Tóm tắt Luận án Xác định thành phần loài và một số đặc điểm sinh học phân tử của sán lá gan lớn ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - CÔN TRÙNG TRUNG ƢƠNG ĐỖ NGỌC ÁNH XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN LOÀI VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA SÁN LÁ GAN LỚN Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Ký sinh trùng Y học Mã số: 62 72 01 16 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÀ NỘI - 2017 Công trình hoàn thành tại HỌC VIỆN QUÂN Y Cán bộ hƣớng dẫn khoa hoc: 1. PGS.TS. Nguyễn Khắc Lực 2. PGS.TS. Trần Thanh Dƣơng Phản biện 1: PGS.TS. Lê Thanh Hòa Cơ quan: Viện CNSH, Viện Hàn lâm KHCN Việt Nam Phản biện 2: PGS.TS. Đoàn Huy Hậu Cơ quan: Học viện Quân y, Bộ Quốc phòng Luận án đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận án cấp Viện, họp tại Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng vào hồi ..giờ, ngày..thángnăm Có thể tìm thấy luận án tại: - Thƣ viện Quốc gia Việt Nam - Thƣ viện Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ƣơng 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết Bệnh do sán lá gan lớn (SLGL) ở người và động vật do Fasciola hepatica (Linnaeus, 1758) và Fasciola gigantica (Cobbold, 1885) gây ra. Đây là bệnh nhiệt đới bị lãng quên, lây truyền từ động vật sang người thông qua đường thực phẩm. Trong 25 năm qua, toàn thế giới có khoảng 17 triệu người mắc bệnh và 180 triệu người sống trong vùng nguy cơ nhiễm SLGL. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ít nhất 2,4 triệu người tại hơn 70 quốc gia bị ảnh hưởng bởi bệnh do SLGL. F. hepatica và F. gigantica có thể được phân biệt dựa vào hình thái nhưng phương pháp hình thái bộc lộ nhiều hạn chế. Dạng trung gian (Fasciola sp.) với hình thái và kiểu gen hỗn hợp của F. hepatica và F. gigantica, xuất hiện ở nhiều nơi trên thế giới bao gồm Việt Nam, rất khó xác định loài bằng hình thái. Vì vậy, ở những nơi tồn tại dạng trung gian, trong giám định loài SLGL, bên cạnh phương pháp hình thái học, ứng dụng sinh học phân tử là rất cần thiết. Hiện nay, dữ liệu hình thái và phân tử của SLGL ở Việt Nam còn rất hạn chế. Vì vậy, nghiên cứu về hình thái và phân tử của SLGL là rất cần thiết. Đó là lý do chúng tôi tiến hành đề tài “ t v t s s t s t t . 2. Mục tiêu nghiên cứu 1. Xác định một số chỉ số hình thái và phân loại sán lá gan lớn tại Việt Nam bằng phương pháp hình thái học. 2. Xác định thành phần loài và phân tích một số đặc điểm phân tử của sán lá gan lớn ở Việt Nam. 3. Tính khoa học, tính mới và tính thực tiễn của đề tài - Bằng việc kết hợp hình thái học và sinh học phân tử với cả gen nhân và gen ty thể để nhận dạng, xác định loài SLGL thập tại các vùng địa lý khác nhau ở Việt Nam nên các kết quả giám định loài khách quan, chính xác, tin cậy. - Đề tài đã chỉ ra được SLGL ở Việt Nam có tính đa hình về hình