Tóm tắt Luận án Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested - Pcr chẩn đoán nhiễm nấm cryptococcus neoformans trong dịch não tủy

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƯƠNG TRẦN THỊ QUỲNH LIÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHẾ TẠO BỘ SINH PHẨM NESTED-PCR CHẨN ĐOÁN NHIỄM NẤM Cryptococcus neoformans TRONG DỊCH NÃO TỦY TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI - 2019 Công trình được hoàn thành tại: Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Cao Trường Sinh PGS.TS. Nguyễn Thị Hương Bình Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại Viện Sốt rét - Ký sinh trùng - Côn trùng Trung ương. Vào hồi giờ ngày tháng năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia - Thư viện Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng-Trung ương DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ĐÃ CÔNG BỐ 1. Tran Thi Quynh Lien, Cao Truong Sinh, Nguyen Thi Huong Binh, Do Ngoc Anh (2018), “Establish and optimization nested PCR reaction determine Cryptococcus neoformans in cerebrospinal fluid'', Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 6/2018. 2. Tran Thi Quynh Lien, Cao Truong sinh, Nguyen Thi Huong Binh, Nguyen Khac Luc (2018), “Evaluation sensitivity, specificity and stable of nested-PCR kit detect cryptococcus neoformans in cerebrospinal fluid” Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 6/2018. 3. Trần Thị Quỳnh Liên, Cao Trường Sinh, Nguyễn Thị Hương Bình, Trần Thanh Dương (2019), "Đánh giá khả năng chẩn đoán Cryptococcus neoformans trong dịch não tủy của bộ sinh phẩm nested-PCR với kỹ thuật nuôi cấy, soi tươi và bộ sinh phẩm pcr chẩn đoán của norgen'' Tạp chí Phòng chống bệnh sốt rét và các bệnh ký sinh trùng, số 61/20194. - 1 - ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm não, màng não là tình trạng nhiễm trùng thần kinh trung ương gây ra bởi các căn nguyên khác nhau như vi khuẩn, virus, vi nấm hoặc ký sinh trùng. Trong một số trường hợp biểu hiện lâm sàng của viêm não, màng não do các căn nguyên khác nhau khá giống nhau nên dựa vào lâm sàng khó phân biệt. Do vậy, để xác định căn nguyên gây viêm não, màng não cần phải dựa vào các xét nghiệm cận lâm sàng. Trong số các loài vi nấm gây viêm não màng não, nấm Cryptococcus neoformans được xác định là loài gây viêm màng não phổ biến nhất, đặc biệt là ở bệnh nhân HIV/AIDS, ung thư, bệnh nhân suy kiệt.... Trên lâm sàng, biểu hiện viêm màng não do nấm C. neoformans rất giống với các căn nguyên vi sinh vật khác. Ngoài ra, cũng giống như các vi nấm gây bệnh khác, viêm màng não do C. neoformans thường được nghĩ tới sau các căn nguyên khác nên thường chẩn đoán muộn, khi các triệu chứng đã trở nên trầm trọng. Trong khi, viêm màng não do nấm C. neoformans là một bệnh nguy hiểm, tiến triển nhanh, nếu không được chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời có thể để lại di chứng trầm trọng có khi tử vong nhanh. Trong các kỹ thuật chẩn đoán dựa trên phản ứng PCR, nested – PCR là một trong những kỹ thuật có độ nhạy, độ đặc hiệu cao nhất, không sử dụng trang thiết bị đắt tiền như real-time PCR do đó chúng tôi lựa chọn tiến hành đề tài "Nghiên cứu xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans trong dịch não tủy". Với 02 mục tiêu: 1. Xây dựng được quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy. 