Tóm tắt luận án Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen p5cs liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN NGUYỄN THỊ THÚY HƯỜNG PHÂN LẬP, TẠO ĐỘT BIẾN ĐIỂM Ở GEN P5CS LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN VÀ THỬ NGHIỆM CHUYỂN VÀO CÂY ĐẬU TƯƠNG VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 62.42.70.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2011 CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Nguyễn Thị Thuý Hường, Chu Hoàng Mậu, Hà Tấn Thụ, Đinh Thị Kim Phương, Trần Thị Trường (2006), “Sưu tập, phân loại và đánh giá chất lượng hạt của một số giống đậu tương địa phương tại tỉnh Sơn La”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển Nông thôn, số 11 kỳ I tháng 6/2006. 28-32 2. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thuý Hường (2006), “Thành phần axit amin và khả năng chịu hạn của một số giống đậu tương địa phương của tỉnh Sơn La”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển Nông thôn, số 20 kì II tháng 10/2006. 22- 26. 3. Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2008), "Đánh giá khả năng chịu hạn và phân lập gen P5CS của một số giống đậu tương (Glycine max L.Merrili)", Tạp chí công nghệ sinh học, 6(4): 459-466. 4. Nguyễn Thị Thúy Hường, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà (2009), "Phát triển hệ thống tái sinh invitro ở cây đậu tương (Glycine max L.Merrili) phục vụ chuyển gen", Tạp chí khoa học và công nghệ. Đại học Thái Nguyên 52 (4): 82-88. 5. Nguyễn Thị Thúy Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2009), "Tạo gen mã hóa Enzym P5CS (Pyroline - 5 - carboxylate synthase) mang đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi bằng kỹ thuật PCR". Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc năm 2009: 191 - 193. 6. Nguyễn Thị Thuý Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Chu Hoàng Hà (2010), "Tách dòng và đánh giá hoạt động của promoter cảm ứng khô hạn rd29A từ Arabidopsis thaliana", Tạp chí Công nghệ sinh học 8(4): 1805-1810 7. Nguyễn Thị Thuý Hường, Chu Hoàng Mậu, Lê Văn Sơn, Nguyễn Hữu Cường, Chu Hoàng Hà (2010), "Tạo cây thuốc lá chuyển gen P5CS đột biến loại bỏ hiệu ứng phản hồi ngược, làm tăng hàm lượng protein và khả năng chống chịu khô hạn. Hội nghị toàn quốc về khoa học sự sống Bio-Hà Nội 2010", Tạp chí công nghệ sinh học, 8 (3A): 539-544. 8. Chu Hoang Mau, Nguyen thi Thuy Huong, Nguyen Tuan Anh, Chu Hoang Lan, Le van Son, Chu Hoang Ha ( 2010) Characteristic of the gene encoding pyrroline - 5 - carboxylate synthase (P5CS) in Vietnamese sobean cultivar (Glycine max L.Merrill) 2010 International Conference on Biology, Environment and Chemistry (ICBEC 2010) IEEE: 319-323 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) là một trong những cây trồng quan trọng không chỉ ở Việt Nam mà còn đối với nhiều quốc gia trên thế giới. Tình trạng hạn hán ảnh hưởng tới tình hình sản xuất đậu tương không chỉ ở Việt Nam mà ngay cả những nước sản xuất đậu tương hàng đầu thế giới. Đậu tương là cây trồng thuộc nhóm cây có khả năng chịu hạn kém. Ở Việt Nam, nhiều giống đậu tương có khả năng chống chịu hạn đã được chọn tạo thành công và đang được triển khai canh tác ở một số địa phương. Tuy nhiên các phương pháp chọn giống truyền thống tốn nhiều thời gian, phức tạp và cần phải có quần thể đủ lớn và không ổn định. Những nhược điểm của phương pháp truyền thống có thể khắc phục bằng việc áp dụng các kỹ thuật mới của công nghệ sinh học. Kỹ thuật chuyển gen ở thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens đã được các nhà khoa học trên thế giới ứng dụng và đạt được những kết quả rất có triển vọng trên cây đậu tương. Ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu của Trần Thị Cúc Hòa tại Viện Nghiên cứu lúa Đồng bằng Sông Cửu Long đã thành công trong việc tạo ra các giống đậu tương mới mang tính kháng sâu bệnh, tuy nhiên cho đến nay công trình nghiên cứu về chuyển gen chịu hạn vào cây đậu tương vẫn chưa được quan tâm đúng mức. Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài luận án tiến sĩ là: “Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn và thử nghiệm chuyển vào cây đậu tương Việt Nam”. 2. Mục tiêu nghiên cứu 2.1. So sánh trình tự gen mã hóa P5CS của các giống địa phương thuộc nhóm chịu hạn tốt và chịu hạn kém. Tạo được đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi bởi prolin. 2.2. Tạo được vector chuyển gen mang cấu trúc liên quan đến tính chịu hạn ở cây đậu tương. 2.3. Tạo cây đậu tương mang cấu trúc gen liên quan đến đặc tính chịu hạn. 2 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phân tích đặc điểm sinh lý, hóa sinh của một số giống đậu tương trồng tại khu vực miền Bắc. 3.2. Phân lập và xác định trình tự gen mã hóa enzyme 1-pyrroline-5 carboxylate synthetase (P5CS). 3.3. Tạo đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi (feedback inhibition) bởi prolin bằng phương pháp tạo đột biến điểm. 3.4. Phân lập promoter cảm ứng dưới điều kiện khô hạn rd29A từ cây Arabidopsis thaliana. Phân tích hoạt động của promoter dựa vào hoạt động của gen GUS ở các dòng cây thuốc lá chuyển gen. 3.5. Thiết kế cấu trúc mang gen P5CS đột biến được điều khiển bởi promoter rd29A và chuyển cấu trúc này vào cây thuốc lá. 3.6. Phân tích các chỉ tiêu hóa sinh và khả năng chống chịu của các dòng thuốc lá trong điều kiện gây hạn nhân tạo. 3.7. Biến nạp cấu trúc mang gen P5CS vào cây đậu tương thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Phân tích sự có mặt của gen biến nạp. 4. Những đóng góp mới của luận án 4.1. Gen P5CS được phân lập và đọc trình tự từ hai giống đậu tương Việt Nam (DT84 và SL5), có kích thước 2148 nucleotit, mã hóa 715 axit amin. 4.2. Đã tạo đột biến điểm định hướng ở bộ ba có vị trí thứ 125 của gen P5CS của giống SL5, thay thế Asp bằng Ala trong trình tự protein, loại bỏ hiệu ứng ức chế phản hồi (feedback inhibition). 4.3. Promoter rd29A đã được phân lập thành công từ cây A.thaliana, có kích thước 1298bp mang các trình tự đặc trưng gồm các nhân tố cis thuộc nhóm MYB, DRE, AMYBOX nhân tố đặc trưng của promoter và nhân tố cảm ứng điều kiện khô hạn. 4.4. Thiết kế thành công cấu trúc của promtor rd29A :: GUS và cấu trúc rd29A::P5CSM. Các cấu trúc này đã được đánh giá trong cây thuốc lá ở điều kiện hạn. 4.5. Tối ưu được quy trình tái sinh và chuyển gen thông qua mô nách lá mầm ở đậu tương. Bước đầu chuyển thành công cấu trúc gen 3 rd29A::P5CSM vào giống đậu tương DT84 và thu được một số dòng dương tính PCR đối với gen chuyển. 