 tài liệu, tiếng Anh: 151 tài liệu) và phụ lục. 5 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ RONG MƠ 1.1.1. Phân loại rong mơ Ở Việt Nam, có khoảng 147 loài rong nâu, trong đó các loài rong thuộc chi Sargassum (rong mơ) có trữ lượng lớn nhất với khoảng 68 loài được phân bố phổ biến ở các vùng ven biển và đảo. Riêng ở Khánh Hòa, sản lượng khai thác rong mơ tự nhiên ước tính khoảng 7.300 tấn khô/năm trên diện tích phân bố trên 1.167 ha. Rong mơ Sargassum được phân loại: Ngành Phaeophyta; Lớp: Phaeophyceae; Bộ: Fucales; Họ: Sargassaceae; Chi: Sargassum. 1.1.2. Cấu trúc thành tế bào rong nâu Thành phần của thành tế bào rong nâu chủ yếu là cellulose được cấu tạo từ các phân tử glucose liên kết với nhau nhờ các liên kết β-(1-4)-glucoside. Fucoidan tồn tại trong cấu trúc thành tế bào rong nâu có thể ở trạng thái tự do hoặc là tạo cầu nối giữa các phân tử cellulose và alginate bằng các liên kết hydro. 1.2. GIỚI THIỆU VỀ FUCOIDAN 1.2.1. Fucoidan và hoạt tính sinh học Fucoidan là thuật ngữ gọi tên cho các sulfate polysaccharid có cấu tạo bao gồm 02 thành phần chính là L-fucose và gốc sulfate tồn tại trong thành tế bào của rong nâu. Trong cấu trúc phân tử fucoidan còn có thể có các gốc đường đơn khác như galactose, glucose, manose, xylose, và axit uronic. Hàm lượng fucoidan khoảng từ 2 ÷ 10% so với khối lượng rong khô, tồn tại trong cấu trúc thành tế bào và không bào của rong nâu, khối lượng trung bình khoảng 7 kDa đến 22.000 kDa tùy thuộc vào từng loài, điều kiện môi địa lý, thời gian thu hoạch của rong. Hoạt tính sinh học và tiềm năng ứng dụng của fucoidan rất đa dạng, tùy thuộc vào từng loài của rong nâu, đặc tính cấu trúc, KLPT, Fucoidan có khả năng hỗ trợ điều trị rất nhiều chứng bệnh như kháng rối loạn lipid máu và bệnh vữa xơ động mạch, chống béo phì, kháng ung thư, điều trị gan, tăng cường hệ miễn dịch, chữa bệnh dạ dày, kháng viêm, chống đông máu, kiểm soát đường huyết,... 1.2.2. Tình hình nghiên cứu fucoidan ở Việt Nam Ở Việt Nam, fucoidan được các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam nghiên cứu trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây. Nhìn chung, tình hình nghiên cứu về fucoidan từ rong nâu Việt Nam chưa nhiều, các công bố về hoạt tính sinh học cũng mới chỉ được thử nghiệm với hoạt tính gây độc tế bào, một số ít đặc tính cấu trúc fucoidan của một số loài rong được công bố. Đặc biệt, việc nghiên điều về F- KLPTT từ các loài rong mơ thu mẫu tại Nha Trang - Khánh Hòa và hoạt tính của F- KLPTT hầu như chưa được nghiên cứu và công bố. 6 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU * Rong mơ nguyên liệu: sử dụng 5 loài rong mơ S. polycystum, S. oligocystum, S. mcclurei, S. denticarpum, S. swartzii thu mẫu tại vùng biển Nha Trang - Khánh Hòa. * Động vật thử nghiệm: chuột lang (Cavia porcellus), có trọng lượng trung bình 300÷350g/con được sử dụng để đánh giá độc tính và hoạt tính sinh học làm giảm lipid máu của sản phẩm F- KLPTT do đề tài nghiên cứu. 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Các phƣơng pháp phân tích - Định lƣợng fucoidan: phương pháp của Dische và Shettles (1948), fucose được sử dụng làm chất chuẩn. - Phƣơng pháp xác định thành phần đƣờng đơn của fucoidan: phương pháp sắc ký khí thông qua phản ứng axetyl hóa các sản phẩm thủy phân fucoidan theo kỹ thuật của Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự (2007). - Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng sulfat và axít uronic: Hàm lượng sulfate và axit uronic trong phân tử fucoidan được xác định theo phương pháp Scott. - Phƣơng pháp phân tích đặc tính cấu trúc