Ứng dụng công nghệ vi sinh trong sản xuất thuốc trừ sâu sinh học

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN NHÓM 6 SEMINAR ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ VI SINH TRONG SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC An Giang, tháng 09. 2012 TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN NHÓM 6 SEMINAR ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ VI SINH TRONG SẢN XUẤT THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Bằng Hồng Lam Danh sách nhóm 1. Nguyễn Hoàng Nhựt Lynh 2. Bung San Ny Thanh Hồng Anh 3. Hoàng Nguyễn Trung Nghĩa 4. Nguyễn Hoàng An 5. Trương Thị Ngọc Hân 6. Lê Thị Đẹp 7. Nguyễn Ngọc Hồ An Giang, tháng 09. 2012 i Mục lục Nội dung Trang Mục lục ............................................................................................................................................. i Danh sách hình ................................................................................................................................ ii Danh sách bảng ............................................................................................................................... ii Chương 1: Mở đầu ........................................................................................................................ 1 Chương 2: Tổng quan về thuốc trừ sâu sinh học ....................................................................... 2 2.1. Thuốc trừ sâu sinh học là gì? ................................................................................................... 2 2.2. Ưu điểm .................................................................................................................................... 2 2.3. Nhược điểm .............................................................................................................................. 3 Chương 3: Một số chế phẩm sinh học trừ sâu hại trong nông nghiệp ..................................... 4 3.1. Thuốc trừ sâu bằng vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt) .......................................................... 4 3.1.1. Giới thiệu chung về Bt .......................................................................................................... 4 3.1.2. Quy trình sản xuất Bt ............................................................................................................ 5 3.1.2.1. Phương pháp lên men bề mặt ............................................................................................. 5 3.1.2.2. Phương pháp lên men chìm ................................................................................................ 7 3.1.2.3. Quy trình sản xuất Bt ở Việt Nam ...................................................................................... 8 3.2. Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu bằng virus ........................................................................... 8 3.2.1. Giới thiệu chung .................................................................................................................... 8 3.2.2. Công nghệ sản xuất ............................................................................................................... 9 3.3. Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu bằng vi nấm côn trùng ..................................................... 10 3.3.1. Giới thiệu chung .................................................................................................................. 10 3.3.1.1. Một số đặc tính của nấm Beauveria bassiana .................................................................. 