thái và di truyền với F. gigantica và dạng trung gian Fasciola sp. cùng tồn tại ở cả 3 khu vực địa lý và các vật chủ khác nhau. - Bước đầu chỉ ra được tần suất của F. gigantica và dạng trung gian Fasciola sp. ở Việt Nam mà trước đó chưa nghiên cứu nào công bố. - Cung cấp dữ liệu ban đầu, làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo tìm hiểu những khác biệt về bệnh học, đáp ứng miễn dịch ở vật chủ nhiễm F. gigantica và dạng trung gian Fasciola sp. 4. Bố cục luận án Luận án gồm 151 trang, gồm: Đặt vấn đề (2 trang); Tổng quan tài liệu (36 trang); Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (29 trang); Kết quả nghiên cứu (43 trang); Bàn luận (36 trang); Kết luận (2 trang); Kiến nghị (1 trang); 40 bảng số liệu, 29 hình và 146 tài liệu tham khảo. 2 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Sán lá gan lớn Fasciola spp. và bệnh do sán lá gan lớn (Fasciolosis) 1.1.1. Đặc điểm sinh học của Fasciola spp. - Các loài sán lá gan lớn và phân bố của chúng Sán lá gan lớn (SLGL) thuộc ngành giun dẹt, lớp sán lá, giống Fasciola. Hiện tại, giống Fasciola gồm có 4 loài: F. hepatica (Linnaeus, 1758), F. gigantica (Cobbold, 1855), F. nyanzae (Leiper, 1910) và F. jacksoni (Cobbold, 1869). Trong đó, F. hepatica và F. gigantica là 2 loài gây bệnh chủ yếu ở người và động vật. F. hepatica phân bố rộng rãi trên khắp thế giới, trong khi F. gigantica phân bố chủ yếu ở khu vực có khí hậu nhiệt đới như Châu Á, Châu Phi. - Đặc điểm hình thái của sán lá gan lớn Hì t sán trườ t : F. hepatica trưởng thành có kích thước 8 - 15 x 20 – 30 mm. F. gigantica khá giống F. hepatica, tuy nhiên chiều dài có thể tới 75 mm. F. gigantica thường thon và dài, trong khi F. hepatica thường ngắn và rộng. Hì t trứ : Trứng F. hepatica rất giống với trứng của F. gigantica. Trứng F. hepatica (150 x 90 μm) nhỏ hơn trứng của F. gigantica (200 x 100 μm). - Vòng đời sinh học: Vòng đời của SLGL rất đặc biệt trong lớp sán lá. Chúng chỉ có 1 vật chủ phụ là ốc, sau đó hình thành nang ở thực vật thủy sinh trước khi nhiễm vào vật chủ theo con đường ăn uống. Trong khi đó, hầu hết các loại sán lá khác vòng đời qua 2 vật chủ phụ trước khi xâm nhập vào vật chủ chính. Hình 1.2. Vòng đời sinh học của sán lá gan lớn - Các yếu tố ảnh hƣởng tới vòng đời của sán lá gan lớn Sự phát triển các giai đoạn vòng đời của SLGL phù thuộc rất nhiều vào các điều kiện môi trường và vật chủ trung gian. Trung gian truyền bệnh SLGL là các loài ốc thuộc họ Lymnaeidae. Sự phân bố của các loài ốc là vật chủ trung gian hoàn toàn phù hợp với sự phân bố của SLGL. Ở Việt Nam, 2 loài ốc nước ngọt Lymaea viridis và Lymaea swinhoei được xác định là vật chủ trung gian chủ yếu của SLGL. 3 - Quá trình sinh sản, vấn đề lai và chuyển gen ở sán lá gan lớn Theo K. Cwilinski và CS (2016), SLGL 3 hình thức sinh sản: tự giao phối, giao phối chéo và sinh