Tóm tắt luận án Tỷ lệ nhiễm và mang gen kháng Cephalosporin thế hệ 3 và quinolon của các chủng Klebsiella gây nhiễm khuẩn hô hấp phân lập tại bệnh viện nhi Trung Ương 2009-2010

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG ----------------------------- BÙI THỊ MÙI TỶ LỆ NHIỄM VÀ MANG GEN KHÁNG CEPHALOSPORIN THẾ HỆ 3 VÀ QUINOLON CỦA CÁC CHỦNG KLEBSIELLA GÂY NHIỄM KHUẨN HÔ HẤP PHÂN LẬP TẠI BỆNH VIỆN NHI TRUNG ƯƠNG, 2009-2010 Chuyên ngành: Vi sinh y học Mã số: 62.72.01.15 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI - 2014 2 CÔNG TRÌNH ĐÃ ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Nguyễn Thanh Liêm 2. TS. Lê Thị Ánh Hồng Phản biện 1. Phản biện 2. Phản biện 3. ......................................................................... Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp viện tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương vào hồi ..... giờ ....., ngày ...... tháng ..... năm ....... Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư viện Quốc gia 2. Thư viện Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương 3 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribo nucleic ARN : Acid ribonucleic C3G : Cephalosporin thế hệ 3 ESBL : Extended Spectrum Beta Lactamases(Men beta- lactamase phổ rộng) HH : hô hấp HSCC : Hồi sức cấp cứu HSN : Hồi sức ngoại MIC : Minimal Inhibitory concentration(nồng độ ức chế tối thiểu) PCR : polymerase chain reaction( phản ứng chuỗi trùng hợp) PFGE : pulsed field Get Eleetrophoness( điện di ung trường) NKHHCT : nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính WHO : world heath organization(tổ chức y tế thế giới) 4 ĐẶT VẤN ĐỀ Giống Klebsiella là một trong các hệ vi khuẩn có ở đường tiêu hóa, hô hấp của người, là căn nguyên của một số bệnh nhiễm khuẩn ở người, gây bệnh chủ yếu ở trẻ nhỏ. Trên thế giới loài Klebsiella là một trong những căn nguyên quan trọng gây nhiễm khuẩn ở bệnh nhi nằm điều trị tại bệnh viện đặc biệt là những trẻ sơ sinh non yếu và trẻ nhỏ. Tỷ lệ nhiễm khuẩn do Klebsiella ở trong bệnh viện đặc biệt là những đơn vị hồi sức cấp cứu rất khác nhau giữa các nước từ 10,2%-26,2% . Tình trạng kháng với hầu hết các kháng sinh đang là một mối đe doạ lớn đối với thầy thuốc và người bệnh. Với kháng sinh thông thường như Ampicillin, Cephazolin, Klebsiella spp. đã kháng cao 60%-100%. Phát hiện gen kháng kháng sinh nhóm quinolon lan truyền qua plasmid là mốc quan trọng trong nghiên cứu về gen kháng kháng sinh của vi khuẩn này. Nghiên cứu về cơ chế kháng kháng sinh được tiến hành với mục đích tìm căn nguyên của sự gia tăng tính kháng kháng sinh của Klesiella, trong đó cơ chế kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon được nghiên cứu ở nhiều nước. Ở Việt Nam, Klebsiella là căn nguyên hàng đầu gây nhiễm khuẩn hô hấp phân lập được chủ yếu ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ nằm điều trị tại bệnh viện. Tỷ lệ Klebsiella spp kháng và đa kháng kháng sinh cao với ampicillin và cephalotin kháng 97,8% và 91,7% ở trẻ em. Những nghiên cứu tìm hiểu về tình trạng mang gen mã hóa sinh men β-lactamase phổ rộng gây kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon lan truyền qua plasmid chưa được thực hiện nhiều ở Việt Nam. Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm mục tiêu: 1- Xác định tỷ lệ chủng Klebsiella phân lập được ở đường hô hấp của các bệnh nhi từ 0 đến 6 tuổi tại Bệnh viện Nhi Trung ương năm 2009-2010. 