10 3.3.1.2. Một số đặc tính của chi nấm Metarhizium (nấm lục cương) ............................................ 11 3.3.2. Quy trình sản xuất ............................................................................................................... 12 3.3.2.1. Phương pháp nuôi cấy chìm ............................................................................................. 12 3.3.2.2. Phương pháp nuôi cấy trên môi trường lỏng không khử trùng, không khuấy trộn và thổi khí .................................................................................................................................................. 12 ii 3.3.2.3. Phương pháp có khử trùng ............................................................................................... 12 3.3.2.4. Phương pháp lên men kết hợp .......................................................................................... 13 Chương 4: Kết luận và kiến nghị ............................................................................................... 14 4.1. Kết luận .................................................................................................................................. 14 4.2. Kiến nghị ................................................................................................................................ 14 Tài liệu tham khảo....................................................................................................................... 15 Danh sách hình Nội dung Trang Hình 1: Một số chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học ............................................................................ 2 Hình 2: Khuẩn lạc Bacillus thuringiensis ....................................................................................... 4 Hình 3: Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm Bt ....................................................................... 5 Hình 4: Sơ đồ nuôi cấy VSV theo phương pháp bề mặt trên khay ................................................. 6 Hình 5: Sơ đồ nuôi cấy VSV theo phương pháp chìm .................................................................... 7 Hình 6: Quy trình sản xuất Bt ở việt Nam ...................................................................................... 8 Hình 7: Nấm Beauveria bassiana ................................................................................................. 10 Hình 8: Sợi nấm mọc trên cơ thể côn trùng .................................................................................. 11 Hình 9: Nấm Metarhizium anisopliae ........................................................................................... 11 Hình 10: Côn trùng nhiễm Metarhizium anisopliae ...................................................................... 12 Hình 11: Quy trình sản xuất nấm bằng phương pháp lên men chìmError! Bookmark not defined. Hình 12: Quy trình sản xuất nấm M. anisopliae theo phương pháp lên men bề mặt (xốp) ... Error! Bookmark not defined. Danh sách bảng Nội dung Trang Bảng 1: Thành phần môi trường nuôi sâu keo da láng không có agar. ......................................... 