sản vô tính. Các hình thức sinh sản này gặp cả ở trong tự nhiên và trên thực nghiệm. Ở một số quốc gia như Nhật Bản, Việt Nam và Hàn Quốc, dạng trung gian Fasciola sp. với các các thể mang kiểu gen pha trộn của 2 loài hoặc các cá thể lai với gen nhân của loài này còn gen ty thể của loài kia đã được xác định (còn gọi là các cá thể chuyển gen). Dạng trung gian cũng được ghi nhận gây bệnh ở cả người và động vật. 1.1.2. Triệu chứng, chẩn đoán bệnh do Fasciola spp. - Triệu chứng lâm sàng: Các triệu chứng của bệnh do SLGL ở người thường xuất hiện sau khi bị nhiễm ấu trùng 2 tuần và phụ thuộc vào số lượng sán ký sinh. Bệnh được chia làm 4 thời kỳ: ủ bệnh, toàn phát, tiềm tàng và mạn tính. Thời kỳ toàn phát với những biểu hiện rõ ràng nên bệnh nhân thường đi khám và được phát hiện bệnh. Thời kỳ này kéo dài 2 - 4 tháng với các triệu chứng cơ năng thường gặp là: sốt, đau bụng vùng hạ sườn phải, rối loạn tiêu hóa, nổi mề đay, gan lách to - Đặc điểm cận lâm sàng: Các xét nghiệm có giá trị chẩn đoán là: tăng bách cầu ái toan trên 5 %, có khi lên đến 83 %; Siêu âm gan thấy tổn thương hình tổ ong. Xét nghiệm ELISA máu dương tính với kháng thể kháng sán lá gan; Tìm trứng có giá trị chẩn đoán quyết định nhưng tỷ lệ dương tính rất thấp (< 5 %). 1.2. Tỷ lệ nhiễm SLGL ở ngƣời và động vật - Trên thế giới: Nhiễm SLGL ở động vật ăn cỏ rất phổ biến trên toàn thế giới, tỷ lệ nhiễm trung bình từ 30 % đến 50 %. Ở người, theo Mas-Coma S. và CS (2004), trên toàn thế giới có khoảng 2,4 đến 17 triệu người có nguy cơ nhiễm SLGL, tập trung chủ yếu ở Châu Á và Châu Phi. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO), ít nhất 2,4 triệu người tại hơn 70 quốc gia bị ảnh hưởng bởi bệnh do SLGL. - Ở Việt Nam: Theo một số nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu, bò dao động trong khoảng từ 30 đến 60%. Tỷ lệ nhiễm SLGL ở trâu thường cao hơn ở bò và mùa mưa tỷ lệ nhiễm thường cao hơn mùa khô. Ở người, theo Đặng Thị Cẩm Thạch (2008), tính đến tháng 3 năm 2008 số bệnh nhân nhiễm SLGL là > 5.000 người. Còn theo Nguyễn Văn Đề và CS (2012), tính đến năm 2012, bệnh SLGL ở Việt Nam lưu hành ở ít nhất 52 tỉnh/thành với số người mắc > 20.000 người. 1.3. Các phƣơng pháp xác định loài Fasciola spp. 1.3.1. Các phƣơng pháp xác định loài Fasciola sp. 2 phương pháp xác định loài chủ yếu được sử dụng là hình thái học và sinh học phân tử dựa trên các chỉ thị phân tử gen ty thể và gen nhân tế bào. * Phƣơng pháp hình thái học Theo Periago và CS (2008), dựa vào tỷ số chiều dài/chiều rộng (BL/BW), SLGL được phân loại thành: nhóm giống với F. hepatica (1,65 - 2,76), nhóm giống F. gigantica (3,43 - 5,50) và nhóm Fasciola sp. (2,77 - 3,42). Theo Srimuzipo P. và CS (2000), dựa vào chiều dài SLGL được chia làm 3 nhóm: nhóm nhỏ ( 35 mm). 