Tóm tắt Luận án Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (Pseudapocryptes Elongatus)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THU DUNG XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ BỐNG KÈO (Pseudapocryptes elongatus) Chuyên ngành: Nuôi trồng Thủy sản Mã số: 62620301 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THỦY SẢN Cần Thơ, 2015 Công trình được hoàn thành tại: Khoa Thủy Sản, Trường Đại học Cần Thơ Người hướng dẫn khoa học: PGs.TS Đặng Thị Hoàng Oanh Phản biện 1:... Phản biện 2:... Phản biện 3:... Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường Họp tại... Vào ..giờ, ngàytháng..năm. Có thể tìm luận án tại: 1. Trung tâm học liệu Trường Đại học Cần Thơ 2. Thư viện Quốc gia BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ NGUYỄN THU DUNG XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN VI KHUẨN GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT TRÊN CÁ BỐNG KÈO (Pseudapocryptes elongatus) Chuyên ngành: Nuôi trồng Thủy sản Mã số: 62620301 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ THỦY SẢN Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH Cần Thơ, 2015 1 Chương 1. TỔNG QUAN VỀ LUẬN ÁN 1.1 Giới thiệu Cá bống kèo (Pseudapocryptes elongates) là loài thủy đặc sản có giá trị kinh tế cao, được tiêu thụ rộng rãi trong nước và có giá trị xuất khẩu. Cá bống kèo được nuôi tập trung ở các tỉnh vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long, tuy nhiên trong thời gian gần đây cá bống kèo nuôi thương phẩm bị bệnh với dấu hiệu bệnh lý là xuất huyết trên thân, tại các vi và hậu môn với tỉ lệ chết cao và chết trên diện rộng. Tác nhân gây xuất huyết được mô tả nhiều nhất là do vi khuẩn. Điển hình như Streptococcus agalactiae là tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá rô phi (Oreochromis sp.) (Phạm Hồng Quân và ctv., 2013), trên cá điêu hồng (Oreochromis sp.) (Đặng Thị Hoàng Oanh và Nguyễn Thanh Phương, 2012). Vi khuẩn S. iniae là tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá chẽm (Latex calcarifer) (Trần Vĩ Hích và Nguyễn Hữu Dũng, 2011), cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus), cá đù đỏ (Sciaenops ocellates) (Eldar et al., 1999). Ngoài ra, bệnh xuất huyết trên cá còn do vi khuẩn S. dysgalactiae ở cá đối (Liza alata, Liza haemotocheila) (Qi et al., 2013), cá tầm (Acipencer schrenckii) (Yang và Li, 2009), cá nâu (Mugil cephalus) và cá bớp (Rachycentron canadum) (Abdelsalam et al., 2009). Tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá còn được tìm thấy do nhiều loài vi khuẩn khác như Aeromonas hydrophila gây bệnh trên cá tra (Loan và ctv., 2009), Vibrio parahaemolyticus và V. alginolyticus gây bệnh trên cá mú giống và cá mú thịt, (Somkiat Kanchanakhan, 1996; Nguyễn Thị Thanh Thùy và ctv., 2009 được trích dẫn bởi Võ Văn Nha, 2012). Do tác nhân gây bệnh đa dạng, nên việc phòng trị bệnh xuất huyết ở động vật thủy sản chỉ có hiệu quả khi tác nhân và nguyên nhân gây bệnh được xác định chính xác. Hiện nay, chưa có một nghiên cứu chính thức nào về bệnh xuất huyết ở cá bống kèo, nhằm cung cấp thông tin khuyến cáo người nuôi phòng, trị bệnh một cách hiệu quả, đề tài “Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo (Pseudapocryptes elongatus)” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu tổng quát của luận án Khảo sát và đánh giá tình hình xuất hiện bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nuôi tại tỉnh Bạc Liêu. Xác định đặc điểm bệnh học của tác nhân gây bệnh ở cá bống kèo từ đó đề xuất giải pháp phòng và trị bệnh hiệu quả. 