2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu và độ ổn định của bộ sinh phẩm được tạo ra trong chẩn đoán nhiễm nấm C.neoformans trong dịch não tủy. - 2 - NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI VỀ MẶT KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN 1. Ý nghĩa khoa học của luận án Đề tài đã áp dụng các phương pháp nghiên cứu có tính khoa học chuẩn mực hiện đang áp dụng rộng rãi tại Việt Nam và Thế giới như: Hoàn thiện được quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR định loài nấm C. neoformans trong dịch não tủy của người Việt Nam;Trên cơ sở áp dụng tổng hợp các phương pháp nghiên cứu truyền thống và hiện đại, phù hợp, bố trí thí nghiệm, tính toán thống kê một cách khoa học nên các kết quả của để tài có giá trị và độ tin cậy cao. Đây là nghiên cứu đầu tiên nghiên cứu xây dựng bộ sinh phẩm chẩn đoán nấm C. neoformans trên dịch não tủy bằng phương pháp nested-PCR ở Việt Nam. Nghiên cứu đã xây dựng được quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR dựa trên sự kết hợp mới giữa 2 bộ mồi ITS1, ITS4 và CN4, CN5. 2. Ý nghĩa thực tiễn của luận án Kết quả của đề tài đã bước đầu khẳng định việc các cơ sở nghiên cứu khoa học của Việt Nam có thể sản xuất được các bộ sinh phẩm chẩn đoán có độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện tương đương với các nghiên cứu tương tự trên thế giới. Bộ sinh phẩm đã được đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu tính ổn định tại phòng thí nghiệm và tại thực địa hẹp (02 bệnh viện) đảm bảo tính chính xác và khả năng áp dụng trên diện rộng hơn của bộ sinh phẩm. Là cơ sở để tiếp tục triển khai, sản xuất, ứng dụng bộ sinh phẩm trong chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans tại các đơn vị xét nghiệm chẩn đoán lâm sàng, cung cấp kết quả xét nghiệm nhanh, chính xác từ đó đề xuất phương án điều trị sớm, hiệu quả phù hợp. Qua đề tài này, các cán bộ nghiên cứu có thể tiếp tục mở rộng xây dựng các bộ sinh phẩm chẩn đoán với các đối tượng nghiên cứu khác dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử. - 3 - CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN Luận án có 134 trang (không kể phụ lục) bao gồm các phần: Đặt vấn đề (2 trang); chương 1: Tổng quan tài liệu (34 trang); chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (31 trang); chương 3: Kết quả nghiên cứu (41 trang); chương 4: Bàn luận (24 trang); Kết luận (2 trang); các công trình đã công bố của tác giả có liên quan đến nội dung luận án (1 trang); những đóng góp mới của luận án (1 trang); tài liệu tham khảo 113 (13 trang, gồm 10 tài liệu tiếng việt, 103 tài liệu tiếng Anh) và phụ lục (35 trang). Luận án được trình bày với 39 bảng, 17 hình. - 4 - Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm sinh học và vai trò y học của nấm C. neoformans Giống nấm Cryptococcus có khoảng hơn 70 loài được định loại dựa vào hình thái nhưng loài gây bệnh chủ yếu là C. neoformans chiếm 80% [18],[19]. Bệnh do nấm C. neoformans gây ra gọi là Cryptococcosis. Triệu chứng bệnh được Zenker miêu tả đầu tiên năm 1861, nhưng đến năm 1864, hai nhà bác học Busse và Buschkle người Đức đã phân lập và nuôi cấy được nấm C. neoformans từ bệnh nhân có triệu chứng giống như đã được Zenker miêu tả [18],[20],[21]. Ngoài C.neoformans, loài C. albidus và C. laurentii cũng có khả năng gây bệnh nhưng ít gặp [19]. 