2- Xác định tính kháng kháng sinh của các chủng Klebsiella phân lập được. 3- Xác định tỷ lệ mang gen kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon của các chủng Klebsiella phân lập được. * Những đóng góp mới của luận án: Nghiên cứu đầu tiên được tiến hành trên đối tượng bệnh nhi từ 0-6 tuổi, đã phát hiện được cơ chế kháng kháng sinh của Klesiella, trong đó xác định được gen kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon của các chủng Klebsiella phân lập được tại Bệnh viện Nhi Trung ương. 5 * Bố cục luận án: Luận án gồm 120 trang bao gồm: Đặt vấn đề: 2 trang; Chương 1. Tổng quan: 38 trang; Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 21 trang; Chương 3. Kết quả nghiên cứu: 38 trang; Chương 4. Bàn luận: 18 trang; Kết luận: 2 trang và kiến nghị: 1 trang. Luận án gồm: 29 bảng, 18 biểu đồ, 3 sơ đồ và 17 hình. Tài liệu tham khảo: 121 tài liệu. Chương 1 TỔNG QUAN 1.1.Các đặc điểm về giải phẫu, sinh lý và miễn dịch hệ hô hấp 1.1.1. Các đặc điểm về giải phẫu Bộ máy hô hấp bao gồm đường hô hấp trên và đường hô hấp dưới. Ranh giới phân chia là nắp thanh quản . 1.1.2. Đặc điểm sinh lý: Bộ máy hô hấp trẻ em chưa hoàn chỉnh những năm đầu đời. 1.1.3. Cơ chế miễn dịch bảo vệ đường hô hấp  Hàng rào niêm mạc  Các tế bào thực bào  Các yếu tố thể dịch 1.2. Các căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp tính ở trẻ em. 1.2.1. Các căn nguyên gây nhiễm trùng hô hấp cấp tính ở trẻ em - Tác nhân virus: Đa số các trường hợp NKHHCT ở trẻ em là do virus (60- 70%). - Tác nhân vi khuẩn: + Các loại vi khuẩn thường gặp trong nhiễm trùng cộng đồng: Heamophilus Influenzae, Streptococcus Pneumoniae, Moracella Catarrhalis,Staphylococcus aureus. + Các loại vi khuẩn thường gặp trong nhiễm trùng bệnh viện: S. Aureus, P. Aeruginosa, Các trực khuẩn Gram âm dễ mọc khác, Klebsiella pneumoniae ... 1.2.2. Klebsiella trong NKHHCT Nhiễm khuẩn do K.pneumoniae và K. oxytoka thường gặp nhất ở người. Klesiella chiếm 8% các nhiễm trùng của bệnh viện. 14% nhiễm khuẩn huyết nguyên phát do Klesiella. Trong số 145 báo cáo bùng phát nhiễm trùng bệnh viện từ 1983- 1991 có 13 báo cáo được quy kết là do Klesiella. Các trung tâm kiểm soát dịch bệnh và phòng chống chủng Klesiella cho thấy có 3% nguyên nhân bùng phát dịch bệnh do Klesiella. 6 Một cuộc điều tra Klesiella pneumoniae carbamenemase (KPC) ở những bệnh nhân nhiễm khuẩn đường ruột trong năm 2011 thấy sự lan truyền rộng rãi KPC trong 4 huyện liền kề ở Ấn Độ trong 1 năm. Bùng phát nhiễm khuẩn huyết ở trẻ sơ sinh trên khắp thế giới, nhiễm trùng khác do Klesiella. cũng gặp trên toàn thế giới. Thường gặp ở các khu vực Đông Âu, Nam Á, Trung Phi và châu Mỹ la tinh. 1.3. Phương pháp chẩn đoán vi sinh trong nhiễm khuẩn hô hấp cấp tính 1.3.1. Phương pháp thông thường 1.3.2. Phương pháp cấy đếm 1.4. Một số kỹ thuật xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn gây bệnh với kháng sinh 1.4.1. Kháng sinh và cơ chế kháng kháng sinh Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh lên tế bào vi khuẩn:  Kháng sinh ức chế quá trình tổng hợp vách  Kháng sinh tác động trên màng nguyên tương  Kháng sinh ức chế quá trình sinh tổng hợp protein  Kháng sinh ức chế sinh tổng hợp acid nucleic  Kháng sinh ức chế quá trình sinh tổng hợp acid folic Cơ chế đề kháng kháng sinh:  Đề kháng tự nhiên  Đề kháng thu được Cơ sở di truyền học của sự đề kháng thu được:  Đề kháng thu được do đột biến trên NST: Đột biến thường xẩy ra ở giai đoạn sao chép các bazơ purin và pyrimidin trong quá trình tổng hợp của ADN, các ADN mới được tổng hợp sẽ không còn giống với phiên bản của ADN thế hệ trước.  