Tóm tắt Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của bệnh care trên chó, đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của virus care phân lập được tại một số tỉnh phía bắc Việt Nam

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM TRẦN VĂN NÊN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA BỆNH CARE TRÊN CHÓ, ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA VIRUS CARE PHÂN LẬP ĐƢỢC TẠI MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC VIỆT NAM Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 62.64.01.02 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Hà Nội - Năm 2017 Công trình được hoàn thành tại: HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. NGUYỄN THỊ LAN 2. PGS. TS. NGUYỄN VĂN THANH Phản biện 1: PGS TS. PHẠM VĂN HOẠT BỘ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Phản biện 2: PGS.TS. TÔ LONG THÀNH TRUNG TÂM CHUẨN ĐOÁN THÚ Y TRUNG ƢƠNG Phản biện 3: TS. ĐẶNG THANH SƠN VIỆN THÚ Y Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại Học viện Nông nghiệp Việt Nam vào hồi giờ ngày tháng năm 2017 Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Lương Định Của - Học viện Nông nghiệp Việt Nam 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Bệnh Care hay bệnh sài sốt ở chó là một bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm thường xảy ra ở chó con, lây lan nhanh và tỷ lệ chết rất cao. Bệnh Care được biết tới là căn bệnh nguy hiểm nhất trên chó trong nửa đầu thế kỷ 19. Bệnh Care được báo cáo lần đầu tiên ở châu Âu vào năm 1760 (Appel and Gillespie, 1972). Các triệu chứng lâm sàng và tiến triển của bệnh đã được mô tả lần đầu tiên vào năm 1809 bởi EdwardJenner (Appel and Gillespie, 1972); (Shell, 1990) và virus Care đã được phân lập vào năm 1905. Bệnh Care xảy ra rộng rãi trên toàn thế giới, xảy ra ở một số nước như Mỹ, Argentina, Brazil, Mexico, Nam Phi và nhiều nước ở châu Âu, gần đây nhất là ở các nước châu Á như Nhật Bản (Lan et al., 2006a), Thái Lan (Keawcharoen et al., 2005), Hàn Quốc (An et al., 2008) và Ấn Độ (Latha et al., 2007). Nguyên nhân gây bệnh Care trên chó là do virus Care (Canine distemper virus - CDV). CDV là một thành viên của giống Morbillivirus, thuộc họ Paramixoviridae. Các thành viên khác của giống Morbillivirus như virus gây bệnh sởi trên người (Measles virus - MV), virus dịch tả trâu bò (Rinderpest virus - RPV), virus gây bệnh trên động vật nhai lại nhỏ (Peste des petits ruminants virus - PPRV), virus gây bệnh trên động vật có vú dưới nước (cá heo, hải cẩu) (Murphy et al., 1999). Virus Care cũng gây bệnh trên động vật hoang dã ăn thịt và hổ (Appel et al., 1994); (Frölich et al., 2000); (Martella et al., 2002). Virus Care có cấu tạo gồm một sợi RNA đơn không phân đoạn gồm khoảng 15.690 nucleotide. Trong cấu trúc bộ gene gồm 6 gene mã hóa cho các protein như protein tạo lớp vỏ bọc (M), hai glycoprotein (yếu tố kết dính (H), yếu tố kết hợp virus với thụ thể trên màng tế bào (F)), hai protein có liên quan tới sự sao chép RNA (phosphoprotein – P và large protein – L) và nucleocapsid N đóng gói RNA của virus (Sidhu et al., 1993). Dựa trên trình tự của protein Haemagglutinin (H), Harder and Osterhaus, (1997) và Martella et al., (2006) đã phân loại virus Care thành 7 nhóm chính theo ví trí địa lý gồm: Arctic – like, America 1, America 2, Asia 1, Asia 2, Europe, Europe-wildlife. CDV là virus gây nhiễm hướng lympho, niêm mạc và mô thần kinh. Trước đây, các nhà nghiên cứu đã tiến hành phân lập CDV trên các môi trường như dòng tế bào biểu mô và nguyên bào sợi, tế bào lympho của chó (Appel et al., 1992), đại thực bào phế nang của chó (Appel, 1978), đại thực bào màng bụng chồn sương (Poste, 1971), xơ phôi gà (Ezeibe, 2005). Tuy nhiên việc phân lập và xác định hiệu giá virus Care rất khó khăn do không có dòng tế bào nào thích hợp để virus sinh trưởng và gây bệnh tích tế bào. Qua nghiên cứu của Seki et al. (2003) và Lan et al. (2005a) đã chỉ ra Vero-DST là dòng tế bào thích hợp, có thể sử dụng để phân lập và xác định hiệu giá virus. Ở Việt Nam, bệnh Care được phát hiện từ năm 1920. Chó phát bệnh thường chết với tỷ lệ chết 50-80%, có thể lên đến 100% nếu không được điều 2 trị kịp thời (Hồ Đình Chúc, 1993). Cho đến nay, bệnh Care xảy ra ở hầu hết các tỉnh và gây thiệt hại lớn cho đàn chó nuôi trong nước do tỷ lệ tử vong của bệnh rất cao (Lê Thị Tài, 2006). Nhưng các nghiên cứu về bệnh lý, đặc tính sinh học và di truyền của virus Care ở trong nước còn rất khiêm tốn, bên cạnh đó hiệu quả bảo hộ của các vacxin phòng bệnh Care đang lưu hành hiện nay chưa cao cũng như chưa có nhiều báo cáo cụ thể. Xuất phát từ thực tiễn đó, trong đề tài này chúng tôi tiến hành nghiên cứu về đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc Care, đồng thời nghiên cứu về đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập tại Việt Nam. Kết quả nghiên cứu có ý nghĩa rất quan trọng giúp các bác sỹ thú y cơ sở tại các phòng mạch hay cơ quan nghiên cứu trong việc chẩn đoán bệnh dựa vào đặc điểm bệnh lý đặc trưng của bệnh và lựa chọn được nguồn mẫu bệnh phẩm phục vụ cho việc chọn chủng virus chế vacxin phòng bệnh hiệu quả, chế tạo kit chẩn đoán, chế tạo kháng nguyên dùng trong chẩn đoán góp phần giảm thiểu thiệt hại kinh tế do bệnh Care gây ra cho đàn chó nuôi ở trong nước. 1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI Xác định được một số đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care cũng như đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus Care phân lập được tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc chẩn đoán phát hiện bệnh dựa vào triệu chứng lâm sàng. Bên cạnh đó, thông tin về các đặc tính sinh học và sinh học phân tử của các virus Care giúp cho việc sàng lọc và lựa chọn được chủng virus có tiềm năng trong sản xuất vacxin và các chế phẩm sinh học phục vụ công tác chẩn đoán, phòng và điều trị bệnh Care. 1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU - Đối tượng nghiên cứu là chó mắc bệnh Care, mẫu virus Care phân lập được từ các chó mắc bệnh Care - Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2014 tới tháng 12/2016 - Địa điểm nghiên cứu: + Bệnh viện thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam + Bộ môn bệnh lý thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam + Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y, Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đây là công trình nghiên cứu hoàn chỉnh và có hệ thống về đặc điểm bệnh lý bệnh Care ở chó và đặc điểm sinh học và sinh học phân tử của 5 chủng virus phân lập được từ 6 giống chó (3-6 tháng tuổi) mắc bệnh Care thu thập từ 5 tỉnh phía Bắc Việt Nam: Hà Nội, Hưng Yên, Thái Bình, Bắc Giang, Nam Định. 1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo dùng trong giảng dạy và