fucoidan: + Phổ hồng ngoại (IR) + Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) + Phổ khối lượng MS 2.2.2. Định lƣợng vi sinh vật - Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí (KL/ g) theo TCVN 4884: 2005 - Xác định Coliforms theo TCVN 6846: 2007 - Xác định E. coli theo TCVN 6848: 2007 - Xác định S. aureus theo TCVN 4830-1: 2005 - Xác định C. perfringens theo TCVN 4991: 2005 - Xác định Salmonella theo TCVN 8342: 2010 - Xác định V. parahaemolyticus theo TCVN 7905-1: 2008 - Xác định tổng số bào tử NM - NM (BT/g) theo TCVN 5166: 1990 2.2.3. Định lƣợng một số thành phần khác - Xác định độ ẩm theo TCVN 3700: 1990. - Xác định thủy ngân (Hg) theo TCVN 7604: 2007. - Xác định Cadmi (Cd) theo TCVN 7603: 2007. - Xác định chì (Pb) theo TCVN 7602: 2007. - Xác định Arsen (As) theo TCVN 7601: 2007. - Xác định thiết (Sn) theo TCVN 7788: 2007. - Xác định Methyl thủy ngân theo AOAC 988.11. 2.2.4. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát được thể hiện tại hình 2.1. 7 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Trên cơ sở sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định các thông số phù hợp cho từng công đoạn. Dd CaCl2 bão hòa Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện tách chiết fucoidan Ethanol 96% Kết tủa fucoidan thô Ly tâm Fucoidan tự nhiên Rong nguyên liệu Đánh giá: Hàm lượng fucoidan Xử lý Lọc lần 1 Bã rong Sấy khô Cắt nhỏ Lựa chọn loại rong Chiết Kết tủa aginate canxi (pH=6,5) Lọc lần 2 Tạp chất Lọc lần 3 Sấy Đánh giá: Thành phần hóa học Cắt mạch Fucoidan KLPT thấp Đánh giá chất lượng: - Thành phần hóa học - Độc tính của sản phẩm - Hoạt tính làm giảm lipid máu - Đặc tính cấu trúc Phân đoạn Nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện cắt mạch fucoidan tự nhiên tạo thành fucoidan KLPT thấp 8 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐÁNH GIÁ HÀM LƢỢNG FUCOIDAN CÓ TRONG 05 LOÀI RONG MƠ SARGASSUM THU MẪU TẠI KHÁNH HÕA Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy hàm lượng fucoidan thu nhận từ loài S. polycystum tương ứng 3,54±0,02%, cao nhất trong 05 loài rong mơ Sargassum được khảo sát, thấp nhất là loài rong S. mcclurei (1,34±0,01%). Do vậy, loài rong S. polycystum được luận án lựa chọn làm nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu thu nhận F-KLPTT ứng dụng trong hỗ trợ điều trị làm giảm lipid máu. 3.2. NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT FUCOIDAN TỰ NHIÊN TỪ RONG MƠ S. POLYCYSTUM 3.2.1. Xác định phƣơng thức chiết fucoidan Nghiên cứu của Luận án cho thấy sử dụng phương thức xay - chiết với tốc độ quay của dao 750 vòng/phút trong suốt quá trình chiết cho phép thu fucoidan từ rong S. polycystum với hiệu suất chiết là 25,84±0,03% cao hơn gấp 1,53 lần so với sử dụng phương thức ngâm chiết chỉ cho phép thu fucoidan từ rong S. polycystum với hiệu suất là 16,85±0,07%. Do vậy, phương thức xay – chieetss được Luận án lựa chọn để nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum. 3.2.2. Xác định tỉ lệ dung môi: nguyên liệu rong (DM/NL) Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy hiệu suất chiết fucoidan từ rong S. polycystum tăng khi tỉ lệ DM/NL tăng trong khoảng từ 8/1 (v/w) đến 16/1 (v/w) và đạt giá trị cao nhất tại tỉ lệ DM/NL là 16/1(v/w), tương ứng với hiệu suất chiết là 29,10±0,29%. Với các tỷ lệ DM/NL lớn hơn giá trị 16/1, hiệu suất chiết fucoidan tăng ít và không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Do vậy, Luận án lựa chọn tỉ lệ dung môi so với nguyên liệu rong là 16/1 (v/w) làm thông số cố định cho các quá trình nghiên cứu chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum. 