1.1.1. Đặc điểm sinh học của nấm C. neoformans. 1.1.1.1. Đặc điểm hình thể. C. neoformans là nấm men, đường kính tế bào khoảng 5-10 µm, được bao ngoài bởi một nang (capsule) hình cầu hoặc hình bầu dục, kích thước nang thay đổi từ 2-40µm. 1.1.1.2. Môi trường sống C. neoformans là sinh vật sống hoại sinh, ngoài cơ thể vật chủ, có thể sống tự do bên ngoài môi trường. Nấm phân bố toàn cầu có thể tìm thấy trong chất thải của gia cầm, chim bồ câu, vẹt, yến. Trong các hang động, nước trái cây lên men, sữa, đường ruột của một số động vật ăn cỏ, trên cơ thể dơi, gián, trong đất và các hốc cây khác nhau. Nấm còn được tìm thấy trong thân gỗ mục của một số loài cây như: cây bạch đàn, cây cao su màu đỏ [18], [24], [26]. 1.1.1.3. Tính chất nuôi cấy Nấm C. neoformans có thể mọc trên thạch Sabouraud dextrose, thạch máu cừu, thạch chocolate và các môi trường khác ở nhiệt độ từ 20-370C, nấm bắt đầu mọc trong vòng khoảng 72 giờ, nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là 300C [27]. C. neoformans triển tốt trong môi trường chứa khoảng 5 % CO2, pH hơi kiềm và một lượng nhỏ chất sắt [28]. - 5 - Trên môi trường thạch Sabouraud dextrose ở 25-370C, nấm C. neoformans mọc thành các khuẩn lạc lồi, mịn, nhày, màu trắng hoặc màu kem, đường kính có thể đến vài milimet [28]. 1.1.2. Vai trò y học Do tế bào nấm C. neoformans có thể có mặt trong không khí, trong đất và trong phân gia cầm nên người rất dê ̃bi ̣nhiêm̃ loaị nấm này khi hít vào qua đường hô hấp. Tuy nhiên, không phải cơ thể nào bi ̣ nhiêm̃ cũng biểu hiêṇ thành bêṇh mà bêṇh thường biểu hiêṇ ở những cơ thể có hê ̣thống miêñ dic̣h bi ̣ tổn thương như bệnh nhân AIDS, phải dùng các thuốc ức chế miễn dịch, ung thư, ghép tạng, ghép tủy xương... Mức độ nặng của các triệu chứng lâm sàng phụ thuộc vào tình trạng suy giảm miễn dịch của cơ thể người nhiêm̃ [3], [18], [22], [30]. Nấm thường gây bệnh ở não màng não do nấm có đặc tính ưa tổ chức thần kinh. Ngoài ra nấm có thể gây bệnh ở các cơ quan bộ phận khác như phổi, da, hệ tiết niệu 1.1.3. Tình hình viêm màng não do nấm C. neoformans ở trên thế giới và Việt Nam 1.1.3.1. Viêm màng não do nấm C. neoformans ở trên thế giới Từ cuối những năm 1970 đến đầu những năm 1980, sự gia tăng mạnh các trường hợp nhiễm nấm C. neoformans tại Kinshasa và ở những người Zairian nhập cư tại Châu Âu. Hiện nay, viêm màng não do nấm C. neoformans trên bệnh nhân HIV/AIDS vẫn còn là vấn đề ở các nước phương Tây. Tại Nam và Trung châu Phi nhất là vùng sa mạc cận Sahara [11], [20], [36], ngoài việc là nguyên nhân hàng đầu gây viêm màng não, nó còn 13-44% tổng số ca tử vong liên quan đến AIDS. Theo kết quả một loạt các nghiên cứu của Park và cs (2009) thấy tỉ lệ mắc thay đổi từ 0,04-12% mỗi năm trên các bệnh nhân HIV/AIDS. Một số vùng như Đông Âu, Trung Á, Bắc Phi và Trung Đông có tỉ lệ tương tự nhau (1,7% mỗi năm). Vùng biển Caribbean và Mỹ Latin có tỉ - 6 - lệ khoảng 3,4% mỗi năm. Trên toàn cầu hàng năm có khoảng 957.900 trường hợp nhiễm bệnh [20]. Ước tính rằng có khoảng 624.725 ca (từ 124.956-1.124.494) tử vong bởi viêm màng não do nấm C. neoformans [20]. Châu Đại Dương ít nhất (9 ca tử vong) trong khi khu vực châu Phi cận Sahara nhiều nhất (504.000 ca (từ 100.800 - 907.200)) [20]. Rajasingham và cs, (2017) mặc dù đã được điều trị bằng thuốc chống nấm, nhưng năm 2007 ước tính có đến 223.100 trường hợp viêm màng não do cryptococcus và 181.100 ca tử vong do bệnh này trên toàn thế giới [38], [39]. 