Đề kháng thu được do nhận được gen đề kháng qua các hình thức vận chuyển di truyền: Biến nạp, tải nạp, tiếp hợp  Thành phần di truyền di động (transposons - gen nhảy)  Cơ chế lan truyền gen đề kháng 1.4.2. Các cơ chế đề kháng kháng sinh họ vi khuẩn đường ruột với kháng sinh nhóm beta - lactam  Đề kháng tự nhiên: Đề kháng tự nhiên do sinh ra enzym - lactamaza và đề kháng tự nhiên không do sinh ra enzym -lactamaza  Đề kháng thu được:  Đề kháng thu được làm cho vi khuẩn sinh ra enzym - lactamaza 7  Vi khuẩn sinh ra enzym penicillinaza do nhận được gen đề kháng nằm trên plasmid  Vi khuẩn tăng cường sản xuất ra enzym penicillinaza do gen đề kháng nằm trên nhiễm sắc thể  Đề kháng thu được làm cho vi khuẩn sinh ra enzym cephalosporinaza do gen mã hóa nằm trên nhiễm sắc thể  Đề kháng thu được làm cho vi khuẩn sinh ra các enzym - lactamaza khác - Năm 1989-1990, hai tác giả Bauernfeind và Papanicolaou đã tìm thấy ở loài K. pneumoniae sinh ra enzym -lactamaza kháng lại kháng sinh cephamycin (CMY-1, MIR-1), gen mã hóa nằm trên plasmi. - Enzym immipenemaza cũng đã được tìm thấy ở các loài S. marcescens và E. cloacae bởi các tác giả Yang (1990), Lee và Raimondi (1991). - Các Beta Lactamase mới * TEM-TYPE ESBLs (Lớp A): việc thay thế amino acid ở nhiều vị trí ở TEM-1 beta-lactamase có thể được tạo ra ở phòng thí nghiệm mà không mất hoạt tính. Sự thay đổi vị trí này của ESBLs làm thay đổi hình dạng vị trí hoạt hóa của men, cho phép thâm nhập oxyimino-beta-lactam. Trên 130 men TEM đã được tìm thấy, và sự đa dạng của chúng có lợi cho việc theo dõi sự lan tràn của các gene đề kháng. * SHV-TYPE ESBLs (lớp A): SHV-1 chia 68% các amino acid của nó với TEM-1 và có cấu trúc tương tự. Cũng như TEM, SHV-type ESBLs có một hoặc nhiều sự thay thế các amino acid xung quanh vị trí hoạt hóa. Hơn 50 dạng khác nhau của SHV đã được biết. * CTX-TYPE ESBLs (lớp A): Hiện nay, có hơn 40 CTX-M đã được biết. * NHỮNG ESBLs LỚP A KHÁC: PER-1 được phân lập ở Thổ Nhĩ Kỳ, Pháp, và Ý; VEB-1 và VEB-2 tìm thấy ở Đông Nam Á; GES-1, GES-2 và IBC-2 được phân lập ở Nam Phi, Pháp và Hy Lạp. PER-1 cũng thường gặp ở dòng acinetobacter ở Hàn Quốc và Thổ Nhĩ Kỳ. Một số các men này cũng được tìm thấy ở Enterobacteriaceae, ngược lại các ESBLs ít gặp (như BES-1, IBC-1, SFO-1 và TLA-1) chỉ được tìm thấy ở Enterobacteriaceae. * OXA-TYPE ESBLs (lớp D): 12 ESBLs bắt nguồn từ OXA-10, OXA-1, hay OXA-2 bằng cách thay thế các amino acid. * MEN PLASMID-MEDIATED AmpC (lớp C): AmpC beta- lactamases, sinh ra do beta-lactam, được mã hóa ở các gene trên nhiễm sắc 8 thể ở nhiều trực khuẩn gram âm. Các đột biến làm gia tăng tình trạng đề kháng cephalosporin phổ rộng ở Enterobacter cloacae. Hơn 20 AmpC beta-lactamase được tìm thấy truyền qua trung gian plasmid. * CARBAPENEMASES (LỚP A, B VÀ D): carbapenemases là một nhóm khác, hiện nay ít gặp tuy nhiên rất được quan tâm, vì chúng có hoạt tính không những chỉ chống lại oxyimino-cephalosporin và cephamycin mà còn với