3.2.3. Xác định pH dung môi chiết Nghiên cứu của Luận án cho thấy trong khoảng khảo sát pH có giá trị từ 2 ÷ 9, hiệu suất chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum đạt giá trị cao nhất 42,94±1,86% tại pH 3 và giá trị thấp nhất tại pH 9. Do vậy, pH 3 được luận án lựa chọn làm thông số cố định cho các nghiên cứu tiếp theo và chọn khoảng pH 2 ÷ 5 làm thông số biên cho nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum. 3.2.4. Xác định nhiệt độ chiết Nghiên cứu của Luận án cho thấy trong khoảng nhiệt độ 600C ÷ 900C, nhiệt độ thích hợp cho quá trình chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum là 800C. Vì vậy, luận án lựa chọn nhiệt độ 800C là thông số cố định cho quá trình nghiên cứu chiết chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum tiếp theo và chọn khoảng nhiệt độ 600C ÷ 900C làm thông số biên cho nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum. 3.2.5. Xác định thời gian chiết Kết quả nghiên cứu của Luận án cho thấy trong khoảng thời gian chiết từ 40 ÷ 60 phút, hiệu suất chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum đạt giá trị cao nhất 82,67% khi thời gian gian chiết là 50 phút. Vì vậy, luận án lựa chọn khoảng thời gian chiết từ 40 ÷ 60 làm thông số biên cho nghiên cứu tối ưu hóa quá trình chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum. 9 3.3. TỐI ƢU HÓA QUÁ TRÌNH CHIẾT FUCOIDAN TỪ RONG MƠ S. POLYCYSTUM THEO PHƢƠNG PHÁP BOX-WILSON Từ kết quả nghiên cứu xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum, Luận án lựa chọn thông số biên cho quá trình nghiên cứu tối ưu công đoạn chiết: Nhiệt độ (Z1): 60 ÷ 90 ( 0 C); thời gian xay chiết (Z2): 40 ÷ 60 (phút); pH: (Z3): 2 ÷ 5 để tìm điều kiện chiết tối ưu phù hợp với hàm mục tiêu - hiệu suất chiết fucoidan. Kết quả quy hoạch thực nghiệm được thể hiện tại bảng 3.1. Bảng 3.1. Hiệu suất chiết fucoidan ở các điều kiện khác nhau Số TN Z1 Z2 Z3 X1 X2 X3 Y (%) 1 60 40 2,0 -1 -1 -1 70,91 2 90 40 2,0 1 -1 -1 72,39 3 60 60 2,0 -1 1 -1 70,25 4 90 60 2,0 1 1 -1 71,81 5 60 40 5,0 -1 -1 1 70,58 6 90 40 5,0 1 -1 1 71,06 7 60 60 5,0 -1 1 1 69,91 8 90 60 5,0 1 1 1 69,44 9 60 50 3,5 -1 0 0 81,21 10 90 50 3,5 1 0 0 82,11 11 75 40 3,5 0 -1 0 83,63 12 75 60 3,5 0 1 0 81.91 13 75 50 2,0 0 0 -1 76,21 14 75 50 5,0 0 0 1 74,84 15 75 50 3,5 0 0 0 83,63 16 75 50 3,5 0 0 0 83,69 17 75 50 3,5 0 0 0 83,51 Hình 3.1. Mô hình 3D bề mặt đáp ứng tối ƣu hóa của các yếu tố tới hiệu suất chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum Giải bài toán quy hoạch thực nghiệm với sự hỗ trợ của phần mềm Modde 5.0, kết quả thu được phương trình hồi quy của hiệu suất chiết fucoidan như sau: Hieu suat Investigation: Chiet (PLS, comp.=2) Response Surface Plot Thoi gian = 50 Hieu suat Investigation: Chiet (PLS, comp.=2) Response Surface Plot pH = 3.5 Hieu suat Investigation: Chiet (PLS, comp.=2) Response Surface Plot Nhiet do = 75 10 Y = 84,04 + 0,44X1 - 0,59X2 - 0,64X3 -1,78X1 2 - 1,15X2 2 - 5,29X3 2 Kết quả tối ưu hóa công đoạn chiết fucoidan từ rong mơ S. polycystum: Nhiệt độ chiết 77 0 C, thời gian chiết 48 phút, pH của dung môi chiết: 3,4. 3.4. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN TỰ NHIÊN Kết quả phân tích cho thấy thành phần mol của L-Fucose chiếm tỉ lệ cao nhất 40,48%, kế đến là D Galactose chiết tỷ lệ 26,75% và D Glucose chiếm tỉ lệ thấp nhất là 6,07%. Hàm lượng sulfate được quy về SO3Na chiếm tỉ lệ 25,6% (w/w), axit uronic chiếm tỉ lệ 23,74% (w/w) so với tổng lượng mẫu phân tích. 3.5. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT FUCOIDAN TỰ NHIÊN Hình 3.2. Sơ đồ q