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án Thông tin từ kết quả khảo sát hiện trạng bệnh trên cá bống kèo và qui trình phòng trị bệnh sẽ góp phần hạn chế thiệt hại trong quá trình nuôi cá 2 bống kèo mang lại hiệu quả về năng suất và kinh tế, tăng thu nhập cho người nuôi. 1.4 Những điểm mới của luận án Xác định được tác nhân gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo là vi khuẩn S. dysagalactiae và các thời điểm bệnh thường xuất hiện ở cá bống kèo nuôi trong ao. Thực hiện và chuẩn hóa qui trình phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae để ứng dụng chẩn đoán sớm, nhanh và đặc hiệu tác nhân gây bệnh xuất huyết ở cá bống kèo bằng phương pháp PCR. Đề xuất một số loại kháng sinh điều trị bệnh xuất huyết trên cá bống kèo. Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trong phần tổng quan tài liệu, luận án đã nêu và phân tích những vấn đề liên quan đến tình hình nuôi cá bống kèo cũng như tình hình nghiên cứu về một số loại vi khuẩn gây bệnh trên cá với những nội dung chính: - Tình hình nuôi cá bống kèo trên thế giới và trong nước. - Tình hình xuất hiện bệnh trên cá bống kèo. - Tổng quan bệnh xuất huyết ở cá. - Tổng quan về đặc điểm vi khuẩn gây bệnh trên cá. - Tổng quan về tình hình vi khuẩn Streptococcus gây bệnh trên cá nước lợ, mặn. - Xác định độc lực của một số chủng vi khuẩn gây bệnh xuất huyết. - Chẩn đoán bệnh xuất huyết. - Phòng và trị bệnh xuất huyết ở cá. Chương 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2011 đến tháng 12/2014 3.2 Đối tượng nghiên cứu: Cá bống kèo 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Điều tra phỏng vấn 3.3.1.1 Số liệu thứ cấp Thu thập từ báo cáo của các cơ quan chức năng tỉnh Bạc Liêu. Số liệu thứ cấp gồm: Tình hình nuôi trồng thủy sản và tình hình nuôi thương phẩm cá bống kèo trong tỉnh Bạc Liêu. 3.3.1.2 Số liệu sơ cấp Tiến hành điều tra 90 hộ nuôi cá bống kèo thương phẩm ở thành phố Bạc Liêu, huyện Hòa Bình và huyện Đông Hải tỉnh Bạc Liêu. Số liệu sơ 3 cấp gồm: Thông tin cơ bản, kinh nghiệm, kỹ thuật nuôi, thông tin về bệnh trên cá nuôi và cách phòng trị khi cá bống kèo bệnh của người nuôi. 3.3.2 Phương pháp thu mẫu cá - Mẫu cá: thu 254 con cá bống kèo còn sống trong 34 ao nuôi (11 ao cá khỏe, 23 ao cá đang có biểu hiện cá bị xuất huyết). - Điều kiện thu mẫu: thu mẫu ao cá bống kèo nuôi thương phẩm giai đoạn cá nuôi được 2 - 3 tháng tuổi, cá đạt từ 15 – 25 g/con. Thời gian thu mẫu là 7 - 8 giờ sáng. 3.3.3 Phương pháp kiểm tra ký sinh trùng Số lượng mẫu kiểm tra ký sinh trùng là 120 mẫu cá ở 12 ao gồm 04 đợt thu mẫu, mỗi đợt 03 ao, mỗi ao 10 con. Kiểm tra da, mang và ruột cá. Mức độ cảm nhiễm của ký sinh trùng được tính: Tỷ lệ cảm nhiễm = (Số mẫu nhiễm/Tổng số mẫu đã kiểm tra) x 100 Cường độ cảm nhiễm = (Số trùng/Con cá, cơ quan, lame, thị trường) 3.3.4 Phương pháp phân tích mẫu vi khuẩn 3.3.4.1 Phương pháp nhuộm Giemsa Phết mẫu thận lên lame. Mẫu được cố định qua dung dịch Methanol trong 1 phút. Phương pháp nhuộm mẫu theo Humason, 1979 trích dẫn bởi Rowley, 1990. Đọc kết quả dưới kính hiển vi ở vật kính 100X có giọt dầu. 3.3.4.2 Phương pháp phân lập và định danh vi khuẩn - Dùng dao mổ tiệt trùng rạch một đường trên thận. Đặt que cấy vào, xoay nhẹ để lấy mẫu bệnh phẩm và cấy trên đĩa agar. Ủ các đĩa môi trường này trong tủ ấm ở nhiệt độ 28°C. Sau 24 – 48 giờ, đọc kết quả. - Kiểm tra tính ròng của vi khuẩn, phản ứng oxidase, catalase, O/F, khả năng phát triển của vi khuẩn trong môi trường TSB (+ 6,5%NaCl), khả năng tan huyết của vi khuẩn. d. Phương pháp định danh vi khuẩn bằng kit API 20 Strep (Biomérieux, Pháp) Định danh ngẫu nhiên 32 chủng vi khuẩn trong bộ sưu tập vi khuẩn được thu qua 06 lần thu mẫu bằng kit API 20 Strep. 