5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 5.1. Về khoa học, luận án là công trình ở Việt Nam đã đánh giá được khả năng chống chịu hạn của các giống đậu tương trong điều kiện gây hạn nhân tạo, phân lập và thay đổi cấu trúc gen P5CS dựa vào phương pháp gây đột biến có định hướng bằng phản ứng PCR. Các kết quả phân tích gen P5CS khẳng định rằng sự khác nhau về khả năng chịu hạn của các giống đậu tương khác nhau là do nhiều yếu tố quy định, tuy nhiên hoạt động của gen P5CS giữ vai trò quan trọng đối với tính chịu hạn ở cây trồng. 5.2. Về thực tiễn, những kết quả đánh giá hoạt động của cấu trúc chuyển gen mang promoter rd29A điều khiển hoạt động của gen P5CS đã bị gây đột biến loại bỏ hiệu ứng phản hồi bởi prolin ở cây thuốc lá đã khẳng định ý nghĩa thực tiễn của luận văn. Khả năng chống chịu được cải thiện rõ rệt ở các dòng thuốc lá chuyển gen mang cấu trúc này đảm bảo tính khả thi của việc ứng dụng cấy trúc chuyển gen này trên các đối tượng cây trồng khác nhằm cải thiện một trong những tính trạng rất quan trọng là chống chịu hạn. Kết quả ban đầu trong việc thiết lập quy trình chuyển gen ở cây đậu tương sẽ là tiền đề quan trọng trong tiến trình tạo ra các giống đậu tương mới có tính chịu hạn cao. 6. Cấu trúc của luận án Luận án gồm 113 trang, được chia thành các phần: Phần Mở đầu gồm có 3 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu, 34 trang; Chương 2: Vật liệu và Phương pháp, 15 trang; Chương 3: Kết quả và Thảo luận, 46 trang; Phân Kết luận và Đề nghị: 2 trang; Các công trình đã công bố của tác giả: 1 trang. Tài liệu tham khảo: 11 trang; Luận án có 29 bảng số liệu, 43 hình và 108 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt và tiếng Anh. Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo và tổng kết 64 tài liệu, trong đó có 10 tài liệu tiếng việt, 51 tài liệu tiếng Anh và 3 địa chỉ trang web về 5 vấn đề cơ bản liên quan, như : (1) Giới thiệu về cây đậu tương (Glycine max (L.) Merill), 4 giá trị kinh tế và giá trị sử dụng của cây đậu tương; (2) Cơ sở sinh lý, hóa sinh của đặc tính chống chịu hạn của cây đậu tương; (3) Prolin và vai trò của enzym P5CS trong con đường sinh tổng hợp prolin; (4) Promoter và vai trò điều khiển hoạt động của gen trong điều kiện hạn; (5) Những nghiên cứu nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương. Prolin được biết đến là một trong những chất đóng vai trò quan trọng trong quá trình điểu chỉnh áp suất thẩm thấu khi cơ thể thực vật sống trong các điều kiện bất lợi như hạn, mặn (Delauney and Verma, 1993). Tác dụng bảo vệ các cấu trúc nội bào và các đại phân tử khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi về áp suất thẩm thấu; bảo vệ các cấu trúc protein và nâng cao hoạt tính của nhiều loại enzyme khác nhau; chống oxy hóa với chức năng phân cắt các gốc oxy phản ứng (reactive oxygen residues) và bất hoạt các gốc oxy tự do (singlet oxygen quencher) (Szavados và đtg, 2009). Ở thực vật, quá trình sinh tổng hợp prolin được kiểm soát bởi hoạt tính của hai gen mã hóa cho enzym P5CS. Hai gen này có độ tương đồng rất cao về trình tự mã hóa nhưng biểu hiện lại rất khác nhau trong những điều kiện khác nhau. Cả hai gen P5CS đều hoạt động ở các mô phân sinh của hoa, chủ yếu để cung cấp prolin cho quá trình phát triển của hoa (Mattioli và đtg, 2009). Nghiên cứu trên cây Arabidopsis các nhà khoa học đã chứng minh được mối quan hệ chặt chẽ giữa hoạt động của enzme P5CS và sự tích lũy prolin trong điều kiện cây bị xử lý mặn; và