nghiên cứu về bệnh Care ở chó trong các trường, viện nghiên cứu chuyên ngành thú y. Đây cũng là tư liệu khoa học quý báu và cần thiết cho những người làm công 3 tác thú y cơ sở về bệnh Care. Đồng thời, thông tin chi tiết của các chủng giống virus Care phân lập được có ý nghĩa trong việc xây dựng ngân hàng hồ sơ chủng giống gốc, phục vụ cho các bước đăng ký chủng giống với ngân hàng bảo tồn nguồn gene quốc gia. 1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn Đề tài đã thu thập, sàng lọc và đánh giá các đặc tính sinh học và sinh học phân tử của 5 chủng virus Care đang gây bệnh tại một số tỉnh phía Bắc Việt Nam. 5 chủng virus phân lập được có tiềm năng cho chọn giống để sản xuất vacxin hoặc chế tạo kit, làm kháng nguyên cho chẩn đoán hoặc làm giống để công cường độc đánh giá hiệu quả bảo hộ và kiểm nghiệm vacxin. Kết quả nghiên cứu tạo tiền đề giúp thúc đẩy các nghiên cứu phát triển sản xuất vacxin trong nước từ chính các chủng virus đang lưu hành tại thực địa, từ đó nâng cao hiệu quả phòng bệnh. PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH CARE TRONG VÀ NGOÀI NƢỚC 2.1.1. Tình hình nghiên cứu ở trong nƣớc Nghiên cứu về đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care được thực hiện bởi các tác giả như: Hồ Đình Chúc (1993); Lê Thị Tài (2006); Tô Du và Xuân Giao (2006); Lan et al., (2008); Nguyễn Thị Lan và Khao Keonam (2012); Nguyễn Thị Lan và cs., (2015). Nghiên cứu về đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus Care được thực hiện bởi các tác giả như: Nguyễn Thị Lan và cs. (2012); Lan et al., (2008); Lan et al., (2009a). 2.1.2. Tình hình nghiên cứu ở ngoài nƣớc Nghiên cứu về đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care được thực hiện bởi các tác giả như: Appel (1969), McCullough et al., (1974); Miry et al. (1983); (Shell, 1990); Summers and Appel, (1994); Maeda et al., (1994); (Bittegeko et al., 1994); (Baumgärtner et al., 1995); Appel and Summers, (1995); Grone et al., (2003); Amude et al., (2006); Amude et al., (2007); Kubo et al. (2007); Del Puerto et al. (2010). Nghiên cứu về đặc tính sinh học và sinh học phân tử của virus Care được thực hiện bởi các tác giả như: Appel et al., (1992); Appel, (1978); Poste, (1971); Carpenter et al., (1992); Haas et al., (1997); Harder and Osterhaus, (1997); Iwatsuki et al., (1997); Mochizuki et al., (1999); von Messling et al., (2001); Seki et al., (2003); Hirama et al., (2004); Ezeibe, (2005); Martella et al., (2006); Lan et al., (2005a; 2005b; 2005c; 2006a; 2006b; 2007; 2008; 2009a; 2009b); Tan et al., (2011); Guo et al., (2013). 4 2.2. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ VIRUS CARE 2.2.1. Phân loại virus gây bệnh Care Canine Distemper Virus (CDV) là một thành viên của giống Morbillivirus, thuộc họ Paramixoviridae. 2.2.2. Hình thái của virus Care Hình thái virus quan sát được thấy dưới kính hiển vi điện tử có hình vòng tròn, hình bán nguyệt do các sợi cuộn quanh tròn mà thành. Dạng tròn này có đường kính đo được 115nm đến 230nm. Màng cuộn kép có độ dày 75 đến 85Ao với bề mặt phủ các sợi xoắn ốc từ bên trong ra (Kennedy et al., 1989). 2.2.3. Cấu trúc của virus Care Virus Care không phân đoạn, sợi âm tính, sợi đơn, với bộ gene RNA ước chừng khoảng 15,7 Kb và có vỏ bọc với đường kính có kích thước từ 150 tới 300 nm (Murphy et al., 1999). 