3.3.5 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp giải trình tự 3.3.5.1 Phương pháp chiết tách DNA vi khuẩn Qui trình chiết tách DNA từ vi khuẩn áp dụng theo phương pháp của Bartie et al. (2006). Vi khuẩn được nuôi tăng sinh từ 16 - 18 giờ trong 5 ml môi trường NB (+ 1,5% NaCl) ở nhiệt độ 28ºC, ly trích DNA bằng cách cho 1,5 ml dung dịch vi khuẩn vào ống ly tâm cùng với 100 µl 10 mM Tris- HCL, 1 mM EDTA, pH 8.0 (TE). Hỗn hợp được đun nóng ở 95ºC trong 15 phút, rồi được làm lạnh trong nước đá và ly tâm 2 phút ở vận tốc 14.000 vòng/phút để tách dung dịch DNA và trữ ở -20ºC cho đến khi sử dụng. 4 3.3.5.2 Phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S rRNA của vi khuẩn 10 mẫu vi khuẩn được chọn từ kết quả phân lập được định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA gồm: B1-6T; B2-5G; B2-3TT; B6-9TT; A1F1; A1F2; A1F4; A1F6; A1F9; A5F4. Sản phẩm PCR mẫu được gởi đến phòng thí nghiệm NK-Biotek và đơn vị R&D của công ty Nam Khoa giải trình tự gen 16S rRNA. Sản phẩm giải trình tự được chạy điện di giải trình tự trên máy giải trình tự ABI 3130XL 16 capillar. Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S được so chuỗi bằng chương trình Blast search trên cơ sở dữ liệu ngân hàng gen của NCBI. 3.3.6 Phương pháp mô bệnh học Số lượng mẫu phân tích mô học gồm 127 mẫu cá. Lấy mẫu mô ở mang, gan, thận của cá bệnh và cá khỏe. Mẫu được cắt với độ dày từ 5 – 7 mm, sau đó xử lý bằng máy xử lý tự động qua các giai đoạn loại nước, làm trong mẫu và tẩm paraffin. Đúc khối và cắt mẫu với độ dày 4-6 μm, nhuộm mẫu bằng dung dịch Haematocyline và Eosin (H&E). Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi, đọc kết quả dựa theo tài liệu của Ferguson (2006) (trích dẫn bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2011). 3.3.7 Phương pháp huyết học 3.3.7.1 Phương pháp phân tích mẫu máu cá Số lượng mẫu phân tích huyết học gồm 102 mẫu cá. Máu được lấy ở động mạch chủ ở đuôi cá (Houston, 1990). Phết mẫu máu. Mẫu máu sau được cố định bằng cách ngâm trong methanol 1-2 phút (Rowley, 1990). 3.3.7.2 Định lượng hồng cầu Hồng cầu được đếm qua buồng đếm hồng cầu ở vật kính 40X. Công thức tính mật độ hồng cầu: R = C x 10 x 5 x 200 Trong đó: R: mật độ hồng cầu (tb/mm3); C: tổng số hồng cầu trên 5 vùng đếm; 10: khoảng cách giữa lamelle và buồng đếm là 0,1mm; 5: diện tích của mỗi vùng đếm là 0,2 mm2; 200: độ pha loãng hồng cầu. 3.3.7.3 Định tính và định lượng bạch cầu Phương pháp nhuộm mẫu: mẫu được nhuộm theo phương pháp Wright’s & Giemsa (Humason, 1997 trích dẫn bởi Rowley, 1990). Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 100X (Supranee et al., 1991). Tổng bạch cầu (TBC)= (Bạch cầu trong 1500 tế bào x mật độ hồng cầu trên buồng đếm)/ Số hồng cầu trong 1500 tế bào trên mẫu nhuộm. Mật độ từng loại (tb/mm3) = Số lượng mỗi loại bạch cầu x mật độ TBC/200 3.3.8 Phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh xuất huyết 3.3.8.1 Phương pháp chiết tách DNA từ vi khuẩn: (giống 3.3.5.1) 5 3.2.8.2 Phương pháp chiết tách DNA từ mô thận cá Dựa trên phương pháp chiết tách Phenol chloroform của Taggart et al. (1992) (được điều chỉnh bởi Đặng Thị Hoàng Oanh và Đặng Thụy Mai Thy, 2009) để chiết tách DNA thận cá. 3.3.8.3 Phương pháp khuếch đại DNA Phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA được thực hiện dựa theo qui trình của Nunan et al. (2003). Trọng lượng phân tử đoạn DNA của S. dysgalactiae cần phát hiện là 1500 bp. Cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR khuếch đại gen 16S rRNA được thiết kế bởi Zinniel et al., (2002) mồi 1: p515FPL 5’-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA- 3’, mồi 2: p13B 5’AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3’. 3.3.8.4 Phương pháp PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae Sử dụng cặp mồi STRD-DyI/dys-16S–23S-2 cho phản ứng PCR theo Hassan et al. (2003): STRD-DyI: “5′ TGGAACACGTTAGGGTCG 3′” dys-16S–23S-2: “5′ CTTAACTAGAAAAACTCTTGATTATTC 3′” Thực hiện qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae dựa trên phương pháp của Hassan et al. (2003), đối chứng dương sử dụng trong phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae là vi khuẩn đã được giải mã định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S là có ký hiệu B2-5G. 3.3.8.5 Phương pháp điện di Sử dụng 10 l sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel 1.5% agarose (ABgene, UK) trong dung dịch đệm  1 TAE (10 mM Tris, 5 mM acetate, 0,1 mM EDTA). 3.3.8.6 Phương pháp xác định độ nhạy của phản ứng PCR phát hiện S. dysgalactiae Lấy 0,5 g mô thận cá trộn với các mật độ vi khuẩn 25 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng, 400 ng, 800 ng, 1.600 ng và 3.200 ng được dùng cho phản ứng PCR phát hiện S. dysgalactiae để xác định độ nhạy của qui trình. 3.3.8.7 Phương pháp xác định tính đặc hiệu của qui trình PCR phát hiện S. dysgalactiae Dùng cặp mồi trong phản ứng PCR phát hiện S. dysgalactiae để phát hiện 5 loại vi khuẩn khác bao gồm: Vibrio parahaemolyticus, Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophilla, Streptococcus agalactiae, Flavobacterium columnare. Đối chứng dương sử dụng là S. dysgalactiae đã được giải mã định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S có ký hiệu B2-5G. 3.3.8.8 Khả năng ứng dụng của qui trình PCR phát hiện vi khuẩn S. dysgalactiae Khả năng ứng dụng của qui trình ở nhiều dòng vi khuẩn S. dysgalactiae khác nhau và trực tiếp trên thận cá. 6 3.3.9 Phương pháp lập kháng sinh đồ Phương pháp lập kháng sinh đồ theo Geert Huy, 2002. 3.3.9.1 Phương pháp phục hồi vi khuẩn Vi khuẩn trữ ở -80oC được phục hồi trên môi trường TSA có bổ sung 1,5% NaCl và ủ sau 48 giờ ở 30oC. 3.3.9.2 Phương pháp lập kháng sinh đồ Dùng pipet hút lần lượt 0,1 ml dung dịch vi khuẩn cho lên môi trường thạch MHA (+ 1,5% NaCl) và trãi đều, dùng pen lấy đĩa kháng sinh đặt vào đĩa petri. Mỗi đĩa petri dán 4 đĩa kháng sinh. Đặt đĩa vào tủ ấm ở 30oC. Đọc kết quả sau 48 giờ. 3.3.9.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của thuốc kháng sinh lên vi khuẩn được xác định theo phương pháp của Geert Huys (2002). 3.3.10 Phương pháp bố trí thí nghiệm 3.3.10.1 Chuẩn bị bể thí nghiệm Các dụng cụ thí nghiệm như: bể nhựa 500 L, xô nhựa 60 L, ống sục khí, vợt, đá bọt... được vệ sinh kỹ bằng xà phòng và chlorine 200 ppm, phơi khô. Sau đó cấp nước vào khoảng 2/3 bể, có sục khí. Cấp nước vào 1/3 xô nhựa thí nghiệm. Nguồn nước sử dụng là nước máy có độ mặn 10‰. 