carbapenem. Plasmid-mediated IMP-type carbapenemases (hiện nay đã biết được 17 loại), được tìm thấy ở Nhật (1990s), ở cả gram âm đường ruột, pseudomonas và acinetobacter sp. 1.4.3. Đề kháng với kháng sinh Quinolon Sự đề kháng với nhóm kháng sinh này cho đến nay vẫn được hiểu là do đột biến trên NST. Sự đột biến này làm thay đổi đặc tính của enzym tác động vào quá trình sinh tổng hợp ADN (enzym ADN - gyrase) làm cho kháng sinh không tác động vào được nữa. Năm 1998, Martinez - Martinez và cộng sự, lần đầu tiên mô tả chủng K. pneumoniae mang gen kháng quinolon nằm trên plasmid, đồng thời các gen này còn gắn trên các Integron khác nhau. Hơn nữa, các plasmid này cũng đồng thời mang gen mã hóa enzym -lactamase phổ rộng hoặc enzyme cephalosporinase. Phát hiện này có tầm quan trọng rất lớn, bởi nó nói lên rằng gen kháng quinolon có thể được lan truyền ngang giữa các vi khuẩn. 1.5. Phương pháp xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh và các phương pháp xác định gen kháng thuốc của vi khuẩn 1.5.1. Phương pháp xác định độ nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh 1.5.1.1. Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán trên thạch 1.5.1.2. Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (Minimum Inhibitory Concentration - MIC)  Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn trong môi trường đặc  Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn trong môi trường lỏng  Kỹ thuật xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn bằng băng giấy Etest 1.5.2.Các kỹ thuật xác định cơ chế kháng kháng sinh 1.5.2.1. Kỹ thuật tiếp hợp trên mặt thạch 1.5.2.2. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction). 1.5.2.3. Phương pháp Real-Time PCR 1.5.2.4. Kỹ thuật phương pháp lai phân tử 1.5.2.5. Kỹ thuật giải trình tự gen 9 1.6. Nhiễm khuẩn hô hấp và tình hình kháng kháng sinh do Klebsiella 1.6.1. Tình hình nhiễm và kháng kháng sinh của Klebsiella spp. ở nước ngoài Nhiễm khuẩn hô hấp do Klebsiella spp. ở trong cộng đồng là hiếm gặp, thường gặp ở những người có miễn dịch kém như trẻ nhỏ, người già, người mắc bệnh mãn tính .... Nhiễm khuẩn do Klebsiella spp. gặp chủ yếu ở trẻ sơ sinh và sơ sinh non yếu. Tỷ lệ chủng kháng và đa kháng kháng sinh cao, nhất là chủng sinh men β-lactamase phổ rộng và KPC. Đặc biệt là những chủng Klebsiella spp. mang gen NDM-1 gây đề kháng các loại kháng sinh hiện có và làm cho Klebsiella spp. trở thành siêu vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh. Tỷ lệ nhiễm khuẩn do Klebsiella spp. khác nhau ở các nước. Tại Châu Âu, tỷ lệ Klebsiella spp. gây nhiễm khuẩn ở các bệnh viện từ 3% - 17%; ở Thổ Nhĩ Kỳ 26,2%. Các chủng Klebsiella spp. gây nhiễm khuẩn bệnh viện đề kháng cao với các kháng sinh ngoại trừ imipenem (IPM) và ciprofloxacin (CIP), tỉ lệ kháng với các kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin và quinolon ở cộng đồng là 4% và 21%, tỉ lệ này cao gấp hai lần đối với những chủng phân lập được từ nhiễm trùng bệnh viện. Các chủng phân lập được từ nhiễm trùng bệnh viện đã kháng 60%-100% đối với ampicillin (AM) và cephazolin, xuất hiện chủng kháng với nhiều loại kháng sinh, với IPM và CIP kháng 0%-12%. Các chủng sinh men β- lactamase phổ rộng (ESBLs) là yếu tố lan tràn và bùng phát nhiễm khuẩn bệnh viện đồng thời tăng tỉ lệ chủng kháng đa kháng kháng sinh. Tỉ lệ chủng có