Tóm tắt Thực trạng nhiễm vi nấm, aflatoxin trong một số vị thuốc đông dược và kiến thức, thái độ, thực hành bảo quản thuốc của cán bộ y tế tại Nghệ An, hiệu quả can thiệp

O Ụ V O T O T V ỆN SỐT RÉT - KÝ SINH TRÙNG - ÔN TRÙN TRUN ƢƠN THỰ TR N NH ỄM V NẤM, AFLATOX N TRON M T SỐ MẪU THUỐ ÔN ƢỢ V K N THỨ , TH , THỰ H NH ẢO QUẢN THUỐ ỦA N T T TỈNH N HỆ AN, H ỆU QUẢ AN TH ỆP (2016 – 2017) hu n ng nh ịch tễ học M số 972 01 17 TÓM TẮT LUẬN N T N SỸ HỌ Cán bộ hướng dẫn khoa học 1. PGS. TS.Nguyễn Văn Ba 2. PGS. TS.Phạm Văn Thân H N - 2018 ông trình ho n th nh tại V ỆN SỐT RÉT– KÝ SINH TRÙNG– ÔN TRÙN TRUN ƢƠN Cán bộ hướng dẫn khoa học 3. PGS. TS.Nguyễn Văn Ba 4. PGS. TS.Phạm Văn Thân Phản biện 1:................................................................................................. Phản biện 2:................................................................................................. Phản biện 3:................................................................................................. Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện, họp tại Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương Vào hồi .....giời ....ngày.....tháng ......năm 2018 Có thể tìm đọc luận án tại: - Thư viện Quốc gia; - Thư viện Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương ANH MỤ TỪ V T TẮT AIDS Acquired Immunodeficiency Syndrome – Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải BV Bệnh viện BYT Bộ Y tế CS Cộng sự FAO Foods of Agriculture Organization -Tổ chức Nông Lương Thế giơi FB1 Fumonisin B 1 HIV Human Immunodeficiency Virus - Vi rút gây suy giảm miễn dịch ở người PCR Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi Polymerase PV Preventive value (hiệu quả can thiệp) QCVN Quy chuẩn Việt Nam RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) TB Trung bình TL Tỷ lệ TT Tình trạng WHO World Health Organization - Tổ chức Y tế thế giới VPQ Viêm phế quản XN Xét nghiệm YTNC Yếu tố nguy cơ 1 TÍNH KHOA HỌ , TÍNH MỚ VÀ Ý N HĨA THỰ T ỄN ỦA Ề T 1. Tính khoa học, tính mới của đề t i Đề tài đã áp dụng các phương pháp nghiên cứu có tính khoa học chuẩn mực hiện đang áp dụng rộng rãi tại Việt Nam và Thế giới như: - Phương pháp nghiên cứu mô tả có phân tích với các đợt điều tra cắt ngang, phương pháp nghiên cứu can thiệp giáo dục kiến thức, thái độ, thực hành cho đối tượng nghiên cứu. - Các kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu là những kỹ thuật thường quy hiện đang được áp dụng cho toàn ngành Y tế như: Phương pháp nước muối sinh lý, nuôi cấy nấm trong môi trường Sabouraud. Đặc biệt đề tài đã sử dụng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen định loài nấm, đây là kỹ thuật mới chưa được áp dụng rộng rãi tại Việt Nam. Đây cũng là lần đầu kỹ thuật định lượng aflatoxin trong các vị thuốc đông