10 iii 1 Chương 1: Mở đầu Từ những năm 50 của thế kỷ trước, các loại thuốc hóa học trừ sâu bệnh cho cây trồng được dùng phổ biến và rộng rãi. Các loại thuốc này là hợp chất clo và phospho hữu cơ có tác dụng tiêu diệt sâu bệnh, tiêu diệt muỗi rất hữu hiệu. Ban đầu người ta đặt niềm tin vào chúng rất nhiều và hy vọng chúng sẽ là cứu cánh cho ngành Trồng trọt và Trồng rừng ở trên khắp Trái Đất. Song, cùng với thời gian, thuốc trừ sâu hóa học đã lộ ra những nhược điểm không thể khắc phục được, như làm cho sâu hại quen dần và “nhờn thuốc”, đáng lẽ sâu bị giảm đi nhưng lại có chiều hướng gia tăng, thuốc tồn dư ngấm vào đất gây ô nhiễm mội trường đất và nước (đặc biệt là nước ngầm), tồn dư trong sản phẩm lương thực – thực phẩm làm ảnh hưởng tới sức khỏe con người và vật nuôi. Ngày nay, song song với biện pháp hóa học xuất hiện biện pháp sinh học dựa trên cơ sở đấu tranh sinh học với sâu hại, chuột và vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng. Biện pháp sinh học cũng khá đa dạng, gồm có các chế phẩm vi sinh vật diệt sâu hại, các chế phẩm từ tuyến trùng, các loại thiên địch ăn thịt (ong mắt đỏ, mắt vàng,…) diệt những loài côn trùng phá hoại mùa màng. Các chế phẩm vi sinh hoặc các chế phẩm sinh học (với bao gồm ý nghĩa rộng hơn) có tác dụng diệt hoặc gây bệnh cho sâu hại cây trồng. Bệnh côn trùng có tới 80 – 90% số bệnh là do vi sinh vật gây ra. Những bệnh này thường thể hiện côn trùng chết hàng loạt, chấm dứt sự sinh sản, làm hạn chế sự lây lan của các loài sâu hại tiếp theo. Chính vì những nguyên nhân trên, việc nghiên cứu và phát triển các chế phẩm vi sinh diệt trừ sâu hại cây trồng là việc làm cần thiết và mang lại hiệu quả cho nông nghiệp cũng như cuộc sống con người. 2 Chương 2: Tổng quan về thuốc trừ sâu sinh học 2.1. Thuốc trừ sâu sinh học là gì? Thuốc trừ sâu sinh học bao gồm các loại chế phẩm có nguồn gốc sinh học. Chúng được nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng khác nhau theo phương pháp thủ công, bán thủ công hoặc phương pháp lên men công nghiệp để tạo ra những chế phẩm có chất lượng cao, có khả năng phòng trừ được các loại sâu, bọ gây hại cây trồng nông, lâm nghiệp. Thành phần giết sâu có trong thuốc sinh học có thể là các vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, virus) và các chất do vi sinh vật tiết ra (thường là các chất kháng sinh), các chất có trong cây cỏ (là chất độc hoặc dầu thực vật). Với các thành phần trên, thuốc trừ sâu sinh học có thể chia thành hai nhóm chính là:  Nhóm thuốc vi sinh: Thành phần giết sâu là các vi sinh vật như nấm, vi khuẩn, virus.  Nhóm thuốc thảo mộc: Thành phần giết sâu là các chất độc có trong cây hoặc dầu thực vật. Hình 1: Một số chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học 2.2. Ưu điểm Ưu điểm nổi bật nhất của thuốc trừ sâu sinh học là ít độc với người và môi trường. Các chế phẩm vi sinh vật dùng trừ sâu hầu như không độc với người và các sinh vật có ích. Do ít độc với các loài thiên địch nên thuốc sinh học bảo vệ được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên (cân bằng giữa thiên địch và sâu hại), ít gây tình trạng bùng phát sâu hại. Do ít độc với người và mau phân hủy trong tự nhiên, các thuốc sinh học ít để lại dư lượng độc trên nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có 3 độ sạch cao như các loại rau, chè… Muốn có nông sản sạch và an toàn, một biện pháp quan trọng là sử dụng các thuốc sinh học trừ sâu. Ngoài ra, các yếu tố sinh học trừ sâu như các vi sinh vật và thực vật thường có sẵn và rất phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc, vì vậy nguồn khai thác rất dễ dàng và hầu như vô tận. Đồng thời với các chế phẩm được sản xuất theo quy mô công nghiệp, hiện nay người ta vẫn có thể dùng các phương pháp chế biến thô sơ để sử dụng. Có thể ra đồng thu thập các sâu bị chết vì nấm bệnh, nghiền nát trong nước rồi phun lên cây để trừ sâu. Các cây thuốc lá, thuốc lào, hạt xoan, rễ dây thuốc cá… băm nhỏ và đập nát ngâm lọc trong nước để phun cũng rất có hiệu quả. 2.3. Nhược điểm Tuy vậy, một số thuốc sinh học, như các thuốc vi sinh thường thể hiện hiệu quả diệt sâu tương đối chậm hơn so với thuốc hóa học. Sự bảo quản