4 * Phƣơng pháp sinh học phân tử RFLP-PCR và giải trình tự là các công cụ thường được lựa chọn. Các chỉ thị cox1, nad1 thuộc hệ gen ty thể, các vùng giao gen ITS1, ITS2 và 28S thuộc hệ gen nhân thường được sử dụng. Simsek và CS (2011) đã sử dụng gen cox1 và các enzyme RsaI và AluI để phân biệt F. gigantica và F. hepatica. Ichikawa M và CS (2010) sử dụng vùng gen chứa đoạn giao gen ITS1 và enzyme RsaI để phân biệt F. hepatica, F. gigantica và dạng trung gian. Dạng trung gian được xác định có nhiều bất thường cả về hình thái và phân tử theo hướng phù hợp với cả 2 loài nên khó có thể xếp loại là F. hepatica hay F. gigantica. Vì thế, Mas-Coma và CS (2009) cho rằng, nếu chỉ dựa vào một trong 2 hệ gen nhân hoặc hệ gen ty thể để giám định loài SLGL sẽ không chính xác mà cần kết hợp cả 2 hệ gen. 1.3.2. Tính đa hình di truyền di truyền ở sán lá gan lớn - Tính đa hình của một số gen thuộc hệ gen ty thể: Tính đến hết năm 2016, đã có 5 hệ gen ty thể hoàn thiện của SLGL được giải mã và công bố trên ngân hàng gen. Chiều dài toàn bộ hệ gen ty thể của Fasciola sp. là 14453 bp, F. hepatica 14462 bp và F. gigantica 14478 bp, bao gồm 12 gen, 2 vùng mã hóa rRNA, 22 vùng mã hóa tRNA, một vùng không mã hóa và một số tiểu phần khác. - Tính đa hình của một số gen thuộc hệ gen nhân tế bào: Các vùng giao gen ITS-1 (khoảng 430 bp) và ITS2 (khoảng 360 bp) là những chỉ thị phân tử quan trọng để xác định loài SLGL. Trên đoạn ITS-2, F. hepatica và F. gigantica có 6 vị trí khác biệt và một trong số đó bị khuyết ở F. gigantica. Trên đoạn ITS-1, F. gigantica có 5 vị trí khác biệt so với F. hepatica. Dạng trung gian của SLGL có trình tự ITS-1, ITS-2 giao thoa, pha trộn của cả F. hepatica và F. gigantica. 1.3.3. Tình hình nghiên cứu xác định loài sán lá gan lớn ở Việt Nam Trước đây, bằng phương pháp giám định hình thái học, một số tác giả cho rằng F. hepatica và F. gigantica đều có mặt ở Viêt Nam. Tuy nhiên, với sự hỗ trợ của sinh học phân tử hầu hết các nghiên cứu sau này cho rằng SLGL ở Việt Nam là F. gigantica và dạng trung gian. Các nghiên cứu sinh học phân tử chủ yếu lựa chọn gen nad1 hoặc cox1 thuộc hệ gen ty thể và ITS1, ITS2 thuộc hệ gen nhân. Do ở Việt Nam tồn tại các cá thể dạng trung gian (bao gồm các cá thể lai) nên một số nghiên cứu chỉ sử dụng đơn thuần hệ gen ty thể hoặc hệ gen nhân có thể đã kết luận chưa thực sự đầy đủ, cụ thể về thành phần loài của SLGL. Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu - Nghiên cứu hình thái: 316 cá thể SLGL trưởng thành thu từ trâu, bò, dê, cừu và 01 cá thể SLGL thu từ người. - Nghiên cứu xác định loài và phân tích đặc điểm phân tử: gen cox1, nad1 thuộc hệ gen ty thể và các vùng giao gen ITS-1, ITS-2 thuộc hệ gen nhân. 5 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu * Địa điểm thu thập mẫu: Miền Bắc (4 tỉnh): Hà Nội, Vĩnh Phúc, Bắc Giang, Điện Biên; Miền Trung-Tây Nguyên (gọi tắt là Miền Trung, 6 tỉnh): Nghệ An, Quảng