Tóm tắt luận án Tính kháng thuốc oseltamivir của virút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001-2012

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong thế kỷ XX, căn nguyên vi rút là nguyên nhân chính gây ra những vụ dịch nguy hiểm đe doạ tới sức khoẻ cũng như tính mạng của con người, điển hình là các vụ dịch xảy ra như dịch cúm gia cầm tại Hồng Kông năm 1998, dịch SARS năm 2003, dịch cúm A/H1N1 năm 2009, A/H7N9 năm 2013. Tại Việt Nam, số người mắc cúm có xu hướng tăng lên sau mỗi năm. Các phương pháp áp dụng trong điều trị và phòng chống nhiễm vi rút cúm là tiêm văc xin và sử dụng thuốc điều trị đặc hiệu. Văc xin cúm đang lưu hành là văc xin cúm theo mùa, chỉ phát huy tác dụng khi được tiêm trước vụ dịch cúm. Sử dụng thuốc kháng vi rút đặc hiệu (amantadine, oseltamivir...) là phương pháp hữu hiệu trong điều trị và dự phòng nhiễm vi rút cúm. Sự tương tác của thuốc với vi rút có thể gây sự kháng thuốc của vi rút. Việc tìm hiểu khả năng kháng thuốc và mức độ tiến hoá của vi rút có ý nghĩa lớn cho việc điều chỉnh phác đồ điều trị, phối hợp thuốc, hạn chế ảnh hưởng và lan truyền của hiện tượng kháng thuốc trong quần thể. Tại Việt Nam quá trình này đã được thực hiện bước đầu từ năm 2005 dựa trên chương trình Giám sát Cúm Quốc gia và đơn vị nghiên cứu lâm sàng trường đại học Oxford thuộc bệnh viện bệnh nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh. Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi rút cúm kháng thuốc mới chỉ báo cáoở mức độ từng ca bệnh hoặc theo dõi một chùm ca bệnh, mà chưa có một nghiên cứu hệ thống theo dõi quá trình kháng thuốc và sự tiến hoá của chủng vi rút cúm A theo thời gian. Để tìm hiểu hiện tượng kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm về sự lưu hành, tần suất, mức độ và khả năng lây truyền của vi rút cúm theo thời gian, cần có một nghiên cứu hệ thống trên cơ sở giám sát và xác định cơ chế kháng với từng loại thuốc của vi rút cúm A. Với những lý do trên, chúng tôi xây dựng đề tài nghiên cứu “Tính kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001 – 2012” với mục tiêu: - Xác định nồng độ ngưỡng của oseltamivir có khả năng ức chế 50% (IC50) vi rút cúm A tại miền Bắc Việt Nam. - Xác định mức độ và tỉ lệ các vi rút cúm A giảm độ nhạy cảm với oseltamivir thông qua giá trị ức chế 50% (IC50). - Đánh giá sự tương đồng về di truyền học giữa các vi rút cúm A giảm nhạy cảm với oseltamivir tại miền Bắc Việt Nam với các vi rút cúm A trong khu vực và trên thế giới trong giai đoạn 2001-2012. Những đóng góp mới của luận án: 1. Đây là công trình nghiên cứu khoa học đầu tiên thực hiện có hệ thống để xác định tính kháng thuốc của vi rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam trong giai đoạn từ 2001 đến 2012. 2. Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu là các kỹ thuật xét nghiệm mới cập nhật trong những năm gần đây. 3. Kết quả nghiên cứu đã xác định được giá trị IC50 ngưỡng,tỉ lệ và mức độ giảm nhạy cảm với oseltamivir củacác phân típ chủng vi-rút cúm A lưu hành tại miền Bắc Việt Nam, 2001-2012. Đây là các công bố đầu tiên về giá trị ngưỡng tương tác của virut cúm A với oseltamivir tại Việt nam cho phép nhận định 2 mức độ kháng thuốc của vi rút cúm A, từ đó có thể phối hợp với bác sĩ lâm sàng đưa ra phác đồ điều trị phù hợp. 4. Kết quả nghiên cứu so