và khả năng hỗn hợp của các thuốc sinh học thường yêu cầu điều kiện cũng chặt chẽ hơn. Bên cạnh đó, so với các loại thuốc trừ sâu hóa học, các chế phẩm sinh học còn có một số yếu điểm như: giá thành cao, thời gian tác dụng lâu hơn, hiệu lực không nhanh như thuốc hóa học nên người dân không nhìn thấy ngay do đó cũng chậm được đưa vào sản xuất trên diện rộng. Nhưng so với các ưu điểm to lớn thì các nhược điểm trên đây của thuốc sinh học là rất nhỏ và hoàn toàn có thể khắc phục được. Vì vậy, thuốc trừ sâu sinh học ngày càng được khai thác sử dụng nhiều. Ở nước ta, ngoài các chế phẩm Bt đã được biết đến tương đối lâu, hiện nay có nhiều chế phẩm mới đã được đăng ký sử dụng. Yêu cầu ngày càng có nhiều nông sản và thực phẩm an toàn phục vụ đời sống cũng là điều kiện quan trọng thúc đẩy sự phát triển của các thuốc sinh học. 4 Chương 3: Một số chế phẩm sinh học trừ sâu hại trong nông nghiệp 3.1. Thuốc trừ sâu bằng vi khuẩn Bacillus thuringensis (Bt) 3.1.1. Giới thiệu chung về Bt Bt là trực khuẩn sinh bào tử, hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc, nhuộm Gram dương. Tế bào đứng riêng rẽ hoặc xếp thành từng chuỗi, chứa tinh thể độc có bản chất protein hình quả trám, kích thước khoảng 0,6 2 m. Bào tử hình trứng dài 1,6 – 2 m, có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng. Mỗi tế bào có kích thước dài từ 3 – 6 m, có phủ tiêm mao không dày, chuyển động được. Hình 2: Khuẩn lạc Bacillus thuringiensis Bt có chứa 4 loại độc tố:  Ngoại độc tố α exotoxin (phospholibara C).  Ngoại độc tố β exotoxin (ngoại độc tố bền nhiệt).  Nội độc tố γ exotoxin (độc tố tan trong nước).  Ngoại độc tố δ exotoxin (tinh thể độc). Vai trò của tinh thể: Là một loại tiền độc tố gây phản ứng với protein và gây chết côn trùng. Cơ chế tác động của tinh thể độc: Côn trùng ăn phải tinh thể độc trong vòng từ 1 – 7h, pH của máu – bạch huyết sẽ tăng lên làm tê liệt đường ruột, khoang miệng và có khi toàn thân, làm thay đổi tính thấm của thành ruột, gây tổn thương hệ thống điều hòa trao đổi chất và cuối cùng dẫn đến chết. Có 2 yếu tố thúc đẩy tinh thể độc gây độc:  pH: Tinh thể độc sẽ bị phân giải trong đường ruột côn trùng khi pH tăng lên trên 8,9 và khi nó bị phân giải thì sẽ thể hiện tính độc. 5  Khả năng sản sinh enzym phân giải protein: Bt có khả năng sản sinh enzym proteaza trong đường ruột của côn trùng, chuyển hóa tiền độc tố thành dạng độc tố đối với cơ thể côn trùng. Triệu chứng côn trùng khi nhiễm độc: Sâu bị nhiễm Bt lúc đầu là tê liệt toàn thân, sau đó sâu ngừng ăn và biến đổi màu sắc từ màu xanh đến màu vàng. Khi chuyển sang màu nâu, nghĩa là sâu đã chết, cuối cùng sâu có màu đen, toàn thân sâu cứng và khô. 3.1.2. Quy trình sản xuất Bt Hình 3: Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm Bt 3.1.2.1. Phương pháp lên men bề mặt Dùng những hạt cơ chất rắn, những hạt này có hoặc không có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng. Các hạt cơ chất này có thể đóng vai trò làm nguồn chất dinh dưỡng, ví dụ như cám lúa mì, bột ngô, bánh hạt bông loại dầu… hoặc chỉ đơn giản đóng vai trò như chất mang vô cơ. Ở phương pháp này, vi khuẩn sẽ mọc trên bề mặt cơ chất và tiếp nhận oxy của không khí để sinh trưởng. Để chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi khuẩn có độ thông thoáng tốt, các loại nguyên liệu không nên xay nghiền quá nhỏ mà nên xay vỡ thành các mảnh 1 – 3 mm, trộn thêm cám trấu hay mùn cưa, bả mía… rồi trãi mỏng ra các khay Nước làm ẩm môi trường có pH 6.5 – 7.5 , hấp vô khuẩn ở 1210C khoảng 1h. Khay được phun dịch nhân giống vào môi trường được đặt trong phòng nuôi có quạt hút, điều chỉnh nhiệt độ ban đầu là 28 – 350C. Nguyên liệu Xử