men ESBLs phân lập ở bệnh nhân viêm phổi nhiễm trùng bệnh viện là 88,9% còn phân lập từ những bệnh nhân viêm phổi không phải do nhiễm trùng bệnh viện là 11,1%. Những báo cáo mới nhất về cơ chế kháng kháng sinh nhóm quinolon của các nhà nghiên cứu cho thấy vai trò chủ yếu là do đột biến trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn. Năm 1998, Martinez - Martinez và cộng sự, lần đầu tiên mô tả chủng Klebsiella pneumoniae kháng nhóm kháng sinh quinolon theo cơ chế lan truyền gen P.M.G 252 trên plasmid. Sự kháng kháng sinh nhóm quinolon được xác định bởi gen qnr nằm trên các Integron khác nhau. Phát hiện này có tầm quan trọng rất lớn bởi nó nói lên rằng gen kháng quinolon có thể lan truyền ngang giữa các vi khuẩn với nhau. Thêm vào đó các integron này đồng thời mang gen kháng kháng sinh cephalosporin thế hệ thứ ba (do enzym -lactmase phổ rộng hoặc do enzyme cephalosporinase). 10 Tỷ lệ mang gen kháng qnr khác nhau giữa các nước và các khu vực:từ 4% đến 55% tập trung cao ở các nước Đông nam Á, đặc biệt là Hàn Quốc và Trung Quốc từ 20,3 đến 55% Sự kháng kháng sinh cephalosporin thế hệ 3 (C3G) liên quan đến sự kháng quinolon theo cơ chế plasmid luôn được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm. Cũng giống như quinolon, chủng kháng C3G thay đổi tùy theo vùng địa lý. Những thay đổi quan trọng được báo cáo ở châu Á - Thái Bình Dương. Ở Châu Phi số liệu không nhiều, tỷ lệ kháng khoảng 40%. Đa số chủng mang gen qnr đều kèm theo mang enzym ESBL (SHV-5, SHV-7, CTX-M, Veb-1, Oxa-30) hoặc một -lactamase plasmid type AmpC (Fox-5). Đặc biệt các chủng mang gen kháng CTX-M một gen mã hóa enzym phân hủy Cefotaxime kháng sinh đang được sử dụng nhiều trong điều trị và có những loại CTX-M phân hủy ceptazidime nhanh và mạnh hơn Cefotaxime đã xuất hiện khắp các nước. 1.6.2. Tình hình nhiễm và kháng kháng sinh của Klebsiella spp. ở trong nước: Nhiễm trùng đường hô hấp là một bệnh chiếm tỷ lệ cao trong các nhóm bệnh ở trẻ em 53,3% (nghiên cứu cơ cấu bệnh tật trong 3 năm 2005- 2008 của bệnh viện Thanh Nhàn). Nhiễm khuẩn hô hấp cấp ở trẻ em ở các bệnh viện có tỷ lệ cao : Sain-Paul 36,8%, khoa Nhi - Bệnh viện Bạch Mai 41,35%, Bệnh viện Đak lak 35,5%. Tỷ lệ nhiễm khuẩn hô hấp, nhiễm khuẩn huyết và nhiễm khuẩn tiết niệu trẻ em ở bệnh viện 27,62% - 42,12. Các chủng Klebsiella spp. thu được ở bệnh viện nhi kháng lại kháng sinh ngày một tăng cao. Các kháng sinh thông thường như Ampicilline và Cephalothine kháng 97,8% và 91,7%, nhóm quinolon (31,9%) và C3G khá cao ở nhiễm khuẩn bệnh viện ở trẻ em (42,4 - 57,2%). Những nhiễm khuẩn chung ở người lớn tỷ lệ kháng C3G từ 36,8 - 37,2% và quinolon 31,8%. Tỷ lệ chủng sinh beta-lactamases ở Klebsiella khác nhau tuỳ từng bệnh viện. Bệnh viện Chợ Rẫy 61%; Bệnh viện Việt Đức là 39,3%; Bệnh viện Nhi Trung ương 22,68%. Tỷ lệ kháng C3G cao (36,8% - 57,2%) và quinolon (31,8% - 31,9%). Cho đến nay, ở Việt Nam có nghiên cứu của Cao Thị Bảo Vân và cộng sự với công bố kết quả nghiên cứu sự phân bố gen kháng Bêta- lactam của các chủng thuộc họ Enterobacterriacea phân lập ở Việt nam cho thấy tỷ lệ CTX-M(25,5%); SHV (38,1%) ; TEM (76,3%). 