sánh về sự tương đồng di truyền học giữa các vi rút cúm A được xác định giảm nhạy cảm với oseltamivir lưu hành tại miền Bắc Việt Nam với các vi rút cúm A lưu hành trong nước, trong khu vực và trên thế giới trong giai đoạn 2001-2012 cho thấy sự các vi rút cúm A giảm nhạy cảm với oseltamivir lưu hành song song cùng với các chủng cúm thông thường khác, kết quả này cũng bổ sung thêm thông tin về sự tiến hóa của vi rút cúm A tại Việt Nam. 5. Nghiên cứu về tính kháng thuốc oseltamivir của vi rút cúm theo chiều dọc thời gian từ 2001-2012 với các số liệu thu thập được là cơ sở dữ liệu đầu tiên về sự tương tác của vi rút cúm với oseltamivir tại Việt Nam. Bố cục luận án: Luận án dày 103 trang gồm: Đặt vấn đề 3 trang Chương I: Tổng quan 34 trang Chương II: Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 16 trang Chương III: Kết quả 32 trang Chương IV: Bàn luận 15 trang Kết luận 2 trang Kiến nghị 1 trang Luận án có 23 hình vẽ, 11 bảng, 6 biểu đồ và 2 sơ đồ. Trong 123 tài liệu tham khảo có 6 tài liệu Tiếng Việt và 117 tài liệu Tiếng Anh. CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 1.1. Vi rút cúm A 1.1.1. Cấu tạo chung và hệ gen của vi rút cúm A Cấu trúc hệ gen và các protein tương ứng của vi rút cúm A Hệ gen của vi rút cúm A: Vi rút cúm A có 8 phân đoạn gen, mã hóa cho 11 protein. Các gen của vi rút cúm được đánh số theo độ dài nucleotide giảm dần. Đoạn RNA 1, 3, 4, 5 và 6 chỉ mã hóa cho một protein tương ứng là PB2, PA, HA, NP và NA.Phân đoạn 2, 7 và 8 mỗi phân đoạn mã hóa cho 2 protein tương ứng là PB1-PB1F2, M1- M2 và NS1-NS2. Cấu trúc và chức năng của các protein của vi rút: Heamaglutinin (HA): Heamaglutinin là protein trên bề mặt của vi rút được mã hóa bởi đoạn RNA số 4 có chức năng bám vào thụ thể trên bề mặt tế bào chủ và khởi đầu sự xâm nhập của vi rút cúm vào cơ thể. Trên bề mặt tế bào người, HA gắn vào thụ thể alpha 2,6 axit sialic; trên tế bào gia cầm, HA gắn vào thụ thể alpha 2,3 axit sialic; trên tế bào của lợn có mang cả hai loại thụ thể . Neuraminidase (NA): Protein bề mặt thứ hai có chức năng là một enzyme, neuraminidase, được mã hóa bởi phân đoạn gen thứ 6. Neuraminidase sau khi được phiên mã, protein có dạng hình nấm bao gồm 4 chuỗi polypeptide. NA xúc tác cho quá trình cắt đứt mối liên kết α 2,3 hoặc α 2,6 ketosidic phá hủy thụ thể HA trên bề mặt tế bào, tạo điều kiện cho sự giải phóng vi rút mới ra khỏi tế bào chủ 3 Các nhà khoa học đã xác định được 17 loại hemagglutinin khác nhau. Các phân típ NA chủ yếu gây bệnh trên người là N1 (H1N1, H5N1, H1N1 đại dịch), N2 (H3N2, H9N2) và gần đây là N9 (H7N9). Protein màng (M-matrix): Đoạn RNA số 7 mã hóa cho hai protein M1 và M2.Protein M1 là protein nền (matrix) nằm ngay dưới lớp vỏ của vi rút. M2 là một protein xuyên màng, hoạt động như một kênh ion có trách nhiệm bơm ion H+ từ nội bào vào trong vi rút, giải phóng các RNP của vi rút vào trong nội bào của tế bào cảm nhiễm Các polymerase PB1, PB2, PA và nucleoprotein (NP):Tồn tại trong hệ gen của vi rút cúm còn có các phân đoạn gen 1, 2 và 3 chịu trách nhiệm tạo ra các RNA-RNA polymerase: phức hợp PA-PB1-PB2.NP được mã hóa bởi phân đoạn thứ 5 trong bộ gen của vi rút cúm có tính bảo tồn cao, chức năng chủ yếu của NP là tham gia vào quá trình tổng hợp RNA của vi rút và quá trình tạo thành hạt vi rút mới. 1.1.2. Cơ chế nhân lên