Tuyển chọn chủng bacillus subtilis ứng dụng trong phõng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THỊ HẢI YẾN TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ỨNG DỤNG TRONG PHÕNG BỆNH NHIỄM KHUẨN ĐƯỜNG TIÊU HÓA TRÊN GÀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI MÃ SỐ: 62 64 01 02 CẦN THƠ, 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THỊ HẢI YẾN TUYỂN CHỌN CHỦNG BACILLUS SUBTILIS ỨNG DỤNG TRONG PHÕNG BỆNH NHIỄM KHUẨN ĐƢỜNG TIÊU HÓA TRÊN GÀ LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH BỆNH LÝ HỌC VÀ CHỮA BỆNH VẬT NUÔI MÃ SỐ: 62 64 01 02 HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC HIỀN Cần Thơ, 2018 ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành các nội dung trong luận văn tốt nghiệp, ngoài sự cố gắng học hỏi của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều từ quý thầy cô, bạn bè. Tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: PGS. TS Nguyễn Đức Hiền đã động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án. Quí thầy cô Bộ môn Thú y, khoa Nông nghiêp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường. Ban lãnh đạo Vemedim Corporation, Trung tâm nghiên cứu và phát triển Vemedim đã tạo điều kiện thuận lợi để tôi học tập, nghiên cứu và nâng cao trình độ trong thời gian qua. Cty TNHH chăn nuôi một thành viên Vemedim đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được thực hiện các thí nghiệm. Xin chân thành cảm ơn tất cả bạn bè, các bạn đồng nghiệp, các anh, chị, em phòng Sản phẩm sinh học, Trung Tâm nghiên cứu và phát triển Vemedim đã hỗ trợ, chia sẻ và cung cấp thông tin giúp tôi hoàn thành luận án. Cảm ơn gia đình và những người thân đã động viên, chia sẻ và luôn sát cánh bên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài. iii TÓM LƢỢC Đề tài “Tuyển chọn chủng Bacillus subtilis ứng dụng trong phòng bệnh nhiễm khuẩn đường tiêu hóa trên gà” được thực hiện với mục đích phân lập chủng vi khuẩn B. subtilis có tiềm năng probiotic thích hợp cho gia cầm từ đất và phân của trại gà. Nghiên cứu này nhằm tìm biện pháp mới thay thế kháng sinh trong phòng và trị bệnh, nâng cao năng suất, hiệu quả trong chăn nuôi gà công nghiệp, giảm bớt nguy cơ lan rộng các dòng vi khuẩn kháng kháng sinh trong tự nhiên. Đề tài đã phân lập được 296 chủng vi khuẩn từ 70 mẫu đất và 70 mẫu phân gà thu thập tại các trại gà thuộc 7 tỉnh, thành vùng ĐBSCL. Các chủng vi khuẩn này được chọn lọc qua kiểm định sinh lý, sinh hóa với các chỉ tiêu như: âm tính với lecithinase, dương tính với catalase, amylase, cellulase, VP (Voges- Proskauer), và chịu nhiệt cao (phát triển được ở 50oC); và được định danh bằng bộ kít API CH50B (Biomerieux-France) kết hợp với kỹ thuật sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rRNA (sử dụng phần mềm BLAST so sánh trình tự gen trên cơ sở dữ liệu NCBI). Kết quả phân tích cho thấy đã chọn ra được 21 chủng vi khuẩn đạt chỉ tiêu về mặt sinh lý, sinh hóa theo yêu cầu và về mặt định danh có mức độ tương đồng của gene 16S rRNA cao (≥ 99%) với B. subtilis. Nhằm tuyển chọn chủng vi khuẩn có tiềm năng probiotic, 21 chủng B. subtilis tuyển chọn đã được khảo sát các đặc điểm đặc trưng cho vi khuẩn probiotic như: tính nhạy cảm kháng sinh (erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracyclin, doxycyclin, colistin, sulfadimidin - trimethoprim, norfloxacin, enrofloxacin), tính chịu nhiệt (phát triển ở nhiệt độ từ 50-60oC), khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease, lipase), khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh (E. coli, S. enterica, Staphylococcus spp., Streptococcus spp.), khả năng chịu pH acid dạ dày (pH 2,0), khả năng chịu muối mật 0,3%, khả năng bám dính (tự bám dính, bám dính với vi khuẩn gây bệnh, bám dính tế bào biểu mô ruột) và khả năng sống được trong đường tiêu hóa gà. Kết quả cho thấy trong 21 chủng vi khuẩn khảo sát, B. subtilis VL28 thể hiện tốt nhất các đặc tính probiotic, do vậy chủng này được chọn để sử dụng trong thử nghiệm thức ăn bổ sung probiotic cho gà. Vi khuẩn B. subtilis VL28 mật độ 107 CFU/g với liều lượng 5 g/kg thức ăn được bổ sung vào thức ăn cho gà ở độ tuổi 1-56 ngày cho thấy hiệu quả tăng trọng của gà đạt 11,7%, đồng thời lượng thức ăn sử dụng giảm 16,8% so với đối chứng nuôi bằng thức ăn không bổ sung vi khuẩn. Bên cạnh đó, gà 18 ngày tuổi lây nhiễm với S. enterica (liều 7,5x104 CFU/mL/gà) và E. coli (liều 5,0x106 CFU/mL/gà), được nuôi với thức ăn có bổ sung B. subtilis VL28 với liều như trên có khả năng tăng trọng và tỉ lệ sống tương đương với điều trị bằng kháng sinh enrofloxacin và iv oxytetracyclin. Các kết quả này cho thấy chủng B. subtilis VL28 phân lập và tuyển chọn được trong đề tài này có tiềm năng probiotic rất lớn, chủng này có thể sử dụng để thay cho kháng sinh trong việc phòng và trị bệnh đường tiêu hóa ở gia cầm. Trình tự gen 16S rRNA của B. subtilis VL28 đã được đăng ký trên ngân hàng gen của NCBI với mã số truy cập là KY346980. Từ khóa: B. subtilis, gà, phân