Nam, ĐắkLắk, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận; Miền Nam (4 tỉnh): Tây Ninh, Bình Phước, Đồng Tháp, Cần Thơ; * Địa điểm phân tích hình thái và phân tử: Học viện Quân y, Hà Nội; 2.1.3. Thời gian nghiên cứu: từ tháng 9/2013 đến 1/2017 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả có phân tích dựa trên kết quả các đặc điểm hình thái và phân tử của SLGL. 2.2.2. Cỡ mẫu nghiên cứu 2.2.2.1. Cỡ mẫu xác định các chỉ số hình thái - Cỡ mẫu xác định các chỉ số hình thái được tính theo công thức 2 2. 1 /2 2( ) Z SD n    , tham khảo giá trị tỷ số chiều dài/chiều rộng trong nghiên cứu của Wannasan A và CS (2014) ở quần thể SLGL tại Thái Lan tính được n = 211. Thực tế, tổng số 317 cá thể SLGL toàn vẹn được đo đạc các chỉ số hình thái. - Chọn mẫu và thu thập mẫu SLGL: mỗi cá thể vật chủ trâu, bò, dê, cừu thu thập ngẫu nhiên từ 2 đến 20 con SLGL. Các mẫu sán được thu thập là các cá thể sán có hình thái toàn vẹn. Trong đó, Miền Bắc 121 cá thể, Miền Trung 137 cá thể và Miền Nam 59 cá thể; 126 cá thể sán thu từ 15 cá thể bò, 178 sán từ 16 cá thể trâu, 6 sán từ 2 cá thể dê, 6 sán từ 2 cá thể cừu và 1 cá thể sán thu từ người. - Ghi nhãn mẫu SLGL: mẫu sán được dán nhãn và ký hiệu với 4 thông tin: năm thu thập, vật chủ, địa điểm thu thập và thứ tự mẫu ở địa điểm đó. Ví dụ: mẫu 15Tr-HN1, thu thập năm 2015 từ trâu (Tr = trâu; B = Bò; C = cừu; D = Dê) tại Hà Nội. Đây là cá thể SLGL đầu tiên được ghi mẫu năm 2015 tại Hà Nội. 2.2.2.2. Cỡ mẫu giám định loài và phân tích đặc điểm sinh học phân tử - Cỡ mẫu giám định loài + Số lượng SLGL: 224 cá thể sán ở động vật và 01 ở người. SLGL ở động vật được lựa chọn sao cho thuộc cả 3 khu vực địa lý và ở các vật chủ khác nhau. + Chọn mẫu giám định loài bằng sinh học phân tử: Mỗi cá thể vật chủ tiến hành giám định loài không quá 10 con sán. Số lượng sán ở mỗi loại vật chủ như sau: bò 106 cá thể, trâu 108 cá thể sán, dê 6 cá thể, cừu 4 cá thể và người 1 cá thể. - Cỡ mẫu xác định các đặc điểm phân tử: 17 trình tự gen cox1, 8 trình tự gen nad1, 16 trình tự ITS1 và 16 trình tự ITS2. Cụ thể trong Bảng 2.1: Bảng 2.1. Danh sách các mẫu và gen đích giải trình tự TT Ký hiệu Năm thu thập Nơi thu thập Vật chủ Gen đƣợc giải trình tự cox1 nad1 ITS1 ITS2 1 15Tr-HN1 2015 Hà Nội Trâu X X X X 2 15Tr-VP1 2015 Vĩnh Phúc Trâu X X X X 3 SLGL-N 2010 Hà Nội Ngƣời X X X X 6 4 10B-HN1.8 2010 Hà Nội Bò X X X X 5 10B-HN1.9 2010 Hà Nội Bò X X X X 6 15Tr-NA5 2015 Nghệ An Trâu X X X X 7 10B-NA1.2 2010 Nghệ An Bò X X X 8 09B-QN1.1 2009 Quảng Nam Bò X X X 9 15Tr-KH1 2015 Khánh Hòa Trâu X 10 16D-NT1 2016 Ninh Thuận Dê X X X X 11 16D-NT2 2016 Ninh Thuận Dê X X X 12 16C-NT1 2016 Ninh Thuận Cừu X X X X 13 16C-NT2 2016 Ninh Thuận Cừu X X X 14 09B-TN1.1 2009 Tây Ninh Bò X X X 15 14B-CT2 2014 Cần Thơ Bò X X X 16 15Tr-ĐT1 2015 Đồng Tháp Trâu X X X 17 15Tr-ĐT2 2015 Đồng Tháp