của virút cúm A Vi rút cúm A nhân lên qua bốn giai đoạn: Sự bám dính, sự thâm nhập, sự cởi áo, tổng hợp RNA, các protein và sự giải phóng của vi rút. Vi rút cúm bám vào tế bào biểu mô đường hô hấp bằng cách dùng heamoglutinin gắn vào phần axit sialic của glucoprotein và glucolipid trên bề mặt tế bào (α2,3 hoặcα 2,6 axit sialic). Vi rút tiến vào tế bào chủ bằng quá trình thực bào. Sự hoạt động của protein M2 chấm dứt tình trạng pH thấp trong thể thực bào, phá vỡ vỏ giải phóng RNP vào tế bào chất của tế bào chủ. RNA của vi rút cúm được tổng hợp và nhân lên tại nhân tế bào, các RNP và M1 liên kết các thành phần lại để tạo nên hạt vi rút. Hạt vi rút nảy chồi ra phía ngoài màng tế bào chủ rồi được tách ra khỏi tế bào nhờ hoạt động của enzyme neuraminidase. 1.1.3. Thay đổi nhỏ và thay đổi lớn trong hệ gen của vi rút cúm A Những thay đổi nhỏ trên gen Enzyme polymerase của vi rút cúm và các vi rút mang RNA nói chung không có chức năng sửa chữa sai sót trong quá trình kéo dài chuỗi sau mỗi lần nhân lên và đã tạo ra các biến đổi trong RNA thế hệ mới. Những biến đổi nhỏ trên phân đoạn gen mã hóa HA và NA tác động lên tính lây nhiễm của vi rút cúm thế hệ mới. Những biến đổi nhỏ này xảy ra còn liên quan đến sự né tránh miễn dịch của vi rút cúm với kháng thể đã được tạo ra bởi những lần nhiễm trước đó, vì vậy, các vi rút mang những biến đổi này có thể là nguyên nhân gây nên những vụ dịch cúm hàng năm. Những thay đổi lớn trên gen liên quan đến sự thay đổi về mặt kháng nguyên Sự biến đổi lớn về mặt di truyền học và đặc tính kháng nguyên tạo nên vi rút tuy cùng mang tên một phân typ vi rút (vd: H1N1) nhưng bản chất vi rút đã có sự thay đổi hoàn toàn, vì vậy các đáp ứng miễn dịch đặc hiệu sẽ không cho kết quả đáp ứng chéo bảo vệ giữa các phân típ vi rút cùng tên đã biết. Hậu quả của sự xuất hiện vi rút mới mà không có kháng thể tồn lưu có khả năng chống lại trong quần thể, sẽ là nguyên nhân một đại dịch lan rộng trên toàn thế giới (đại dịch cúm 1918, 1977, 2009 với vi rút cúm A phân típ H1N1). 1.1.4. Sự trao đổi và tích hợp trong hệ gen của vi rút cúm A Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng, với vật liệu di truyền phân đoạn như vậy, sự tái sắp xếp của vật liệu di truyền giữa các chủng vi rút cúm có khả năng xảy ra khi có sự 4 đồng nhiễm hai hay nhiều vi rút cúm A phân typ khác nhau trên một vật chủ, kết quả là sự tạo ra một loại vi rút thế hệ mới trong đó cấu trúc gen là sự trộn và sắp xếp lại của các vi rút cúm đồng nhiễm. 1.1.5. Khả năng gây bệnh của vi rút cúm Cúm là một bệnh nhiễm trùng đường hô hấp cấp tính do vi rút cúm gây ra. Đường lây truyền chủ yếu của vi rút cúm có thể qua là qua giọt nước bọt nhỏ mang vi rút tung ra khi người bệnh tiếp xúc trực tiếp với người lành. Từ đầu thế kỷ XX đến nay, thế giới ghi nhận 4 đại dịch cúm, ước tính có khoảng 40 triệu người đã chết do nhiễm cúm. Bệnh cúm ở Việt Nam xuất hiện quanh năm, có hai đỉnh rõ rệt vào mùa đông xuân với sự lưu hành của vi rút cúm B (tháng 2 – tháng 3) và mùa hạ với sự lưu hành của các chủng thuộc phân typ cúm A (tháng 7 – tháng 8). 