lập, định danh, probiotic v ABSTRACT The dissertation “Isolation of Bacillus subtilis and its application on the prevention of intestinal diseases in chicken” was carried out to isolate the B. subtilis strains with probiotic potential from soil and fecal samples at intensive chicken farms. This study aimed to find out alternatives for antibiotics in the prevention and treatment of intestinal diseases as well as to increase productivity and effectiveness in poultry industry and also to reduce the risks of spreading antibiotic resistant bacteria in nature. From 70 soil samples and 70 fecal samples of chicken farms from 7 provinces in the Mekong Delta, 296 similarly B. subtilis bacteria were isolated. These isolates were analyzed further for B. subtilis characteristics by physio- biological tests with the following criteria such as: negative in lecithinase, positive in catalase, amylase, cellulase, VP (Voges-Proskauer), and temperature tolerance (being able to grow at 50 o C); and identified by the API CH50B kit (Biomerieux-France) in combination with the bio-molecular technique namely partial sequencing of 16S rRNA (using BLAST alignment with the known sequences on the NCBI genbank). The results showed that there were 21 isolates which satisfied the required physio-biochemical criteria, and the strain identification revealed that the similarity of gene 16S rRNA was high (≥ 99%) with B. subtilis. In order to select the B. subtilis strain with probiotic capabilities, 21 selected B. subtilis isolates were investigated further on the susceptibility to antibiotics (erythromycin, gentamycin, neomycin, oxytetracyclin, doxycyclin, colistin, sulfadimidin - trimethoprim, norfloxacin, enrofloxacin), temperature tolerance (being able to grow at 50-60 o C), extracellular enzyme production (amylase, protease, lipase), bacterial pathogen inhibition properties (E. coli, S. enterica, Staphylococcus spp., Streptococcus spp.), tolerance to acidity of the gastric juice (pH 2,0) and 0.3% bile salts, adherence ability (autoaggregation, coaggregation, adherence to epithelial cells) and survival rate in gastro- intestinal environment. The results showed that among 21 isolates observed, the strain B. subtilis VL28 exposed the best probiotic capabilities. Consequently, this strain was chosen to use as a supplement for chicken feed. The B. subtilis VL28 (the density of 10 7 CFU/g and the dosage at 5 g/kg of feed) was supplemented in feed for the 1-56 day old chicken. The results showed that chicken growth increased by 11,7% and feed usage decreased by 16,8%, compared with the control groups without supplementing B. subtilis VL28. Furthermore, the 18 day old chicken, infected by S. enterica (with the dosage of 7,5x10 4 CFU/mL/chicken) and by E. coli (with the dosage of 5,0x10 6 CFU/mL/chicken), then fed with vi B. subtilis VL28 (supplemented in feed with the above described dosage), had growth ability and mortality rate equivalent to control groups treated with enrofloxacin and oxytetracyclin. These results showed that the selected B. subtilis VL28 strain in our study has great probiotic potential and could be used to replace antibiotics for prevention and treatment of intestinal diseases in poultry. The 16S rRNA partial sequence of the new B. subtilis VL28 was registered in the Genbank of NCBI with the access code KY346980. Key words: B. subtilis, chicken, isolation, identification, probiotic vii MỤC LỤC Lời cam kết kết quả......................................................................................... i Lời cảm ơn ..................................................................................................... ii Tóm lược ....................................................................................................... iii Abstract .......................................................................................................... v Danh sách bảng .............................................................................................. x Danh sách hình ............................................................................................. xii Danh mục từ viết tắt ..................................................................................... xv CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU ......................................................................... 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................... 1 1.2. Mục tiêu .................................................................................................. 1 1.3. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .......................................................... 2 1.4. Những đóng góp mới của luận án ........................................................... 2 1.5. Ý nghĩa thực tiễn của luận án ................................................................ 