hiệu ứng ức chế ngược của prolin tới hoạt tính của P5CS cũng bị ảnh hưởng trong các điều kiện bất lợi này. Khi chuyển gen P5CS đã bị gây đột biến loại bỏ hiệu ứng ức chế ngược bởi prolin vào cây thuốc lá các nhà khoa học đã nhận ra rằng các dòng thuốc lá chuyển gen này tăng cường tích lũy prolin nhiều hơn gấp 2 lần so với các dòng thuốc lá được chuyển gen P5CS kiểu dại. Gần đây, gen P5CS phân lập thành công từ cây lúa và khi được chuyển trở lại lúa nhằm tăng cường hoạt động của gen này các nhà khoa học đã nhận thấy rằng tính chịu mặn và chịu lạnh được cải thiện rõ rệt. Promoter rd29A là một trình tự bị cảm ứng biểu hiện dưới các điều kiện bất lợi như khô hạn, mặn, và lạnh đã được nhiều nhà khoa học quan tâm. Một số nghiên cứu đã phát hiện được trình tự promoter rd29A chứa 2 vùng có hoạt tính cis là vùng cảm ứng ABA (ABRE) và vùng cảm ứng mất 5 nước (DRE)/C repeat (CRT). Cả 2 vùng đều liên quan đến sự biểu hiện các gen biểu hiện dưới điều kiện bất lợi của môi trường (Yamaguchi-Shinozaki và Shinozaki, 1993). Nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đã phân lập và kiểm tra hoạt động của promoter rd29A trên nhiều loài cây như A. thaliana, thuốc lá và lúa mì (Sun và Chen, 2002). Cấu trúc promoter RD29A điều khiển gen chỉ thị GUS được chuyển vào cây khoai tây, mía. Hoạt tính của GUS đều được phát hiện trong cây chuyển gen dưới điều kiện bất lợi của môi trường nuôi cấy (Zhang et al., 2005) . Có nhiều biện pháp cải thiện khả năng chịu hạn của cây trồng, những hiện nay áp dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tăng cường khả năng chịu hạn của thực vật đang được quan tâm nghiên cứu. Có thể nhận định rằng tính khả thi và tiềm năng ứng dụng phương pháp chuyển gen thực vật như là biện pháp nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương tại Việt Nam là rất cao. Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị Vật liệu thực vật: 16 giống địa phương và DT84; giống thuốc lá 326 (Nicotiana tabacum), và cây Arabidopsis thaliana. Hóa chất nghiên cứu: Vector tách dòng pBT, vector pBI101 dùng mục đích thiết kế vector chuyển gen, vector pTN 289 dùng để chuyển gen. Các cặp mồi dùng để nhân bản gen P5CS và promoter RD29A được thiết kế dựa trên trình tự gen P5CS và promoter RD29A đăng kí trên GeneBank với mã số: AY492005, AB428730. Các loại hóa chất dùng cho các thí nghiệm nuôi cấy mô và sinh học phân tử được mua từ các hãng hóa chất: Merk, Bioneer, Fermentas do Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp sinh lý, hoá sinh - Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn theo phương pháp của Lê Trần Bình và đồng tác giả năm 1998. 6 - Định lượng protein tan được thực hiện theo phương pháp Lowry. Định lượng lipit được mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu. Hàm lượng và thành phần axit amin trong hạt theo Phạm Văn Chi và đtg (1997). - Hàm lượng prolin được xác định bằng phương pháp Bates và đtg (1973). - Phương pháp tính toán và xử lý số liệu theo Nguyễn Hải Tuất và Ngô Kim Khôi (1996). 