dược. - Đề tài đã sử dụng phương pháp xử lý số liệu chuẩn mực đáng tin cậy như: Stata, E-piinfo... Vì vậy các kết quả rất có giá trị, có độ tin cậy cao. 2. Ý nghĩa thực tiễn của đề t i Kết quả của đề tài đã cho thấy một bức tranh tổng thể về thực trạng nhiễm nấm và độc tố do nấm sinh ra trong các vị thuốc đông dược. Mặt khác, kết quả của đề tài cũng phản ánh thực trạng về mặt bằng chuyên môn cũng như kiến thức, thực hành của đội ngũ cán bộ y tế hoạt động chuyên môn y học cổ truyền. Đây là những con số có nhiều ý nghĩa trong công tác định hướng can thiệp nâng cao trình độ chuyên môn cho cán bộ y tế tại các bệnh viện. Qua thí điểm can thiệp tai các bệnh viện thụ hưởng dự án cũng cho thấy hiệu quả rất cao của sự kết hợp đồng bộ giữ “tăng cường xây dựng cơ bản” với đầu tư các “trang thiêt bị bảo quản thuốc đông dược ẤU TRÚ ỦA LUẬN N Luận án dày 114 trang, gồm: Đặt vấn đề 2 trang; Tổng quan 32 trang; Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 30 trang; Kết quả nghiên cứu 30 trang; Bàn luận 27 trang; Kết luận 2 trang; Kiến nghị 1 trang. Luận án có 14 hình, 26 bảng sô liệu, 3 phụ lục. Có 104 tài liệu tham khảo, 54 tài liệu tham khảo tiếng việt, 60 tài liệu tham khảo tiếng Anh, trong đó 56/104 tài liệu trong thời gian 5 năm gần đây, chiếm 54%. 2 ẶT VẤN Ề Nấm là những sinh vật có nhân và thành tế bào thực sự, dị dưỡng, sinh sản bằng bào tử. Nấm phân bố rộng rãi trong tự nhiên, phần lớn sống hoại sinh trong đất, số ít có khả năng ký sinh gây bệnh cho người và động vật. Ước tính trên thế giới có trên 1 triệu loài nấm. Có loại nấm có lợi, có loại có hại cho sức khỏe con người. Với sự đa dạng và phong phú của nấm người ta còn xếp nấm thành 1 giới riêng là “giới nấm”. Hiện nay, khoa học đã phát hiện khoảng trên 400 loài nấm gây bệnh cho người. Các vị thuốc đông dược thường được chế biến theo phương pháp cổ truyền như phơi, sấy, tẩm đường, mật... Trong điều kiện khí hậu nhiệt đới nóng ẩm của nước ta và quá trình bảo quản không tốt do thiếu thốn phương tiện và kỹ thuật bảo, các vị thuốc đông dược rất dễ bị ẩm mốc. Nhiều công trình nghiên cứu đã cho thấy các vị thuốc đông dược, các sản phẩm nông nghiệp sau thu hoạch thường nhiễm các loài nấm Aspergillus spp như: Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus niger... trong đó có vai trò y học quan trọng nhất là Aspergillus flavus (A. flavus). Tại Việt Nam nói chung và Nghệ An nói riêng, cho đến nay chưa có nhiều công trình nghiên cứu sâu về sinh bệnh học, dịch tễ học về nấm nhất là vi nấm ký sinh trên các vị thuốc đông dược và kiến thức, thái độ, thực hành bảo quản của người hành nghề y học cổ truyền nhưng các yếu tố nguy cơ ô nhiễm mầm bệnh vi nấm thì rất cao... đã làm cho một tỷ lệ không nhỏ chế phẩm đông dược ô nhiễm mầm bệnh vi nấm, đây là căn nguyên nhân cơ bản gây ra các bệnh ung