2.2.4. Sức đề kháng của virus Care Virus Care là một virus không ổn định và nhạy cảm với nhiệt độ, tia UV, dung môi hòa tan lipid, chất tẩy rửa và chất ôxy hóa (Gröne et al., 1998) mặc dù nó có vỏ bọc protein chống lại sự vô hoạt của các tác nhân bên ngoài. 2.2.5. Cơ chế sinh bệnh Virus gây bệnh Care là virus gây nhiễm hướng mô lympho, niêm mạc và mô thần kinh. Đầu tiên, virus nhân lên ở mô lympho của hệ hô hấp. Sau đó virus nhiễm vào các dịch bạch huyết rồi vào máu gây bại huyết. Virus tác động đến nội mạc mạch máu và gây sốt, sốt kéo dài từ 1 - 2 ngày. Virus theo máu vào hệ hô hấp, hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu và hệ thống thần kinh trung ương cũng như dây thần kinh thị giác. Ít ngày sau, cơn sốt thứ 2 xuất hiện, biểu hiện trầm trọng hơn do các nhiễm trùng nặng trong phủ tạng. 2.2.6. Đặc tính sinh học của virus Care Nghiên cứu của Seki et al., (2003) đã làm rõ những đặc tính sinh trưởng khác nhau khi gây nhiễm các CDV lên tế bào Vero và tế bào Vero-DST. Qua đó, có thể nhận thấy, tế bào Vero-DST là dòng tế bào thích hợp, có thể sử dụng để phân lập và xác định hiệu giá virus (Lan et al., 2005a; 2005b; 2006b). 2.2.7. Đặc tính sinh học phân tử của virus Care Cấu trúc của virus Care gồm 1 protein không cấu trúc (C) và 6 protein cấu trúc gồm: Large protein (L), haemagglutinin (H), phosphoprotein (P), nucleocapsid protein (N), fusion protein (F) và matrix protein (M). (Diallo, 1990). Phân loại theo địa lý của virus Care dựa trên trình tự của protein H (Harder and Osterhaus, 1997) gồm 7 nhóm chính: Arctic – like, America 1, America 2, Asia 1, Asia 2, Europe, Europe-wildlife. 2.3. MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ BỆNH CARE 2.3.1. Đặc điểm dịch tễ của bệnh Care Bệnh Care xuất hiện trên toàn thế giới. Trong tự nhiên tất cả các giống chó đều cảm thụ với virus Care, nhưng chó ngoại mẫn cảm hơn chó nội. Virus Care cũng gây bệnh trên động vật hoang dã ăn thịt (Appel et al., 1994). Trong 5 tự nhiên hầu hết xảy ra ở chó từ 2 đến 12 tháng tuổi, nhiều nhất là chó từ 3 đến 6 tháng tuổi. Bệnh xảy ra quanh năm nhưng xuất hiện nhiều khi có sự thay đổi thời tiết đặc biệt là những ngày mưa, độ ẩm cao. Ở Việt Nam, bệnh thường diễn ra vào thời điểm giao mùa, từ xuân sang hè. Chó phát bệnh thường chết với tỷ lệ chết 50 - 80%, thậm chí lên đến 100% nếu không điều trị kịp thời (Hồ Đình Chúc, 1993). 2.3.2. Triệu chứng bệnh tích Triệu chứng của bệnh thường liên quan tới hệ thống hô hấp, tiêu hóa và hệ thống thần kinh. Bệnh Care thường có đặc điểm sốt hai giai đoạn, kèm theo tiết dịch ở mắt – mũi, sau đó là dịch mủ, chán ăn, viêm kết mạc, viêm phế quản, viêm phổi, viêm dạ dày ruột, và triệu chứng thần kinh (Summers and Appel, 1994). Theo Appel and Summers (1995) bệnh tích đại thể có thể gặp bao gồm sừng hoá ở mõm và gan bàn chân. 2.3.3. Chẩn đoán bệnh Care Dựa vào đặc điểm dịch tễ học của bệnh, triệu chứng lâm sàng để chẩn đoán bệnh Care. Trong phòng thí nghiệm có thể áp dụng các phương pháp như xét nghiệm máu, tìm thể Lents, chẩn đoán virus học, ELISA, nhuộm hóa mô miễn dịch, miễn dịch huỳnh quang, RT-PCR, kit chẩn đoán nhanh. 