11 Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu: Tất cả các chủng Klebsiella phân lập được từ bệnh phẩm đường hô hấp của các bệnh nhi từ 0 đến 6 tuổi nằm điều trị tại khoa Hồi sức cấp cứu, Hồi sức ngoại, Sơ sinh và khoa Hô hấp bệnh viện Nhi Trung ương từ tháng 7/2009 đến tháng 7/2010. Những mẫu bệnh phẩm đường hô hấp này được thu thập từ hai nhóm : + Nhóm từ những bệnh nhi được chẩn đoán là nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp tính ngay khi nhập viện (như viêm phế quản phổi, viêm phổi, viêm tiểu phế quản phổi....) - gọi là nhóm NKHHCT + Nhóm thu thập từ những bệnh nhi được chẩn đoán những bệnh khác ngoài nhiễm khuẩn đường hô hấp cấp tính khi nhập viện, mà NKHHCT là bệnh đi kèm hoặc xuất hiện sau thời gian nằm điều trị - gọi là nhóm NKHHCT kết hợp - Tiêu chuẩn lựa chọn các chủng Klebsiella vào nghiên cứu gen kháng C3G và Quinolon: Tất cả các chủng Klebsiella có sinh men β- lactamase phổ rộng được xác định theo tiêu chuẩn của CLSI đảm bảo không cùng trên một phòng bệnh trong cùng một ngày nuôi cấy. 2.2. Thiết kế nghiên cứu: Chúng tôi sử dụng thiết kế nghiên cứu mô tả cắt ngang. Nghiên cứu đã phân tích trên 152 mẫu phân lập được Klebsiella có sinh men β-lactamase phổ rộng bằng phương pháp chọn mẫu thuận tiện. 2.3. Các biến số và chỉ số nghiên cứu: - Tỷ lệ chủng Klebsiella phân lập được ở đường hô hấp của đối tượng nghiên cứu theo các Khoa, tuổi, giới, theo các nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp - Tỷ lệ kháng kháng sinh của các chủng Klebsiella phân lập được theo các Khoa, tuổi, giới, theo các nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp. - Tỷ lệ mang gen kháng cephalosporin thế hệ 3 và quinolon (CTX- M, SHV,TEM, qnr) của các chủng Klebsiella phân lập được theo các Khoa, tuổi, giới, theo các nhóm NKHHCT và NKHHCT kết hợp. 12 2.4. Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu Các kỹ thuật xét nghiệm được thực hiện tại Khoa Vi sinh, Bệnh viện Nhi Trung ương và Phòng nghiên cứu kháng kháng sinh - Khoa vi sinh thuộc labo lâm sàng bệnh viện Serveral của Đại học tổng hợp Yonsei - Hàn quốc.  Lấy bệnh phẩm, nuôi cấy phân lập  Nuôi cấy, phân lập, xác định căn nguyên vi khuẩn:  Kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán trên thạch  Kỹ thuật khoanh giấy khuếch tán trên thạch để xác định khả năng sinh men β-lactamase phổ rộng (ESBLs) của vi khuẩn (CLSI)  Xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu ức chế vi khuẩn (Minimum Inhibitory Concentration - MIC)  Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)  Kỹ thuật Southern Blot [120]: 2.5. Phân tích và xử lý số liệu: - Các số liệu thu thập được sẽ được các nghiên cứu viên kiểm tra để phát hiện những sai sót và làm sạch (xử lý thô). - Số liệu sau khi được xử lý thô được mã hóa và nhập vào máy tính bằng phần mềm Epidata 3.1. Chương trình nhập số liệu được xây dựng riêng cho nghiên cứu này bao gồm tệp CHECK nhằm hạn chế tối đa những sai số. - Số liệu nghiên cứu và kết quả được xử lý bằng phần mềm SPSS. Thống kê phân tích được thực hiện thông qua các test như khi bình phương so sánh các tỷ lệ, Mann-Whitney test đối với so sánh 2 nhóm và Kruska Wallis test đối với so sánh 3 nhóm về các đặc điểm của nhóm NKHHCT và nhóm NKHHCT kết hợp. Mức p<0,05 được sử dụng nhằm xác định ý nghĩa thống kê. 2.6. Đạo đức trong nghiên cứu: - Nghiên cứu đã được thông qua hội đồng y đức bệnh viện và hội đồng xét duyệt đề cương nghiên cứu sinh chấp thuận về mặt y đức. 13 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Tỷ lệ và sự phân bố tỷ l