thư gan nguyên phát, suy gan, xơ gan, u phổi do nấm... do các chất độc sinh ra trong quá trình phát triển của nấm như aflatoxin. Với tính cấp thiết của vấn đề chúng tôi thực hiện đề tài: “Thực trạng nhiễm vi nấm, aflatoxin trong một số vị thuốc đông dược và kiến thức, thái độ, thực hành bảo quản thuốc của cán bộ y tế tại tỉnh Nghệ An, hiệu quả can thiệp (2016 - 2017)”, với các mục tiêu nghiên cứu sau: 1.Xác định tỷ lệ nhiễm vi nấm, aflatoxin trong một số vị thuốc đông dược tại một số bệnh viện tỉnh Nghệ An năm 2016. 2. Mô tả thực trạng về môi trường, trang thiết bị bảo quản thuốc và kiến thức, thái độ, thực hành bảo quản thuốc đông dược của các cán bộ y tế tại các bệnh viện tỉnh Nghệ An. 3. Đánh giá hiệu quả can thiệp phòng chống vi nấm cho thuốc đông dược. 3 hƣơng 1 TỔN QUAN T L ỆU Theo Tổ chức Y tế Thế giới, bệnh do vi nấm thường gặp ở các nước kém phát triển có điều kiện vệ sinh kém, môi trường sống chật chội ẩm ướt, tỷ lệ mắc từ 5 -10%, có nơi > 10%. Một số bệnh nấm diễn biến rất phức tạp khó chẩn đoán như bệnh nấm phổi, bệnh nấm máu, bệnh nấm dịch não tủy và đặc biệt là ung thư gan nguyên phát do độc tố aflatoxin. Tổ chức Y tế Thế giới đưa aflatoxin vào danh mục chất gây ung thư mạnh năm 1988 và Tổ chức Nông lương thế giới (FAO) khuyến cáo aflatoxin cần được kiểm soát chặt trẽ trong các sản phẩm nông nghiệp và các sản phẩm sau thu hoạch. Các nước cần có bộ công cụ đủ mạnh giám sát hàm lượng aflatoxin về khung pháp lý, về kỹ thuật phát hiện,đến sản xuất và lưu thông phân phối, nhằm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng. hƣơng 2 Ố TƢỢN V PHƢƠN PH P N H ÊN ỨU 2.1. ối tƣợng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 2.1.1. ối tƣợng nghiên cứu - Các mẫu thuốc đông dược trong các kho thuốc tại các khoa y học cổ truyền tại các bệnh viện công lập thuộc tỉnh Nghệ An. - Các nhà kho và trang thiết bị bảo quản thuốc đông dược trong các kho của các khoa y học cổ truyền tại các bệnh viện công lập. - Cán bộ y tế làm công tác chuyên môn về y học cổ truyền bao gồm: Làm công tác bảo quản, cấp phát thuốc đông dược ở các khoa dược trong các bệnh viện thuộc tỉnh Nghệ An. Ghi chú: “Thuốc đông dược” là bao gồm các vị thuốc của y học cổ truyền phương đông, bao gồm: Thuốc nam và thuốc bắc. Thuốc bắc là thuốc có nguồn gốc từ Trung Quốc. Thuốc nam là các vị thuốc sản xuất và chế biến tại Việt Nam. 2.1.2. ịa điểm nghiên cứu - Điều tra cắt ngang: Địa điểm lấy mẫu thuốc đông dược và phỏng vấn cán bộ y tế tại các bệnh viện: Chọn ngẫu nhiên 10/29 bệnh viện đại diện đầy đủ các vùng khác nhau của tỉnh Nghệ An - Nuôi cấy nấm: Tại labo vi sinh Bệnh viện Hữu nghị Đa khoa Nghệ An, đây là an toàn sinh học cấp II. - Thực hiện kỹ thuật định lượng aflatoxin bằng kỹ thuật sắc ký khí lỏng hiệu năng cao: Tại Viện Công nghệ Dược liệu Trung