1.1.6. Tiến hóa của vi rút cúm A Sự tiến hóa của vi rút cúm được ghi nhận đầu tiên là sự tiến hóa về di truyền học với những thay đổi nhỏ, thay đổi lớn trên gen. Sự tiến hóa của vi rút cúm A còn được khẳng định là sự tiến hóa thích nghi. Tác động của con người lên sự tiến hóa của vi rút cúm A chưa được đánh giá một cách rõ ràng nhưng những hoạt động như sử dụng gia cầm, tiêm văc xin hay sử dụng thuốc kháng vi rút cũng có khả năng ảnh hưởng đến sự tiến hóa. 1.2. Phòng và điều trị vi rút cúm A 1.2.1.Văc xin phòng cúm Các loại văc xin đưa vào sử dụng gồm hai chủng A (một chủng A/H3N2 và một chủng A/H1N1pdm09) và một chủng cúm B, được lựa chọn từ hơn 100 trung tâm cúm quốc gia từ hơn 80 quốc gia trên thế giới. Các loại văc xin cúm bao gồm: Văc xin bất hoạt, Văc xin sống giảm độc, Các loại văc xin thế hệ mới (reverse genetic văc xin, DNA văc xin) 1.2.2. Thuốc điều trị vi rút cúm A Các thuốc dòng ức chế sự xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm Amantadine và rimantadine là các dẫn chất của adamantane, Cơ chế tác dụng của các chất này là ức chế kênh trao đổi ion M2 xuyên màng của vi rút cúm A, ion H+ không thể đi vào bên trong virút, pH trong vi rút không thay đổi, hạn chế quá trình hòa màng của vi rút với tế bào chủ , ngăn cản quá trình ”cởi áo” vi rút để xâm nhập vào bên trong tế bào chủ Hiện tượng kháng thuốc thường xảy ra với các chủng cúm A/H3N2 do xuất hiện các điểm đột biến trên gen M (phần M2). Các thuốc dòng ức chế neuraminidase Oseltamivir và zanamivir là hai chất ức chế chọn lọc trên enzyme bề mặt neuraminidase của vi rút cúm. Ức chế quá trình phân cắt axit sialic trên bề mặt tế bào chủ khỏi glycoprotein HA của hạt vi rút mới nảy chồi, vi rút chỉ có khả năng nhiễm và nhân lên trong tế bào nhiễm nhưng không thể phát tán xâm nhập các tế bào lành khác, ngăn chặn khả năng gây bệnh của vi rút. Sự đột biến trên protein NA làm giảm hiệu quả tương tác giữa thuốc và neuraminidase. 1.2.3. Các thuốc kháng vi rút mới Thuốc ức chế sự xâm nhập của vi rút vào tế bào (ức chế thụ thể trên bề mặt tế bào – DAS181); Các thuốc ức chế neuraminidase (Peramivir và Laninamivir); Thuốc ức chế sự tái tạo vi rút của vi rút cúm - T-705. 5 1.3.Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm A với thuốc kháng vi rút 1.3.1. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc amantadine Được sử dụng từ những năm 60 của thế kỷ trước, amatadine có hiệu quả điều trị chống lại tất cả các phân típ cúm A gây bệnh cho người trước đây (H1N1, H2N2, H3N2) nhưng không chống lại được vi rút cúm B do protein M2 chỉ có ở vi rút cúm A. Sau 7 năm đưa vào sử dụng (1995-2002), tác dụng của adamantane trong điều trị và phòng bệnh có hiệu quả không cao bởi quá trình kháng thuốc đã xuất hiện và lan truyền nhanh trong quần thể. Tỉ lệ kháng thuốc amantidine là 2% năm 2002 tăng lên 12% năm 2004 và 100% ở các chủng A/H3N2 năm 2005. Theo kết quả của các nghiên cứu về tỉ lệ kháng amantadine của virút cúm A cho thấy 100% các virút cúm A/H3N2 và A/H1N1pdm09 kháng amantadine. 1.3.2. Tình hình kháng thuốc của vi rút cúm với thuốc oseltamivir Oseltamivir và zanamivir là hai chất ức chế chọn lọc trên enzyme bề mặt neuraminidase của vi rút cúm được đưa vào sử dụng từ năm 1999. Gần đây các nghiên cứu trong nước và trên thế giới chỉ ra rằng những chủng vi rút kháng lại oseltamivir chủ yếu trên phân típ A/H1N1 lưu hành trước năm 2009. Các chủng kháng với oseltamivir đã bắt đầu xuất hiện năm 2007, sau đó tăng nhanh 43-60% năm 2008 và lan rộng trên toàn thế giới năm 2009 với tỉ lệ kháng lên đến 95% (Nhật, Mỹ, Châu Âu). Các