2.3.4. Phòng và điều trị bệnh Phòng bệnh bằng vệ sinh và tiêm phòng vacxin. Điều trị bằng dùng kháng huyết thanh: liều 15 – 30 ml/con, tiêm sớm. Khi con vật đã có triệu chứng viêm phổi hay triệu chứng thần kinh thì kháng huyết thanh không có hiệu lực. PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU - Bệnh viện thú y, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam - Bộ môn bệnh lý thú y, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam - Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học thú y, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam 3.2. THỜI GIAN NGHIÊN CỨU Thời gian: từ tháng 6/2014 tới 12/2016 3.3. ĐỐI TƢỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.3.1. Đối tƣợng nghiên cứu Chó mắc bệnh Care, mẫu virus Care phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm của chó mắc bệnh Care được thu thập từ một số tỉnh phía Bắc Việt Nam: Hà Nội, Hưng Yên, Thái Bình, Bắc Giang, Nam Định. 3.3.2. Vật liệu nghiên cứu - Dụng cụ, trang thiết bị phục vụ nghiên cứu: Bể ổn nhiệt, máy đúc chuyển mẫu tự động, máy cắt tổ chức Microtom, máy làm khô tiêu bản, kính hiển vi quang học, máy xét nghiệm huyết học tự động CELL-DYN 3700, tủ ấm nuôi cấy tế bào (5% CO2), kính hiển vi soi nổi, máy ly tâm, máy gia nhiệt PCR, máy giải trình tự gene tự động Beckman Coulter CEQ 8000. 6 - Hóa chất phục vụ nghiên cứu: Formol 10%, parafin, xylen, thuốc nhuộm Hematoxilin – Eosin, dòng tế bào Vero-DST; DMEM, 10% FBS, dung dịch đệm EDTA, kháng sinh; kit tách chiết RNA, DNA tổng số, cặp mồi gene H và P, kit phản ứng RT-PCR và PCR, đệm TBE hoặc TAE, agarose, hóa chất tinh sạch sản phẩm PCR sequence và kit chạy giải trình tự gene, kit ELISA. 3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.4.1. Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý chủ yếu của chó mắc bệnh Care - Nghiên cứu một số triệu chứng lâm sàng của chó mắc bệnh Care - Nghiên cứu một số chỉ tiêu lâm sàng của chó mắc bệnh Care - Nghiên cứu sự thay đổi về chỉ tiêu máu của chó mắc bệnh Care - Nghiên cứu biến đổi bệnh lý đại thể của chó mắc bệnh Care - Nghiên cứu biến đổi bệnh tích vi thể của chó mắc bệnh Care - Nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật hóa mô miễn dịch để xác định sự phân bố của virus Care trên các cơ quan tổ chức của chó bệnh 3.4.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của của những chủng virus Care phân lập đƣợc - Nghiên cứu khả năng gây bệnh tích tế bào (CPE) của những chủng virus Care phân lập được - Nghiên cứu xác định hiệu giá virus của những chủng virus Care phân lập được - Nghiên cứu xác định quy luật nhân lên của những chủng virus Care phân lập được - Nghiên cứu về tính kháng nguyên của những chủng virus Care phân lập được 3.4.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học phân tử của những chủng virus Care phân lập đƣợc - Nghiên cứu giải trình tự gene của những chủng virus nghiên cứu - Nghiên cứu so sánh trình tự nucleotide của những chủng virus nghiên cứu - Nghiên cứu so sánh trình tự amino acid của những chủng virus nghiên cứu - Nghiên cứu so sánh mức độ tương đồng về trình tự nucleotide giữa những chủng virus nghiên cứu - Nghiên cứu so sánh mức độ tương đồng về trình tự amino acid giữa những chủng virus nghiên cứu - Nghiên cứu xây dựng cây sinh học phân tử thể hiện mối quan hệ phát sinh loài 3.5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.5.1. Phƣơng pháp khám lâm sàng Nhiệt độ cơ thể được đo bằng nhiệt kế thủy ngân, ở trực tràng, ngày 2 lần vào lúc 7 giờ sáng và 5 giờ chiều. Tần số hô hấp được kiểm tra bằng phương pháp quan sát, thông qua sự lên xuống của các cơ vùng ngực. Tần số tim được đo bằng ống nghe đếm nhịp tim trong một phút. 7 3.5.2. Phƣơng