ương. - Thực hiện kỹ thuật PCR và giải trình tự gen: Tại Labo kỹ thuật cao Học viện Quân y . - Thực hiện kỹ thuật sắc ký khí lỏng hiệu năng cao: Tại Viện công nghệ Dược liệu Trung ương. 2.1.3 Thời gian nghiên cứu Từ tháng 5/2016 – tháng 12/2017 4 2.2. Phƣơng pháp nghi n cứu - Thiết kế nghiên cứu: Đề tài được thiết kế bằng 2 phương pháp nghiên cứu: Dịch tễ học mô tả có phân tích. Dịch tễ học can thiệp không đối chứng. - Cỡ mẫu nghiên cứu: Áp dụng công thức tính cỡ mẫu tối thiểu cho một tỷ lệ nhiễm nấm: n = 2/1 2 Z 2 )1( d pp  Trong đó: n: Cỡ mẫu tối thiểu; p: Tỷ lệ nhiễm nấm ước tính của quần thể, chọn p = 0,50, do chưa có nghiên cứu nào về tình trạng nhiễm nấm ở các vị thuốc đông dược trên địa bàn tỉnh Nghệ An; Z1-/2: Hệ số tin cậy, ứng với độ tin cậy 95% thì Z1-/2 = 1,96; d: Sai số tuyệt đối mong muốn của p, chọn d = 5%, d² = 0,025. Với các giá trị đã chọn, cỡ mẫu tính nghiên cứu là 384. Để đảm bảo độ tin cậy chúng tôi cộng thêm 20% vào cỡ mẫu → cỡ mẫu tính toán là 462. Thực tế đề tài thực hiện được 505 mẫu thuốc đông dược. - Nội dung nghiên cứu mô tả thực trạng nhiễm nấm và aflatoxin trong các vị thuốc đông dược: Sử dụng kỹ thuật trực tiếp trong môi trường KOH 20%; Nuôi cấy nấm trong môi trường Saboraud 100% số mẫu; Chọn 50 mẫu nấm (+) thực hiện kỹ thuật PCR và giải trình tự gen định danh loài và xác định tỷ lệ thành phần loài nấm. 100% số mẫu có nhiễm nấm (+) để thực hiện kỹ thuật sắc ký khí lỏng hiệu năng cao xác định hàm lượng aflatoxin. - Cỡ mẫu nghiên cứu mô tả kiến thức, thái độ, thưc hành bảo quản thuốc đông dược của cán bộ y tế: Cỡ mẫu tính toán là 60, chọn toàn bộ các cán bộ y tế trực tiếp làm công tác chuyên môn về bảo quản và cấp phát thuốc đông dược ở 10 bệnh viện nghiên cứu. - Nghi n cứu mô tả thực trạng nh kho, môi trƣờng bảo quản thuốc v kiến thức, thái độ, thực h nh bảo quản thuốc thuốc đông dƣợc của cán bộ tế + Chọn ngẫu nhiên 10/29 bệnh viện trong tỉnh có hoạt động chuyên môn về y học cổ truyền, đánh giá: Kết cấu nhà kho bằng nhà loại gì: Cấp 4 có mái lợp ngói hoặc tôn, nhà mái bằng, nhà cao tầng, tường quét vôi ve hay sơn, diện tích bao nhiêu m². Có cửa sổ, cửa thông gió hay không, có giá để thuốc hay không, trên các giá có hộp đựng thuốc có ghi nhãn không... + Kho đạt tiêu chuẩn có diện tích ≥ 50 m², mái lợp tôn, ngói..nhưng không dột, nền bằng xi măng hoặc lát gạch men, có cửa sổ thông gió và lấy ánh sáng. Có hay không có các trang thiết bị gồm điều hòa nhiệt độ, máy hút ẩm, đồng hồ đo nhiệt độ - độ ẩm, túi hút ẩm bằng hóa chất, quạt thông gió, giá để thuốc, bổ sung hộp nhựa đựng thuốc, bổ sung nhãn hộp đựng thuốc... + Điều kiện vi khí hậu trong kho đạt tiêu chuẩn là: Nhiệt độ ổn định < 25°C, độ ẩm trung bình < 70%, tốc độ gió từ 0,5 m/s đến < 1 m/s. + Các yếu tố về kiến thức, thái độ, thực hành bảo quản thuốc đông dược của cán bộ y tế. - Nghiên cứu can thiệp + Can thiệp thông qua nâng cấp trang thiết bị bảo quản thuốc. + Thực hiện lấy mẫu và nuôi cấy nấm trong môi trường Saboraud xác định tỷ lệ nhiễm nấm sau can thiệp 12 tháng. 