phân típ H5N1, H1N1pdm09 cũng đã được ghi nhận các trường hợp kháng oseltamivir trên thế giới và tại Việt Nam. 1.4. Kỹ thuật áp dụng trong quá trình xác định tính kháng thuốc của vi rút cúm A 1.4.1. Các kỹ thuật được áp dụng trong giám sát sự kháng thuốc thông qua sự thay đổi vật liệu di truyền của vi rút cúm Kỹ thuật giải trình tự gen Sanger (phương pháp thông thường):Kỹ thuật được thực hiện có thể theo dõi được sự xuất hiện hiện tượng kháng thuốc của vi rút cúm. Điển hình là sự xuất hiện của hiện tượng kháng amantadine của vi rút A/H3N2, hiện tượng kháng oseltamivir của vi rút A/H1N1 và là phương pháp chủ yếu được lựa chọn để xác định chủng vi rút cúm A kháng amantadine Kỹ thuật đa hình độ dài đoạn giới hạn (RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism): Enzyme giới hạn BspHI hoặc BclI sẽ cắt sản phẩm PCR tại với vị trí xác định có trình tự tương ứng với vi rút không mang đột biến kháng thuốc (vi rút nhạy cảm với thuốc), trong trường hợp vi rút mang gen kháng thuốc, sản phẩm PCR sẽ không được cắt bởi enzyme giới hạn. Kỹ thuật giải trình tự đoạn gen ngắn thực hiện với từng nucleotide xác định (pyro- sequencing): Mục tiêu chính của phương pháp là xác định các điểm đột biến có sẵn trên cỡ mẫu lớn trong thời gian ngắn. Kỹ thuật realtime RT-PCR: Kỹ thuật này được đưa vào thử nghiệm lần đầu tiên năm 2008 với ứng dụng tìm điểm đột biến H275Y trên phân đoạn gen mã hóa NA của virút cúm A/H1N1. 1.4.2. Kỹ thuật xác định mức độ kháng oseltamivir dựa trên hoạt động của enzyme neuraminidase Xác định hoạt động của NA 6 Mục đích của việc xác định hoạt động của neuraminidase là đánh giá hoạt động của enzyme trong quá trình nhân lên của vi rút và chuẩn hóa nồng độ vi rút trước khi thực hiện việc xác định mức độ kháng thuốc của vi rút. Xác định mức độ kháng oseltamivir/zanamivir *Dựa trên hoạt động của enzyme neuraminidase với chất phát quang có nguồn gốc hóa học Việc nhận định mức độ kháng thuốc oseltamivir/zanamivir của vi rút cúm dựa vào sự phát quang của chất có nguồn gốc hóa học (chemiluminesence). Kết quả thu được từ kỹ thuật này được đánh giá có đủ độ tin cậy và được sử dụng tại nhiều phòng thí nghiệm (PTN) chuẩn thức trên thế giới như PTN tại trung tâm kiểm soát bệnh dịch Hoa Kỳ (US CDC), PTN tại viện các bệnh truyền nhiễm quốc gia Nhật Bản. *Dựa trên hoạt động của enzyme neuraminidase với chất phát quang là huỳnh quang Đây là kỹ thuật xác định độ nhạy cảm của enzyme neuraminidase với thuốc ức chế hoạt động của enzyme (oseltamivir, zanamivir...) có sử dụng chất huỳnh quang trong thành phần của phản ứng. Kết quả của thử nghiệm xác định được nồng độ thuốc ức chế 50% hoạt động của vi rút. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong các PTN do khả năng ứng dụng linh hoạt trong sử dụng hóa chất sinh phẩm và được tổ chức y tế thế giới khuyến cáo sử dụng xác định mức độ kháng thuốc của các chủng vi rút. 1.4.3. Giám sát sự kháng thuốc virút cúm Xây dựng quy trình giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm Các phương pháp đều đã được xây dựng quy trình chuẩn (SOP) nhằm tạo tiền đề cho việc thực hiện xét nghiệm giám sát thường xuyên sự kháng thuốc của vi rút cúm tại phòng thí nghiệm. Chiến lược thực hiện giám sát sự kháng thuốc của vi rút cúm tại phòng thí nghiệm Quy trình giám sát vi rút cúm kháng thuốc được Nhóm