Trâu X X X 2.2.3. Các phƣơng pháp và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu hình thái - Các chỉ số/chỉ tiêu hình thái được khảo sát, xác định: chiều dài cơ thể (BL), chiều rộng cơ thể (BW), tỷ số chiều dài/chiều rộng (BL/BW), khoảng cách từ giác bụng tới cuối thân (VS-P) - Vật liệu, hóa chất, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu: Vật liệu bảo quản và làm tiêu bản sán, vật liệu đo đạc kích thước sán. - Các phương pháp và kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu: Kỹ thuật làm tiêu bản sán lá gan lớn bằng thuốc nhuộm Carmin; Xác định các chỉ số hình thái theo phương pháp của Periago và CS (2006, 2008). - Phân nhóm sán lá gan lớn theo hình thái: theo Srimuzipo và CS (2000) dựa vào chiều dài và theo Periago và CS (2008) dựa vào tỷ số chiều dài/chiều rộng. 2.2.4. Các phƣơng pháp và kỹ thuật sử dụng trong giám định loài, phân tích các đặc điểm phân tử 2.2.4.1. Các chỉ số/chỉ tiêu nghiên cứu về sinh học phân tử: kích thước sản phẩm PCR; số lượng, kích thước các mảnh cắt giới hạn; tỷ lệ tương đồng nucleotide; số nucleotide (nu), acid amin (aa) sai khác; tỷ lệ các nucleotide A, T, G, C... 2.2.4.2. Hóa chất, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu - Hóa chất, sinh phẩm Bảng 2.2. Các mồi và kích thƣớc sản phẩm PCR tƣơng ứng Gen đích Tên mồi Trình tự Sản phẩm Nguồn Cox1 JB3 5’-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3’ 450bp Bowles và CS, 1992 JB4.5 5’-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3’ Nad1 Ita10 5′-AAGGATGTTGCTTTGTCGTGG-3′ 630bp Itagaki và CS, 2005 Ita2 5′-GGAGTACGGTTACATTCACA-3′ ITS1 ITS1-F 5′-TTGCGCTGATTACGTCCCTG-3’ 680bp Itagaki và CS, 2005 ITS1-R 5′-TTGGCTGCGCTCTTCATCGAC-3′ ITS2 ITS2-F 5’-TGTGTCGATGAAGAGCGCAG-3’ 550bp Itagaki và CS, 2005 ITS2-R 5’-TGGTTAGTTTCTTTTCCTCCGC-3’ 7 Các sinh phẩm chạy PCR; Các enzyme RsaI, AluI, MspI, KpnI (Thermo, Mỹ); Các hóa chất chạy điện di và tách chiết ADN. - Các thiết bị chủ yếu đƣợc sử dụng trong nghiên cứu gồm: buồng mix PCR, máy PCR, máy ly tâm lạnh, máy vortex, máy điện di, máy chụp gel 2.2.4.3. Các phương pháp, kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu - Kỹ thuật tách chiết và kiểm tra nồng độ ADN tổng số từ SLGL trưởng thành. - Khuyếch đại gen của SLGL bằng phản ứng PCR: Phản ứng PCR với tổng thể tích 50 µl được thực hiện với chu trình nhiệt: 1 chu kỳ 94 oC/10 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ [94 oC/30 giây, 53oC với gen cox1, 55 oC/45 giây với các gen khác, 72 o C trong 40 giây], sau đó là 1 chu kỳ 72 oC/10 phút và cuối cùng 1 chu kỳ 4 oC. - Cắt giới hạn sản phẩm PCR (RFLP): Tổng thể tích cắt giới hạn là 16 μl, gồm: 5 μl sản phẩm PCR, 1 μl enzyme giới hạn, 1 μl đệm 10X, 9 μl H2O. Hỗn dịch được ủ ở 37 oC có lắc trong 2 - 12 giờ rồi ghi hình trên máy UVP (Canada). - Điện di sản phẩm PCR và sản phẩm cắt giới hạn trên gel Agarose - Đọc và phân tích trình tự bằng máy ABI 3130xl Gentic Analyzer. 