5 + Can thiệp bằng truyền thông nâng cao kiến thức, thái độ, thực hành phòng chống nhiễm nấm cho thuốc của cán bộ y tế 2.3. ác kỹ thuật sử dụng trong nghi n cứu - Kỹ thuật chẩn đoán nhiễm nấm gồm: Kỹ thuật soi tươi trong môi trường KOH20%; Kỹ thuật nuôi cấy nấm trong môi trường Sabouraud với pH = 4,5 và có kháng sinh được thực hiện với 100% số mẫu thuốc đông dược; Kỹ thuật PCR và giải trình tự gen định danh loài nấm. - Kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao (AOAC Official Method 990.33) định lượng aflatoxin trong các vị thuốc đông dược. - Kỹ thuật phỏng vấn cộng đồng. 2.4. Các chỉ số nghiên cứu - Các chỉ số đánh giá tình trạng nhiễm nấm và aflatoxin + Tỷ lệ nhiễm nấm chung bằng xét nghiệm trực tiếp trong môi trường KOH 20%, nuôi cấy trong môi trường Sabouraud và sử dụng kỹ thuật PCR định loài nấm. Bao gồm: Tỷ lệ nhiễm nấm chung, tỷ lệ nhiễm nấm từng loại nấm, tỷ lệ nhiễm từng loài nấm, tỷ lệ nhiễm nấm ở các mẫu thuốc bắc và thuốc nam... + Đánh giá tình trạng nhiễm aflatoxin B1 theo tiêu chuẩn QCVN 8- 1:2011/BYT, cụ thể như sau: - Các chỉ số đánh giá thực trạng nhà kho, trang thiết bị trong kho, môi trƣờng trong kho bảo quản thuốc đông dƣợc - Các chỉ số về hiệu quả can thiệp: Bao gồm trang bị máy điều hòa nhiệt độ, quạt thông gió, máy hút ẩm, túi chống ẩm bằng hóa chất, giá để thuốc, tủ đựng thuốc, hộp nhựa đựng thuốc có ghi nhãn. Tất cả các mẫu sau khi xét nghiệm, nếu xác định có nhiễm nấm đều được đánh giá hiệu quả can thiệp sự thay đổi các chỉ số về nhiễm nấm trước và sau can thiệp 12 tháng. 2.5. Phƣơng pháp xử lý và phân tích số liệu Số liệu định lượng thu thập được qua xét nghiệm, qua phỏng vấn quan sát sẽ được nhập và phân tích bằng phần mềm Epi - Info 6.04 và Stata. 2.6. ạo đức nghiên cứu Tuân thủ nghiêm ngặt các quy định trong nghiên cứu y-sinh học như: Tuân thủ các quy trình nghiên cứu, thông báo và nói rõ mục đích nghiên cứu đối với đối tượng là cán bộ y tế được tham gia vào mẫu nghiên cứu phỏng vấn kiến thức, thái độ, thực hành bảo quản thuốc. Chỉ được nghiên cứu ở người tự nguyện. Giữ bí mật về ý kiến của người phỏng vấn về các ván đề của cơ sở y tế liên quan đến bảo quản thuốc. Đề tài được thông qua Hội đồng Y đức của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương, Hội đồng Y đức của Sở y tế tỉnh Nghệ An và được sự chấp thuận của: Sở Y tế tỉnh Nghệ An và các cơ sở y tế trong tỉnh. 6 hƣơng 3 K T QUẢ N H ÊN ỨU 3.1. Thực trạng nhiễm nấm v aflatoxin trong dƣợc liệu đông dƣợc tại các bệnh viện thuộc tỉnh Nghệ An năm 2016 3.1.1. Thực trạng nhiễm nấm trong các vị thuốc đông dƣợc - Tỷ lệ nhiễm nấm bằng kỹ thuật soi tươi Bảng 3.3. Tỷ lệ nhiễm nấm chung ở các mẫu thuốc đông dƣợc bằng kỹ thuật soi tƣơi (n = 505) Nguồn gốc thuốc Số xét nghiệm Số nhiễm nấm Tỷ lệ (%) Các mẫu thuốc bắc (1) 380 96 25,26 Các mẫu thuốc nam (2) 125 78 62,40 Tổng 505 174 34,46 Giá trị p (1: 2) < 0,01 Nhận xét Tỷ lệ nhiễm nấm chung bằng kỹ thuật soi tươi trong môi trường KOH 20% là 34,46%. Có sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm nấm ở các mẫu thuốc bắc và thuốc nam, với các tỷ lệ 25,26% so với 62,40%, p < 0,01 - Kết quả nuôi cấy nấm trong môi trường Saboraud 100% số mẫu nghiên cứu đều được nuôi cấy nấm trong môi trường Sauboraud. Kết quả nuôi cấy như Bảng 3.5 và Bảng 3.6, Hình 3.1 sau: Bảng 3.5. Tỷ lệ nhiễm nấm chung ở các vị thuốc bắc và nam dƣợc bằng kỹ thuật nuôi cấy nấm trong môi trƣờng Saboraud (n = 505) Nhóm vị thuốc Số mẫu xét nghiệm Số mẫu nhiễm nấm Tỷ lệ (%) Các vị thuốc bắc (1) 380 173 45,53 Các vị thuốc nam (2) 125 91 72,80 Tổng 505 262 51,80 Giá trị p (1: 2) < 0,01 Nhận xét Tỷ lệ nhiễm nấm chung bằng kỹ thuật nuôi cấy nấm trong môi trường Saboraud là 51,8%. Có sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm nấm ở các vị thuốc bắc và các vị thuốc nam (45,53% so với 72,80%, với p < 0,01). ảng 3.6. Tỷ lệ nhiễm nấm ở các vị thuốc đông dƣợc l thân - rễ, lá, củ quả bằng nuôi cấ nấm trong môi trƣờng Sauboraud Nguồn gốc thuốc Số xét nghiệm Số nhiễm nấm Tỷ lệ (%) Thuốc bắc Hoa, quả (1) 60 30 50,00 Thân, lá (2) 155 70 45,16 Củ (3) 165 73 44,24 Giá trị p (1: 2; 3) > 0,05 Thuốc nam Hoa, quả (1) 40 27 67,50 Thân, lá (2) 55 38 69,09 Củ (3) 30 26 86,67 Giá trị p (3: 1; 2) < 0,05 Nhận xét 7 Không có khác biệt về tỷ lệ nhiễm nấm ở các vị thuốc bắc có nguồn gốc từ hoa, quả so với thân, lá và củ, với các giá trị 50,00% so với 45,16% và 44,24% với p > 0,05. Có khác biệt về tỷ lệ nhiễm nấm ở các vị thuốc nam có nguồn gốc từ củ so với hoa, quả và thân lá với các giá trị 86,67% so với 67,50% và 69,09%, p < 0,05. ảng 3.8. Tổng hợp kết quả xác định tỷ lệ nhiễm nấm bằng kỹ thuật soi tƣơi v nuôi cấ trong môi trƣờng Saboraud (n = 505) Kỹ thuât xét nghiệm phát hiện nấm Số xét nghiệm Số nhiễm nấm Tỷ lệ (%) Soi tươi 505 174 34,46 Nuôi cấy nấm trong môi trường Saboraud 505 262 51,80 Giá trị p < 0,01 Nhận xét Tỷ lệ phát hiện nhiễm nấm bằng kỹ thuật nuôi cấy nấm trong môi trường Saboraud cao hơn tỷ lệ phát hiện nấm bằng kỹ thuật soi tươi, với các tỷ lệ 51,80% so với 34,46%. 