nghiên cứu thuốc kháng vi rút thuộc Hiệp hội quốc tế về cúm và các vi rút gây bệnh đường hô hấp khác(ISIRV) khuyến cáo thực hiện bao gồm quá trình xác định biểu hiện kháng thuốc của các chủng vi rút thông qua kỹ thuật NAI với cơ chất huỳnh quang, sau đó các chủng có biểu hiện kháng thuốc sẽ được xác định vị trí đột biến liên quan đến kháng thuốc trên gen NA bằng các phương pháp như giải trình tự gen thông thường hoặc realtime RT- PCR. Quy trình này hiện nay đang được áp dụng tại các phòng thí nghiệm tham chiếu của TCYTTG tại CDC-Altanta, Melbourne-Úc và NIID-Nhật Bản. Theo quy trình này, các chủng mang đột biến kháng thuốc sẽ được giám sát sự tiến hóa trong quá trình tiến hóa chung của vi rút cúm, từ đó có thể xác định được kiểu gen và kiểu hình đặc thù của vi rút cúm lưu hành tại Việt Nam. 7 CHƯƠNG II - ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Các chủng vi rút cúm thuộc nhóm A bao gồm các phân típ A/H1N1, A/H3N2, A/H5N1, A/H1N1 đại dịch 09 phân lập được tại phòng thí nghiệm cúm từ năm 2001 đến 2012 từ các nguồn: Giám sát phòng thí nghiệm 2001 – 2005, chương trình giám sát cúm quốc gia 2006 – 2012 và giám sát viêm phổi nặng 2003 – 2012. Các chủng vi rút được thu thập tại các tỉnh phía Bắc gồm Lạng Sơn, Hòa Bình, Hà Nội, Hà Nam, Nam Định, Bắc Ninh, Ninh Bình, Hưng Yên, Thái Bình và Thanh Hóa. 2.2. Phương pháp nghiên cứu Toàn bộ các vi rút cúm mùa A/H1N1, A/H1N1pdm09, A/H3N2 và A/H5N1 sau khi phân lập được xác định mức độ kháng thuốc bằng phương pháp ức chế neuraminidase, các vi rút có biểu hiện giảm độ nhạy cảm với oseltamivir sẽ được giải trình tự phân đoạn gen mã hóa NA để xác định điểm đột biến liên quan đến kháng thuốc và phân đoạn gen mã hóa HA để xác định sự tiến hóa của vi rút (ref). Tuy nhiên, để thực hiện mục tiêu của nghiên cứu về sự tiến hóa của vi rút, toàn bộ chủng cúm A trong nghiên cứu được giải trình tự hai phân đoạn gen mã hóa HA và NA. 2.3. Vật liệu và kỹ thuật xét nghiệm Chủng vi rút: Cỡ mẫu trong nghiên cứu được xác định là cỡ mẫu toàn bộ 342 chủng bao gồm: 42 chủng H1N1 thu thập từ năm 2001 đến 2009; 157 chủng H1N1pdm09 thu thập từ tháng 6 năm 2009 đến 2012; 115 chủng H3N2 thu thập từ năm 2003 đến 2012 và 28 chủng H5N1 thu thập từ năm 2004 đến 2012 Kỹ thuật xét nghiệm: Phân lập vi rút, xác định nồng độ oseltamivir ức chế neuraminidase và giải trình tự gen Sinh phẩm: Tế bào MDCK (CDC) phân lập vi rút cúm; Giải trình tự gen sử dụng bộ kit của hãng ABI, Mỹ, mồi được cung cấp bởi CDC; xác định nồng độ oseltamivir ức chế neuraminidase sử dụng bộ kit của hãng Life Technology, Mỹ, oseltamivir được cung cấp bởi hãng Roche. 2.4. Phân tích số liệu Các giá trị IC50 thu được sau khi thực hiện thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm JASPR được cung cấp bởi CDC-Altanta Hoa Kỳ. Giá trị ngưỡng và mức độ kháng oseltamivir của vi rút cúm được xác định và phân tích thông qua phần mềm Graphpad Prism 6.0.2, Mỹ. Trình tự nucleotide phân đoạn gen mã hóa NA và HA của các vi rút sau khi được giải trình tự được phân tích sự tương đồng và các điểm đột biến liên quan đến kháng thuốc bởi phần mềm DNASTAR, Winscosin, USA và Bioedit phiên bản 7.2.3; cây gia hệ phân đoạn gen mã hóa HA và NA được xây dựng bằng phần mềm MEGA5 sử dụng phương pháp Maximum Likelihood. Các trình tự phân đoạn gen HA và NA tham chiếu thuộc các phân t