2.2.2. Các phương pháp sử dụng nuôi cấy in vitro Các phương pháp sử dụng nuôi cấy in vitro ở cây Arabidopsis, cây thuốc lá theo Topping ,1988. Đối với cây đậu tương tái sinh cây qua đa chồi từ nách lá mầm hạt chín và quy trình chuyển gen vào nách lá mầm hạt chín được tiến hành dựa trên phương pháp của Olhoft và đtg (2001) có cải tiến. 2.2.3. Phương pháp sinh học phân tử Thiết kế mồi dựa vào trình tự đã công bố trên GenBank. Quy trình tách chiết DNA tổng số (đối với Arabidopsic và thuốc lá). Phương pháp tách chiết RNA tổng số: Sử dụng bộ kit Trizol Regents (của hãng Invitrogen) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu lá đậu tương theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Phương pháp tách chiết, tinh sạch DNA và RNA. - Phương pháp tổng hợp cDNA. RNA tổng số được sử dụng để nhân gen bằng phương pháp tổng hợp cDNA, cDNA được tổng hợp theo quy trình RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas). - Phản ứng PCR. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: Gen P5CS được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu theo chu trình nhiệt như sau: 94ºC/5 phút;: 94ºC/30 giây, Tm /45 giây, 72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/10 phút, 35 chu kì. Tiến hành phản ứng PCR với các nhiệt độ khác nhau (từ 50 - 620C) để tìm nhiệt độ gắn mồi đặc hiệu. - Phương pháp OE - PCR ( Overlap Extention) Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94ºC/5 phút; 94ºC/30 giây, Tm /45 giây, 72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/10 phút, 4 chu kì. Sau 4 chu kỳ lấy sản phẩm ra 7 đặt ngay vào đá và bổ sung 1µl BamHI và 1µl SaclI thực hiện tiếp phản ứng theo chu trình nhiệt sau: 94ºC/5 phút; 94ºC/30 giây, Tm /45 giây, 72ºC/1 phút 30 giây; 72ºC/10 phút, 30 chu kì. - Phương pháp tách dòng: Tách chiết plasmid tái tổ hợp được thực hiện theo Sambrook và đtg (2001) và tinh sạch bằng Plasmid Miniprep Kit (Qiagen). Phương pháp sử dụng enzym cắt hạn chế thực hiện theo Sambrook và đtg (2001) - Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) - Thiết kế cấu trúc rd29A :: GUS và rd29A :: P5CSM - Các phương pháp phân tích cây biến nạp. Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển bằng phương pháp hóa sinh. Cây thuốc lá chuyển gen sau khi sống trong nhà kính được xử lý hạn nhân tạo bằng PEG (Jun và đtg 20001). Hàm lượng enzym Gus tiếp tục được xác định bằng phương pháp của Tefferson và đtg (1987) Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả sưu tập và đánh giá các giống đậu tương địa phương của tỉnh Sơn La. 3.1.1. Đặc điểm hình thái, hóa sinh của hạt đậu tương. Phát hiện 16 giống đậu tương địa phương ở 7 huyện ở 11 huyện thị khác nhau của tỉnh Sơn La. Hàm lượng protein của các giống dao động trong khoảng 29,72%-52,75% protein/khối lượng khô. Hàm lượng lipit dao động từ 9,9% - 18,65%. Giống DT84 cho hàm lượng lipit cao nhất là 18,65%, đến SL3 (17,34%) 3.1.2. Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương nghiên cứu. Đối với giống SL5 hàm lượng prolin tăng cao nhất sau khi gây hạn được 9 ngày (tăng 377,44%). Giống DT84 có tỷ lệ tăng hàm lượng prolin ở cả ba thời điểm đều thấp nhất (101,06; 129,26 và 146,81%). Kết quả nghiên cứu phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả trên các loài cây trồng khác nhau như lúa (Nguyễn Hữu Cường và đtg), (Do và đtg ), 8 (Choudhary và đtg 2005), cây họ đậu (Curtis và đtg 2004), (Chen và đtg 2009). 