1.1.3.2. Viêm màng não do nấm C. neoformans ở Việt Nam Ở Việt Nam, chưa có con số thống kê rõ ràng về tình hình viêm màng não do nấm C. neformans của bệnh nhân AIDS trên cả nước. Năm 1928, tại BV Bệnh Nhiệt Đới có 1 ca nhiễm C. neoformans đầu tiên được báo cáo với biểu hiện viêm màng não; Trong một nghiên cứu của Trần Phủ Mạnh Siêu và cs, (2006) về tình hình nhiễm vi nấm nội tạng trên bệnh nhân HIV/AIDS tại Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Thành phố - Hồ Chí Minh từ năm 2003-2005 đã cho thấy C. neoformans là căn nguyên phổ biến (chiếm trên 90% nhiễm trùng thần kinh ở bệnh nhân HIV/AIDS) [41]. Thực tế tình hình nhiễm nấm nội tạng ở bệnh nhân HIV/AIDS tại Bệnh viện Nhiệt đới Tp. HCM từ 11/2008 đến 6/2009 có 98 trường hợp viêm não, màng não do C. neoformans [41]. 1.2. Các phương pháp chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans 1.2.1. Soi phát hiện nang nấm dưới kính hiển vi Phát hiện nang polysaccharide của nấm Cryptococcus trong mẫu xét nghiệm khi quan sát dưới kính hiển vi thấy C. neoformans là những tế bào nấm men, hình cầu hoặc hình bầu dục, bao quanh là một lớp vỏ dày. 1.2.2. Nuôi cấy phát hiện nấm trên môi trường chọn lọc - 7 - Nuôi cấy được coi là một phương pháp quan trọng để chẩn đoán viêm màng não do Cryptococcus, nhưng có một số nhược điểm như: Đòi hỏi cơ sở hạ tầng phòng thí nghiệm, điện, và kỹ thuật viên được đào tạo bài bản [13]. Nuôi cấy cần ít nhất 2 ngày để nấm phát triển và đến 10 ngày để có được số liệu đáng tin cậy. Các phương pháp nuôi cấy cũng có thể tạo ra kết quả âm tính giả khi mật độ nấm thấp. Sử dụng 100 μL dịch não tủy không pha loãng so với 10 μl pha loãng ở tỷ lệ 1:10 đã làm tăng độ nhạy từ 82,4% đến 94,2%, với mức tối thiểu đơn vị khuẩn lạc CFU cần thiết cho sự tăng trưởng giảm từ 100 xuống còn 10 CFU/ml [43]. 1.2.2. Chẩn đoán miễn dịch học phát hiện kháng nguyên Độ nhạy của phương pháp này là cao nhất khi xét nghiệm trên mẫu dịch não tủy, đặc biệt là mẫu dịch não tủy của các bệnh nhân nhiễm HIV. Hầu hết các bệnh nhân HIV có nhiễm C. neoformans đều có phản ứng dương tính khi xét nghiệm miễn dịch bằng dịch não tủy [43]. Tuy nhiên tỷ lệ này chỉ đạt 60% ở các bệnh nhân nhiễm nẫm không có HIV. Những phương pháp xét nghiệm miễn dịch học thông thường có: Thử nghiệm đông kết latex (Latex agglutination assay - LAT); thử nghiệm miễn dịch enzym (enzym immunoassay – IEA), thử nghiệm miễn dịch dòng chảy (Lateral Flow Assay - LFA). 1.2.3. Chẩn đoán bằng kỹ thuật sinh học phân tử Sinh học phân tử là một trong những công cụ chẩn đoán bệnh với độ nhạy, độ đặc hiệu cao và thời gian chẩn đoán nhanh. Các kỹ thuật này có tính đặc hiệu cao do việc thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho từng đối tượng nghiên cứu và có độ nhạy cao vì chỉ cần một lượng rất nhỏ (vài picrogam) ADN cũng có thể cho kết quả chẩn đoán. Có nhiểu phương pháp sinh học phân tử có thể áp dụng để chẩn đoán nấm C. neoformans. Mitchell và cs (1994) là những người đầu tiên sử dụng kỹ thuật PCR để định loại nấm C. neoformans [46]. Prariayachatigul và cs (1996) dùng PCR để định loại nấm này dựa trên trình tự gen đích 18S [47]. - 8 - SH Mirhendi và cs (2001) áp dụng kỹ thuật RFLP-PCR xác định, phân biệt một số nấm men Candida spp., nấm Aspergillus và nấm C.neoformans gây bệnh ở