2 CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ....... ..3 2.1. Tổng quan về probiotic ........................................................................ 3 2.1.1. Lịch sử probiotic .................................................................................. 3 2.1.2. Các định nghĩa về probiotic ................................................................. 3 2.1.3. Xu hướng sử dụng probiotic ................................................................ 4 2.1.4. Vai trò và cơ chế tác động của probiotic ............................................. 5 2.1.5. Cơ chế tác động của probiotic ở gia cầm ............................................ 8 2.1.6. Các chủng vi khuẩn thường dùng làm probiotic................................ 12 2.1.7. Các chỉ tiêu để chọn một vi sinh vật làm probiotic ........................... 13 2.1.8. Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic ................... 14 2.2. Tổng quan về Bacillus subtilis ............................................................ 15 2.2.1. Đặc điểm chung của giống Bacillus .................................................. 15 2.2.2. Đặc điểm loài Bacillus subtilis .......................................................... 16 viii 2.2.3. Dinh dưỡng và tăng trưởng ............................................................... 22 2.2.4. Các chất do B. subtilis sinh ra ............................................................ 23 2.2.5. Tính đối kháng của B. subtilis ........................................................... 25 2.2.6. Một số phương pháp nghiên cứu tính đối kháng của B. subtilis và vi sinh vật gây bệnh ................................................................................... 26 2.3. Hệ tiêu hóa và vi sinh vật đƣờng ruột ............................................... 27 2.3.1. Hệ tiêu hóa gia cầm và sự khác biệt so với động vật hữu nhũ .......... 27 2.3.2. Vi sinh vật đường ruột và tác động của chúng đến vật nuôi ............. 30 2.4. Một số vi khuẩn gây bệnh đƣờng tiêu hóa thƣờng gặp trên gà ...... 31 2.4.1. Salmonella ......................................................................................... 31 2.4.2. E. coli ................................................................................................. 36 2.4.3.Clostridium perfringens ...................................................................... 39 2.5. Một số nghiên cứu về probiotic trên thế giới và tại Việt Nam ....... 42 2.5.1. Trên thế giới ...................................................................................... 42 2.5.2. Tại Việt Nam .................................................................................... 43 2.6. Một số nghiên cứu ứng dụng B. subtilis ............................................ 44 2.6.1. B. subtilis ứng dụng cho người và vật nuôi ....................................... 44 2.6.2. B. subtilis sử dụng cho gia cầm ........................................................ 45 CHƢƠNG 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 47 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................... 47 3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu ..................................................................... 47 3.2.1. Vật liệu ............................................................................................... 47 3.2.2. Dụng cụ .............................................................................................. 47 3.2.3. Thiết bị .............................................................................................. 47 3.2.4. Hóa chất và môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn ......................... 48 3.3. Nội dung nghiên cứu và phƣơng pháp nghiên cứu .......................... 49 3.3.1. Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 49 3.3.2. Phân lập các chủng Bacillus subtilis .................................................. 50 ix 3.3.3. Tuyển chọn các chủng B. subtilis có đặc tính probiotic .................... 56 3.3.4. Đánh giá tính an toàn và tác dụng của chế phẩm trên gà .................. 61 3.4. Xử lý số liệu ......................................................................................... 65 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................ 66 4.1. Phân lập và định danh vi khuẩn Bacillus subtilis ............................ 66 4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus spp............................................. 66 4.1.2. Kết quả định danh Bacillus spp ......................................................... 67 4.2. Kết quả khảo sát các đặc tính probiotic ........................................... 77 4.2.1. Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt độ cao..................................... 77 4.2.2. Khả năng nhạy/ kháng kháng sinh .................................................... 78 4.2.3. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào .......................... 