3.2. Phân lập gen P5CS và đột biến điểm loại bỏ ức chế ngược 3.2.1. Kết quả phân lập gen P5CS 3.2.2. Kết quả khuếch đại, tách dòng và xác định trình tự gen P5CS RNA tổng số đã được tách chiết và tổng hợp cDNA từ SL5 và DT84. Bốn đoạn gen P5CS được nhân lên bằng PCR và được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả hình 3.3 cho thấy, các đoạn thu được có kích thước tương ứng với kích thước tính toán theo lý thuyết. Để thu được gen P5CS hoàn chỉnh, hai sản phẩm PCR được trộn lẫn và được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi P5CSfor/P5CSrev theo phương pháp OE-PCR. Sản phẩm PCR thu được có kích thước khoảng 2100 bp ( Hình 3.4). Hình 3.3. Kết quả nhân hai đoạn gen P5CS từ 2 giống đậu tương DT84 và SL5 1, 3: giống DT84; 2, 4: giống SL5; M: Thang DNA chuẩn 1 kb. Hình 3.4. Kết quả PCR ghép nối hai đoạn gen P5CS từ 2 giống đậu tương DT84 và SL5 1, 3: giống DT84; 2, 4: giống SL5; M: Thang DNA chuẩn 1 kb Kết quả đọc trình tự gen cho thấy, sản phẩm gen tách dòng từ 2 mẫu nghiên cứu có kích thước 2148 nucleotide, mã hoá 715 axit amin. Ở 2 vị trí 125 và 128 của P5CS ở cả ba giống đều là axit amin Asp và Phe. Đây là hai vị trí gây ra sự ức chế hoạt động của enzym P5CS do tăng hàm lượng của prolin trong tế bào (Zhang và đtg 1995), (Hong và đtg 2000). 1000bp 1500bp 2100bp M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 9 3.2.3. Tạo đột biến điểm loại bỏ hiệu ứng ức chế ngược ở P5CS phân lập từ cây đậu tương Kết quả hình 3.10 cho thấy, các đoạn thu được có kích thước tương ứng với kích thước tính toán theo lý thuyết. Sản phẩm OE-PCR thu được có kích thước khoảng 2100bp (hình 3.11). Kích thước này tương ứng với kích thước của gen P5CS gốc. 2 Hình 3.10. Điện di sản phẩm PCR Với cặp mồi P5CS M125for2/SacI-P5C; Với cặp mồi P5CS for / P5CS rev ; M : Thang DNA chuẩn 1 kb. Hình 3.11. Phản ứng nối hai đoạn gen theo phương pháp OE-PCR với cặp mồi BamHI-P5CS và Sacl - P5CS. A, B : 1+2, M:thang DNA chuẩn 1 kb Nhưng để biết chính xác gen có tạo được đột biến điểm hay không cần phải được đọc trình tự gen. Kết quả được thể hiện ở hình 3.13. 310 320 330 340 350 360 370 380 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| MSL5 AACAGCCTTATGGCTCTTTATGATGTTTTGTTTAGTCAGCTGGATGTGACATCTGCTCAGCTTCTTGTGACGGCCAATGA N S L M A L Y D V L F S Q L D V T S A Q L L V T A N D SL5 .........................................................................A...... N S L M A L Y D V L F S Q L D V T S A Q L L V T D N D Hình 3.13. Phân tích, so sánh trình tự nucleotit và phát hiện đột biến tại vị trí nucleotit 374 của gen P5CS Trình tự gen này mã hoá cho protein P5CS của đậu tương, qua kết quả đọc trình tự chúng tôi nhận thấy nucleotit A ở vị trí 374 của mã bộ ba GAC 2100bp M 2 1 1800bp 400bp M A B 10 được thay thế bằng nucleotit C của mã bộ ba GCC tương ứng trên trình tự protein axit amin ở vị trí 125 Asp được thay bằng Ala 3.3. Phân lập và kiểm tra hoạt động của promotor rd29A cảm ứng khô hạn 3.3.1. Phân lập promoter rd29A Trên cơ sở trình tự gen rd29A đã công bố trên ngân hàng gen thế giới, cặp mồi rd29A -HindIII / rd29A -BamHI đã được thiết kế có trình tự như bảng 3.7. Cặp mồi này sẽ tách được promoter có kích thước 1290 bp, nằm trước codon mở đầu của gen chức năng rd29A. Bằng kỹ thuật PCR, promoter rd29A đã được phân lập từ A. thaliana sử dụng cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm được kiểm tra trên gel agarose cho thấy có một băng duy nhất với kích thước khoảng 1300 bp, tương đương kích thước tính toán theo lý thuyết. Hình 3.15. Điện di sản phẩm PCR và c