pháp mổ khám, quan sát bệnh tích đại thể Chó bệnh được cố định trên bàn mổ hoặc khay mổ, được mổ khám nhằm bộc lộ các cơ quan trong xoang ngực, xoang bụng, xoang chậu, hộp sọ và não, để quan sát. 3.5.3. Phƣơng pháp làm tiêu bản vi thể và quan sát bệnh tích trên tiêu bản Phương pháp làm tiêu bản vi thể theo quy trình tẩm đúc bằng parafin, nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE) thường quy tại phòng thí nghiệm bộ môn Bệnh lý thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam. 3.5.4. Phƣơng pháp nhuộm hóa mô miễn dịch Phương pháp nhuộm hoá miễn dịch tổ chức có quy trình tẩm đúc bằng paraffin giống phương pháp làm tiêu bản vi thể. Các bước thực hiện chính gồm: làm sạch tiêu bản; hoạt hóa enzyme; khử peroxydase nội sinh; gắn kháng thể; gắn kháng kháng thể; bổ sung cơ chất; nhuộm nhân tế bào và đọc kết quả. 3.5.5. Phƣơng pháp xét nghiệm các chỉ tiêu sinh lý máu Lấy 2ml máu/con, đưa vào ống bảo quản có chứa chất chống đông, sau đó phân tích các chỉ tiêu sinh lý máu bằng máy đếm huyết học Cell-Dyn 3700. 3.5.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào Dòng tế bào Vero-DST được nuôi cấy trên môi trường DMEM có bổ sung 10% FCS và 5% CO2. 3.5.7. Phƣơng pháp phân lập virus Care trên môi trƣờng tế bào Vero-DST Mẫu bệnh phẩm được nghiền nát bằng chày và cối vô trùng sau đó được đồng nhất trong dung dịch MEM. Tiến hành ly tâm tốc độ cao và lọc hỗn dịch bệnh phẩm. Hút bỏ môi trường nuôi cấy ở các đĩa lồng tế bào đã chuẩn bị và bổ sung 100 µl hỗn dịch bệnh phẩm. Tế bào gây nhiễm virus được ủ ở 370C với 5% CO2 trong 30 phút. Bổ sung 1,5 ml môi trường DMEM có chứa 10% TPB (Tryptose Phosphate Broth) vào đĩa lồng và để ở 370C với 5% CO2. Hàng ngày theo dõi sự phá hủy tế bào bằng kính hiển vi soi nổi và thu virus khi tế bào bị phá hủy đạt 80% - 90% diện tích đáy của đĩa lồng. 3.5.8. Phƣơng pháp xác định hiệu giá virus (TCID50/ml) TCID50 xác định theo phương pháp Behrens-Karber (Lan et al., 2005a). 3.5.9. Phƣơng pháp xác định đƣờng biểu biễn sự nhân lên của virus Gây nhiễm virus Care trên môi trường tế bào Vero-DST với MOI = 0,01. Xác định hiệu giá virus tự do và virus nằm trong tế bào ở các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84 96 giờ sau gây nhiễm virus. Đường biểu diễn sự nhân lên của virus được xây dựng có biến là log10 của TCID50 tại mỗi thời điểm thu virus. 3.5.10. Phƣơng pháp xác định tính kháng nguyên của virus Care Hỗn dịch kháng nguyên virus Care sau khi được vô hoạt bằng formaldehyde (35%), kiểm tra vô hoạt và thuần khiết, sau đó được trộn với Al(OH)3 10% theo tỷ lệ 1:1. Hỗn dịch này được tiêm cho 6 chó becgie với 2 mũi tiêm cách nhau 28 ngày. Sau 21 ngày tiêm mũi cuối tiến hành công cường độc bằng chủng virus CDV-HUA-04H với liều 100 LD50. Theo dõi triệu chứng lâm sàng, mẫu máu và 8 dịch swab của chó thí nghiệm được lấy ở các ngày 4, 7, 10, 14, 21 để kiểm tra huyết thanh học và phân lập virus. 3.5.11. Phƣơng pháp ELISA Các bước thực hiện theo hướng dẫn đi kèm của bộ kit ELISA Ingezime MOQUILLO IgG 1.5.CDG.K1 của hãng Ingenasa (Tây Ban Nha) nhằm phát hiện kháng thể trong huyết thanh. 3.5.12. Phƣơng pháp RT-PCR và PCR Mẫu RNA tổng số sau khi được tách chiết sẽ được tiến hành phản ứng RT-PCR bằng bộ kit QIAamp Viral RNA Minikit (Qiagen, Hilden, Đức) với các bước thực hiện theo hướng dẫn đi kèm. 3.5.13. Phƣơng pháp giải trình tự gene và xử lý dữ liệu giải trìn