3.3.10.2 Nguồn cá thí nghiệm Cá bống kèo đồng cỡ, khỏe mạnh, linh hoạt, da sáng, trọng lượng khoảng 15 - 20 g/con. Cá được nuôi dưỡng trong bể nhưạ 500 L, có sục khí khoảng 1 tuần. Kiểm tra sức khỏe của cá (chọn ngẫu nhiên 5 con) trước khi tiến hành bố trí thí nghiệm. 3.3.10.3 Chuẩn bị vi khuẩn gây cảm nhiễm Vi khuẩn trữ được phục hồi trên môi trường TSA bổ sung 1,5% NaCl (TSA+), ủ ở 28oC. Nuôi tăng sinh vi khuẩn, sau đó, vi khuẩn được ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút ở 4oC trong 5 phút. Đếm mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 610 nm. Dung dịch vi khuẩn được pha loãng 10 lần (1ml dung dịch vi khuẩn 1 x 109 CFU/ml + 9 ml nước muối sinh lý) để được các mật độ 108, 107, 106, 105, 104, 103 CFU/ml. 3.3.10.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm cảm nhiễm Thí nghiệm cảm nhiễm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức là 4 chủng vi khuẩn B1-6T, B2-3TT, B2-5G, B6-9TT với mật độ tiêm là 108 CFU/cá và tiêm nước muối sinh lý ở nghiệm thức đối chứng. Cá được tiêm 0,1 ml/cá tại gốc vi ngực. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với mật độ 10 con cá/bể. Sau khi tiêm, biểu hiện của cá được theo dõi liên tục 7 trong 7 ngày. Kết thúc thí nghiệm, ở mỗi nghiệm thức tiến hành thu mẫu mô (3 con/nghiệm thức) ở các cơ quan mang, gan và thận. 3.3.10.5 Phương pháp bố trí thí nghiệm xác định LD50 Thí nghiệm xác định LD50 được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên sử dụng 02 chủng vi khuẩn B1-6T và B2-5G. Cá thí nghiệm được tiêm 0,1 ml/cá tại gốc vi ngực. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần với mật độ 20 con cá/bể. Nghiệm thức 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7: cá được tiêm vi khuẩn với mật độ 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 CFU/cá. Nghiệm thức 8: nghiệm thức đối chứng cá tiêm nước muối sinh lý. Sau khi tiêm, biểu hiện của cá được theo dõi liên tục trong 14 ngày. Nồng độ vi khuẩn gây chết 50% cá thí nghiệm (LD50) được xác định theo công thức của Reed và Muench (1938): LD50 = 10 a – p.d Trong đó: p.d = (L% - 50%) / (L% - H%) a: Số lũy thừa mà taị đó vi khuẩn gây chết cá thấp nhất (trên 50%) H%: Tỷ lê ̣cá chết cao nhất (dưới 50%); L%: Tỷ lê ̣cá chết thấp nhất (trên 50%). 3.3.10.6 Phương pháp bố trí thí nghiệm điều trị bệnh xuất huyết ở qui mô phòng thí nghiệm - Vi khuẩn gây cảm nhiễm là B1-6T, mật độ tiêm là 104 CFU/cá. - Thuốc kháng sinh: DO và FFC sử dụng trong thí nghiệm là thuốc kháng sinh của công ty UV trong đó: DO và FFC ở dạng nguyên liệu; DO thành phẩm có tên thương mại là Rydoxyne và FFC thành phẩm có tên thương mại là UV-Flo. - Thuốc được trộn vào thức ăn cho cá ăn, hàm lượng 20 mg thuốc/kg trọng lượng cá. Cho cá ăn theo nhu cầu. - Thí nghiệm phòng trị gồm 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức bố trí 30 con, lặp lại 3 lần: Cá ở nghiệm thức 1, 2, 3, 4 được gây bệnh ngày 1 và cho ăn thức ăn trộn thuốc vào ngày 3. Cho ăn liên tục trong 5 ngày. + Nghiệm thức 1: dùng thuốc kháng sinh DO ở dạng nguyên liệu. + Nghiệm thức 2: dùng thuốc kháng sinh DO ở dạng thành phẩm. + Nghiệm thức 3: dùng thuốc kháng sinh FFC ở dạng nguyên liệu. + Nghiệm thức 4: dùng thuốc kháng sinh FFC ở dạng thành phẩm. + Nghiệm thức 5: đối chứng 1: cá được gây bệnh ngày 1 và cho ăn thức ăn không trộn thuốc. + Nghiệm thức 6: đối chứng 2: cá được tiêm muối sinh lý và cho ăn thức ăn không trộn thuốc. + Nghiệm thức 7: đối chứng 3: cá không được gây bệnh, không tiêm nước muối sinh lý, cho ăn thức ăn không trộn thuốc. 