3.1.2. Kết quả định danh loài nấm ở các mẫu thuốc đông dƣợc bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen Chọn 50/262 mẫu nhiễm nấm để thực hiện kỹ thuật PCR và giải trình tự gen, trong đó có 46 mẫu nấm sợi, 04 mẫu nấm men kết quả như sau: - Kết quả nhân gen, xác định trình tự và định danh các mẫu nấm Các mẫu nấm được tách chiết ADN bằng bộ kít Fungi/Yeast Genomic DNA Isolation Kit (Cat. # 27300, Norgen Biotek Corp, Canada) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. DNA của nấm sau khi tách chiết được sử dụng làm khuôn (template) cho phản ứng PCR. Cặp mồi ITS5 và NL4 khuếch đại đoạn gen chứa 1 phần gen 18S rDNA; Toàn bộ đoạn gen 5.8S rDNA; Toàn bộ các đoạn giao gen ITS1, ITS2 và một phần gen 28S rDNA của vi nấm, kích thước khoảng 1000-1200bp, tùy từng loài nấm. Kết quả tách chiết PCR và chạy điện di trên gel thạch như sau: 8 Hình 3.4. Kết quả giải trình tự gen Nhận xét Hình 3.4 cho thấy, đồ thị chạy PCR của các mẫu nấm phân lập từ dược liệu tại các bệnh viện của tỉnh Nghệ An là các đường liên tục, khớp với đồ thị chạy PCR của các mẫu gen chuẩn quốc tế. Trình tự các nucleotide thu được ở các mẫu đều có chất lượng tốt. Kết quả này cho thấy gen mồi lựa chọn, điều kiện cho phản ứng PCR là hoàn toàn phù hợp và đạt mức tối ưu. - Kết quả giải trình tự so sánh với ngân hàng gen chuẩn quốc tế Sau khi nhân bội gen, chạy điện di, sản phẩm PCR tinh sạch được kiểm định so sánh với ngân hành genbank chuẩn quốc tế là các chủng chuẩn đã được đăng ký mã số trên ngân hàng genbank quốc tế với sự kiểm định của các labo có uy tín trên thế giới. Trong đề tài này chúng tôi sử dụng mã số genbank KF617362.1 . Kết quả kiểm định độ tương đồng như Hình 3.4 và Bảng 3.9 sau: Đồ thị hiển thị trên máy chạy PCR là các đường liên tục, rõ nét rất điển hình với các mẫu gen chuẩn quốc tế KF617362.1 đã được đăng ký bản quyền của các labo chuẩn quốc tế có uy tín. Bảng 3.9. Tỷ lệ tƣơng đồng của một số mẫu nấm so với ngân hàng genbank Ký hiệu mẫu Mã số trên genbank Nơi phân lập Chủng so sánh, mã số Tỷ lệ (%) tương đồng NA-DL17 MF599708.1 BV. Huyện Đô Lương Rhizopus oryzae, KJ650335.1 99,7% NA-DY34 MF599709.1 BV. Đông Y tỉnh Nghệ An Aspergillus flavus, HQ856223.1 99,9% NA- HNDK10 MF599710.1 BV Hữu nghị Đa khoa A. tubingensis, KX664401.1 99,7% NA-QC31 MF599711.1 BV. Huyện Quỳ Châu Corynespora smithii, KY984300.1 97, 5% NA-QC29 MF599712.1 BV. Huyện Quỳ Châu Fungal sp., KF617362.1 92% NA-TL06 MF599713.1 BV. Huyện Thanh Chương Kodamaea ohmeri, KY103876.1 99,8% NA-TL10 MF599714.1 BV. Huyện Thanh Chương A. tubingensis, KX664317.1 100% NA-TP34 MF599715.1 BV. Đa khoa Tp. Vinh Aspergillus niger, KJ365316.1 99,9 Nhận xét Kết quả tại Hình 3.4 và Bảng 3.9 cho thấy, hầu hết các mẫu được xác định loài đều có tỷ lệ tương đồng cao với ngân hàng gen, trên 99%. Riêng mẫu NA- QC29 chưa rõ loài do tỷ lệ tương đồng với nấm trên ngân hàng gen chỉ đạt 92%. Chủng này được đăng ký trên ngân hàng gen với mã số KF617362.1, tạm gọi là (loài nấm chưa xác định). 9 - Tổng hợp thành phần loài nấm phân lập từ các mẫu thuốc đông dược được thực hiện kỹ thuật PCR và giải trình tự gen Bảng 3.10. Thành phần loài nấm phân lập từ các mẫu thuốc đông dƣợc n = 50