2.2.4.4. Phân loại sán lá gan lớn bằng kỹ thuật PCR-RFLP - Phân loại SLGL theo Simsek S. và CS (2011) dựa vào kết quả PCR-RFLP với cặp mồi JB3, JB4.5 và các enzyme RsaI, AluI như dưới đây. Bảng 2.3. Kích thƣớc sản phẩm PCR với mồi JB3, JB4.5 và kích thƣớc các mảnh cắt giới hạn với các enzyme RsaI, AluI Loài sán Sản phẩm PCR với mồi JB3, JB4.5 (bp) Sản phẩm cắt giới hạn với RsaI (bp) Sản phẩm cắt giới hạn với AluI (bp) F. hepatica 450 450 340, 110 F. gigantica 450 180, 270 450 - Phân loại SLGL theo Ichikawa M. và CS (2010) dựa vào kết quả PCR-RFLP với cặp mồi ITS1-F, ITS1-R và enzyme RsaI như dưới đây. Bảng 2.4. Kích thƣớc sản phẩm PCR với mồi ITS1-F, ITS1-R và kích thƣớc các mảnh cắt giới hạn với các enzyme RsaI Loài sán Sản phẩm PCR với mồi ITS1-F, ITS1-R (bp) Sản phẩm cắt giới hạn với RsaI (bp) F. hepatica 680 360, 100, 60 Fasciola sp. 680 360, 170, 100, 60 F. gigantica 680 360, 170, 60 - Cá thể được xác định là F. hepatica hoặc F. gigantica nếu cả chỉ thị phân tử hệ gen ty thể và hệ gen nhân của cá thể đó đều thuộc 1 loài. - Cá thể dạng trung gian được phân loại làm 2 nhóm theo K. Cwiklinski và CS (2016), bao gồm: Nhóm các các thể có kiểu gen hỗn hợp (hệ gen nhân có dạng tổ hợp của 2 loài F. hepatica và F. gigantica) và nhóm các cá thể lai (cá thể có hệ gen nhân thuộc loài này còn hệ gen ty thể thuộc loài kia). 2.2.4.5. Xác định đặc điểm phân tử của sán lá gan lớn dựa vào sự đa hình của kiểu gen đơn bội (haplotype): Kiểu gen đơn bôi của các gen nghiên cứu được xác định dựa vào so sánh với các trình tự tham chiếu trên ngân hàng gen. 8 2.3. Đạo đức và y đức trong nghiên cứu: Các vấn đề nghiên cứu được Hội đồng khoa học và Hội đồng y đức của Viện SR - KST - CT Trung ương thông qua và cho phép tiến hành. Nghiên cứu bảo đảm vấn đề đạo đức và y đức trong nghiên cứu y sinh học, tuân thủ các nguyên tắc bảo mật thông tin của đối tượng nghiên cứu. Các số liệu, dữ liệu nghiên cứu đảm bảo đầy đủ, khách quan, trung thực. 2.4. Xử lý và phân tích kết quả nghiên cứu 2.4.1. Xử lý số liệu hình thái: Số liệu hình thái được đo đạc, tính toán và phân loại dựa vào kích thước chiều dài theo Srimuzipo và CS (2000) và tỷ số chiều dài/chiều rộng theo Periago và CS (2008). 2.4.2. Xử lý số liệu về sinh học phân tử: Trình tự các mẫu được so sánh và phân tích trên ngân hàng gene, cây phả hệ và phân tích trình tự trên các phần mềm Maga 6, mức độ tương đồng và thành phần các nu A, C, G, T trên đoạn gen được tính toán bằng công cụ nucleotide composition của phần mềm Bioedit. Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Xác định một số chỉ số hình thái và phân loại SLGL vào hình thái học 3.1.1. Xác định một số chỉ số hình thái của sán lá gan lớn 3.1.1.1. Kết quả x t s ỉ s ì t s - Đối với sán lá gan lớn thu thập từ động