81 4.2.4. Khả năng đối kháng với các chủng vi sinh vật gây bệnh .................. 85 4.2.5. Khả năng chịu acid dạ dày và muối mật ............................................ 98 4.2.6. Khả năng bám dính ......................................................................... 104 4.2.7. Khả năng sống của vi khuẩn trong đường ruột gà ........................... 109 4.3. Kết quả thí nghiệm, đánh giá tác dụng của chế phẩm trên gà ..... 111 4.3.1. Kết quả thí nghiệm 1.. .................................................................. 111 4.3.2. Kết quả thí nghiệm 2 ....................................................................... 114 4.3.3. Kết quả thí nghiệm 3 ........................................................................ 123 4.4. Đăng ký trình tự B. subtilis trên Genbank.....131 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................. 133 5.1. Kết luận .............................................................................................. 133 5.2. Đề nghị ............................................................................................... 134 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .............................. 135 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................... 136 PHỤ LỤC ................................................................................................. 154 x DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1. Bậc phân loại của Bacillus subtilis ...................................................... 15 Bảng 2.2. Một số đặc điểm của Bacillus subtilis ................................................. 22 Bảng 2.3. Một số loại enzyme do B. subtilis sinh tổng hợp ................................ 23 Bảng 3.1. Phân bố mẫu ........................................................................................ 50 Bảng 3.2. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR ..................................... 54 Bảng 3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 ..................................................................... 62 Bảng 3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 ..................................................................... 64 Bảng 3.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 3 ..................................................................... 65 Bảng 4.1. Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào quan sát dưới kính hiển vi của 296 chủng vi khuẩn ............................................................................................. 66 Bảng 4.2. Kết quả sàng lọc vi khuẩn bằng các test sinh hóa ............................... 68 Bảng 4.3. Kết quả định danh 29 chủng vi khuẩn bằng kit API CH50B .............. 70 Bảng 4.4. Kết quả định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA .... 74 Bảng 4.5. Kết quả khảo sát khả năng chịu nhiệt của các chủng B. subtilis ......... 77 Bảng 4.6. Kết quả kháng sinh đồ của 21 chủng B. subtilis chọn lọc ................... 79 Bảng 4.7. Khả năng sinh enzyme ngoại bào của 21 chủng B. subtilis ............... 81 Bảng 4.8. Kết quả hoạt lực enzyme amylase, protease, lipase của 10 chủng B. subtilis khảo sát ............................................................................................... 83 Bảng 4.9. Khoảng cách kháng khuẩn của các chủng B. subtilis bằng phương pháp kẻ vạch vuông góc .............................................................................................. 86 Bảng 4.10. Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với E. coli ............................................................................................ 88 Bảng 4.11. Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với S. enterica ...................................................................................... 91 Bảng 4.12. Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với Staphylococcus spp ....................................................................... 93 Bảng 4.13. Kết quả đối kháng trực tiếp của B. subtilis AG27, AG60, VL05 và VL28 đối với Streptococcus spp. ........................................................................ 96 xi Bảng 4.14. Kết quả khảo sát acid- muối mật ở pH 4 và pH 5 ............................. 99 Bảng 4.15. Kết quả khảo sát acid- muối mật ở pH 3 ......................................... 101 Bảng 4.16. Kết quả khảo sát acid- muối mật ở pH 2 ......................................... 103 Bảng 4.17. Kết quả khảo sát khả năng tự bám dính .......................................... 105 Bảng 4.18. Kết quả khảo sát khả năng bám dính với E. coli và S. enterica ...... 107 Bảng 4.19. Khả năng sống của B. subtilis VL28 trong đường ruột gà .............. 109 Bảng 4.20. Tăng trọng, thức ăn tiêu thụ và FCR qua 8 tuần thí nghiệm ......... 112 Bảng 4.21. Tỉ lệ chết, tăng trọng và FCR của gà giai đoạn 1-14 ngày tuổi trong thí nghiệm 2 ................................................................