8 - Thời gian thí nghiệm là 21 ngày. Theo dõi tỷ lệ cá chết hàng ngày, ghi nhận và chụp hình dấu hiệu bệnh lý bên ngoài và bên trong. Kết thúc thí nghiệm tiến hành thu mẫu vi khuẩn, mô học (3 cá/nghiệm thức). - Hiệu quả điều trị bệnh trong phòng thí nghiệm được đánh giá bằng tỉ lệ sinh tồn tương đối (RPS) (%) theo công thức (Ellis, 1996): 4. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu luận án được tổng hợp và xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel, phần mềm thống kê SPSS version 20. Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S được so chuỗi bằng chương trình Blast search trên cơ sở dữ liệu ngân hàng gen của NCBI trực tuyến. Luận án được trình bày bằng phần mềm Microsoft Word. Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Phân lập và định danh vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá bống kèo nuôi thương phẩm 4.1.1 Điều tra tình hình nuôi và khảo sát hiện trạng bệnh trên cá 4.1.1.1 Kinh nghiệm của người nuôi cá bống kèo Các hộ nuôi được điều tra có kinh nghiệm nuôi cá bống kèo thương phẩm tập trung ở 2 năm (chiếm 23,3%) và 3, 4 năm (20%) (Bảng 4.1). Bảng 4.1 Kinh nghiệm của người nuôi cá bống kèo Kinh nghiệm nuôi (năm) Số hộ Tỷ lệ (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 21 18 18 12 11 2 8,9 23,3 20 20 13,3 12,2 2,3 4.1.1.2 Diện tích nuôi Diện tích nuôi phổ biến từ 1.000 - 5.000 m2 (chiếm 34,5%). Số hộ nuôi có diện tích lớn chiếm tỷ lệ khá cao cho thấy người nuôi có xu hướng mở rộng diện tích nuôi (Bảng 4.2). Bảng 4.2 Diện tích nuôi cá bống kèo Diện tích nuôi (m2) Số hộ Tỷ lệ (%) ≤ 5.000 ≤ 10.000 ≤ 15.000 ≤ 20.000 > 20.000 31 25 12 11 11 34,5 27,8 13,3 12,2 12,2 Giá trị RPS (%) = % cá chết ở nghiệm thức sử dụng thuốc 1- x 100 % cá chết ở nghiệm thức đối chứng dương 9 4.1.1.3 Mùa vụ nuôi và thời gian nuôi Mùa vụ nuôi cá bắt đầu từ tháng 6 kéo dài đến tháng 2, 3 năm sau. 4.1.1.4 Kỹ thuật nuôi a. Chuẩn bị và cải tạo ao Đa số hộ cải tạo ao bằng cách phơi khô ao (86,7%), còn lại cải tạo ao bằng cách để một ít nước trong ao và tiến hành bón vôi (13,3%) (Bảng 4.3). Bảng 4.3 Các bước chuẩn bị ao Các bước chuẩn bị ao Số hộ Tỷ lệ (%) Phơi ao Có 78 86,67 Không 12 23,33 Bón vôi Có 64 71,11 Không 26 28,89 Bón phân Có 7 7,78 Không 83 92,22 Diệt cá dữ Có 55 61,11 Không 35 38,89 Diệt khuẩn Có 45 50 Không 45 50 Lọc nước Có 15 16,67 Không 75 83,33 b. Nguồn giống và mật độ thả nuôi Nguồn cá bống kèo giống hiện nay phụ thuộc hoàn toàn vào nguồn cá giống tự nhiên. Mật độ thả nuôi từ 50 – 200 con/m2, đa số các hộ thả nuôi ở mật độ từ 100 - 150 con/m2 (chiếm 82,2%) (Bảng 4.4). Bảng 4.4 Mật độ thả giống Mật độ nuôi (con/m2) Số hộ Tỷ lệ (%) < 100 100 - 150 > 150 5 74 11 5,56 82,22 12,22 c. Thức ăn và cách cho ăn Tần suất cho ăn dao động từ 2 - 5 lần/ngày. Có 56,7% hộ điều tra cho cá ăn 2 lần/ngày vào lúc sáng sớm và chiều mát. Lượng thức ăn cho cá ăn phụ thuộc vào nhu cầu của cá, nên có hộ cho cá ăn liên tục trong ngày (cách khoảng 2 đến 3 giờ cho ăn một lần) (chiếm 8,89%)(Hình 4.1). Hình 4.1. Tần suất cho ăn d. Quản lý chất lượng nước trong ao nuôi cá bống kèo Tất cả (100%