người. Leal AL và cs, (2008) đã ứng dụng kỹ thuật multiplex-PCR để xác định và phân biệt 2 loài C. neoformans và C. gattii. Veron và cs, (2009); Satoh và cs, (2011) đã phát triển kỹ thuật PCR thời gian thực TaqMan để chẩn đoán cryptococcosis có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Trong số các kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR thì nested-PCR được sử dụng nhiều nhất để phân biệt C.neoformans và C. gattii. Theo Shahindokht (2006) và Paola (1998) ngưỡng phát hiện nấm C.neoformans trong dịch não tủy là trên 102 tế bào nấm/ml [52], [54]. 1.3. Nghiên cứu xây dựng và chuẩn hóa các bộ sinh phẩm PCR chẩn đoán tác nhân gây bệnh Nguyên lý chung khi phát triển các bộ sinh phẩm PCR để chẩn đoán tác nhân gây bệnh mong muốn cụ thể như sau [72]: - Thiết kế mồi để xác định tác nhân gây bệnh mong muốn; - Xây dựng quy trình tiến hành phản ứng PCR (nhiệt độ bám mồi, thời gian của mỗi giai đoạn trong chu kỳ tiến hành phản ứng, nồng độ của các loại hóa chất trong cùng một hỗn hợp phản ứng: dNTPs, Taq polymerase, MgCl2, đệm phản ứng); - Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện của phản ứng PCR; - Tạo chuẩn dương cho bộ kit; - So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu, ngưỡng phát hiện của kỹ thuật và bộ sinh phẩm với các phương pháp đã đang được sử dụng với bộ kit chuẩn đã được thương mại hóa trên thị trường; - Đóng gói bộ sinh phẩm với thành phần và số lượng phù hợp. Thông thường đóng gói bộ sinh phẩm cho 25, 50 hoặc 100 phản ứng. 1.4. Nghiên cứu đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm PCR chẩn đoán tác nhân gây bệnh Để đánh giá một phương pháp xét nghiệm cũng như một bộ sinh phẩm trước khi áp dụng vào chẩn đoán lâm sàng thì các chỉ số về độ nhạy, độ - 9 - đặc hiệu, ngưỡng phát hiện và tính ổn định của xét nghiệm và bộ sinh phẩm được coi là các chỉ số tiên phong, bắt buộc phải có. - Độ nhạy (Se - sensitivity) [79], [80]: Là tỷ lệ người mang bệnh có kết quả xét nghiệm dương tính. - Độ đặc hiệu (Sp - specificity) [77], [81]: Là tỷ lệ người không mang bệnh có kết quả xét nghiệm âm tính. Để xác định Se, Sp người ta so sánh kết quả chẩn đoán của phương pháp cần xác định với phương pháp chuẩn (được gọi là chuẩn vàng, gold standard) [77]. Hetal và cs, (2011) đã xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp nhuộm mực tàu là 83,3% và 96,49%. Trong khi đó các giá trị này ở phương pháp Latex là 100% và 94,7% so với phương pháp chuẩn vàng là phương pháp nuôi cấy [84]... Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu - 01 chủng nấm C. neoformans chuẩn mã số ATCC® 90113 - 51 chủng nấm C. neoformans được phân lập từ dịch não tủy ở Bệnh viện Quân y 103, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương, Bệnh viện Chợ rẫy và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch - 30 mẫu DNT của bệnh nhân có biểu hiện VMN nhưng không nhiễm nấm C. neoformans - 120 mẫu dịch não tủy của bệnh nhân có triệu chứng lâm VMN thu thập ở Bệnh viện Quân y 103 và Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch. 2.2. Địa điểm nghiên cứu Bệnh viện Quân y 103, Bệnh viện Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện Chợ Rẫy, Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương 2.3. Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3/2014 đến tháng 10/2017 2.4. Nội dung nghiên cứu - 10 - 2.4.1. Xây dựng quy trình chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nấm C. neoformans - Xây dựng quy trình kỹ thuật nested-PCR xác định nấm C. neoformans - Xây dựng bộ sinh phẩm nested-PCR xác định C. neoformans 2.4.2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ sinh phẩm - Chuẩn bị mẫu để đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu - Thực hiện kỹ thuật nested – PCR để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, độ tương đồng với các xét nghiệm khác, độ ổn định của bộ sinh phẩm. 2.5. Phương pháp nghiên cứu: NC thực nghiệm phòng thí nghiệm. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu:Thu thập dịch não tủy, nuôi cấy, soi tươi nhuộm mực tàu, tách chiết AND, tạo panel, kỹ thuật PCR, kỹ thuật điện di 2.6. Phân tích và xử lý số liệu: phần mềm Blast và ClustalX, BioEdit, Mega 7.0.9, SPSS 20.0 2.7. Đạo đức trong nghiên cứu: Tuân thủ các quy định nghiên cứu y, sinh học. Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả xây dựng quy trình kỹ thuật chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans 3.1.2.1. Kết quả lựa chọn trình tự cặp mồi cho phản ứng nested PCR Cặp mồi cho phản ứng PCR1 theo Mitchell TG và CS, 1994; SH Mirhendi và CS, 2001: - ITS1 F: 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’ - ITS4 R:5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ Khuếch đại đoạn gen có kích thước 555-556 bp đặc trưng cho nấm C. neoformans Cặp mồi cho phản ứng PCR 2 theo Guizhen Luo và CS, 2002: - CN4 F: 3’-ATC ACC TTC CCA CTA ACA CAT T-5’ - CN5 R: 3’-GAA GGG CAT GCC TGT TTG AGA G-5’ - 11 - Khuếch đại đoạn ADN có kích thước 135-136 bp nằm trong đoạn giao gen ITS1-ITS2. 3.1.3. Kết quả xác định các điều kiện cho kỹ thuật nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans Bảng 3.10. Kết quả chuẩn hóa từng thành phần phản ứng cho PCR1 TT Thành phần Nồng độ, hàm lượng cuối cùng Thể tích sử dụng cho 1 phản ứng (µl) 1 Nước khử ion Vừa đủ tới 25 µl 8,5 2 Master Mix 2 X có chứa MgCl2 nồng độ 4 mM 1X 12,5 3 Mồi xuôi PCR1 0,02 µM 1 4 Mồi ngược PCR1 0,02 µM 1 5 ADN khuôn 100pg – 100ng/25µl 2 Tổng 25 Bảng 3.11. Kết quả chu trình nhiệt của phản ứng PCR1 Bước phản ứng Nhiệt độ 0C Thời gian Số chu kỳ Tách sợi ban đầu 94 5 phút 01 Tách sợi 94 40 giây Bám mồi 56 40 giây 25 Kéo dài mồi 72 40 giây ổn định mồi 72 7 phút 01 3.1.3.4. Kết quả xác định các điều kiện cho phản ứng PCR2 - Kết quả chuẩn hóa nồng độ Mg2+ Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm nồng độ Mg2+ trong phản ứng PCR2 TT Nồng độ ADN khuôn Số lượng mẫu lên băng 135bp với nồng độ Mg2+ khác nhau (mM) 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 1 1 pg 0/8 6/8 7/8 7/8 7/8 7/8 - 12 - 2 10 pg 1/8 6/8 8/8 7/8 7/8 6/8 3 100 pg 1/8 7/8 8/8 7/8 6/8 8/8 4 1000 pg 1/8 7/8 8/8 7/8 6/8 6/8 Kết quả bảng 3.13 cho thấy ở Mg2+ nồng độ 2,0 mM và nồng độ ADN ≥ 10 pg thì tất cả mẫu xét nghiệm đều có sản phẩm PCR. 3.1.3.5. Xác định ngưỡng phát hiện và tính đặc hiệu của kỹ thuật nested-PCR Hình 3.14. Kết quả PCR theo nồng độ ADN khuôn Ngưỡng phát hiện của kỹ thuật nested -PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans trong dịch não tủy ở nghiên cứu này là 10pg. 3.1.4. Kết quả chế tạo bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans Bảng 3.25. Thành phần bộ sinh phẩm nested-PCR chẩn đoán nhiễm nấm C. neoformans TT Tên dung dịch Bản chất Số lượng Thể tích/ống (µl)