lý nguyên liệu Chuẩn bị môi trường Thanh trùng Các chất dinh dưỡng Nuôi mở rộng (lên men) Nhân giống Giống VK thuần chủng B. thuringiensis Bán thành phẩm Tách lọc, cô, sấy Thành phẩm Phụ gia 6 Nên lật khối môi trường để vi khuẩn phát triển đều khắp. Sau khi kết thúc nuôi cấy, thu gom môi trường ở các khay và sấy ở không khí nóng 40 – 450C cho đến độ ẩm dưới 10% tạo thành phẩm. Hình 4: Sơ đồ nuôi cấy VSV theo phương pháp bề mặt trên khay 7 3.1.2.2. Phương pháp lên men chìm Vi khuẩn được nuôi cấy trong các nồi lên men có thể tích đến vài chục mét khối. Được thổi khí qua máy nén trong điều kiện vô trùng. Thiết bị được trang bị hệ điều khiển tự động hóa việc cung cấp khí, nhiệt độ, điều chỉnh pH. Thời gian nuôi cấy khoảng 2 – 3 ngày và mật độ tế bào có thể lên đến hàng tỷ trong 1 ml dịch nuôi cấy. Dịch nuôi cấy có thể đóng chai dùng trực tiếp ở dạng lỏng hay qua ly tâm để sinh khối rồi thêm phụ gia, sấy… hoàn thành dạng bột. Hình 5: Sơ đồ nuôi cấy VSV theo phương pháp chìm 8 3.1.2.3. Quy trình sản xuất Bt ở Việt Nam Chủng Bt chuẩn Nhân giống cấp 1 trên nồi men nhỏ 10 – 50 lít Nhân giống cấp 2 trên nồi men lớn 500 – 5000 lít Kích thích len men Lọc và ly tâm Thu sinh khối Chất phụ gia Sấy phun + chất phụ gia Đóng chai bảo quản Đóng gói bảo quản Hình 6: Quy trình sản xuất Bt ở việt Nam Những năm 1989 – 1996, Viện Công nghiệp thực phẩm đã phối hợp với Viện Bảo vệ thực vật sản xuất thuốc trừ sâu Bt từ chủng Kurstaki 3a3b của Úc và được ứng dụng ở một số xã thuộc huyện Hoài Đức (Hà Tây cũ), xã Mai Dịch, Tây Tựu, huyện Từ Liêm (Hà Nội) đạt hiệu quả cao. Sau đó việc sản xuất bị chững lại từ cuối 1996 – 2000. Vài năm gần đây, thuốc trừ sâu vi sinh Bt đã được sản xuất trở lại trên quy mô nhỏ lẻ ở Viện Công nghiệp thực phẩm, Viện Công nghệ sinh học,… Tuy nhiên, thuốc Bt sản xuất ra chất lượng vẫn chưa ổn định và số lượng chưa đủ để đáp ứng yêu cầu đối với riêng cây rau tại một vùng chuyên canh ở một số thành phố lớn. 3.2. Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu bằng virus 3.2.1. Giới thiệu chung Một số nhóm virus có khả năng gây bệnh cho côn trùng:  Nhóm Baculovirus, họ Baculoviridae  Nhóm Cytoplasmis Polyhedrosis virus (CPV), họ rioviridae 3% giống T = 30 0 C, 48h 9  Nhóm entomopox virus (EV), họ Poxviridae  Nhóm Irido virus (IV), họ Iridoviridae  Nhóm Denso virus (DV), họ Parvoviridae  Nhóm Virus ARN, họ Picornaviridae  Nhóm Sigma virus, họ Rhabdoviridae Mỗi nhóm virus đều có hình dạng, kích thước và đặc tính khác nhau, nhưng một đặc điểm quan trọng của virus là tác nhân gây bệnh mang tính chuyên tính, mỗi loại virus đều có phổ kí chủ riêng. Độc tố của virus côn trùng là các thể vùi tuỳ từng loại sâu mà các thể vùi có khác nhau, cụ thể là với sâu có virus đa diện nhân (NPV- Nuclear Polyhedrosis Virus) thì các thể vùi là PIB. Cơ chế gây bệnh: Virus lẫn trong thức ăn, đường tiêu hoá virus xâm nhiễm vào cơ thể côn trùng đã thực hiện một quá trình phá huỷ toàn bộ chức năng trong dịch ruột của sâu với cơ chế như sau: Virus  Đi vào ruột  Thể vùi giải phóng virion  Xâm nhập vào huyết tương  Tiếp xúc với tế bào máu  Xâm nhập vào cơ thể  Gây bệnh côn trùng. 3.2.2. Công nghệ sản xuất Việc sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu có liên quan mật thiết đến việc nuôi sâu làm vật chủ nhân bản virus. Đây chính là nguyên tắc cơ bản cho việc sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh.  Nuôi sâu bằng thức ăn tự nhiên: Sử dụng các dụng cụ như xô, chậu, vải màn… để đựng các loại thức ăn tự nhiên. Sau khi thu thập sâu hại về mang thả vào các dung cụ nuôi trên để trong nhà thoáng mát, kê cáo tránh kiến, gián, chuột… Hằng ngày thay thức ăn tươi mới. Khi sâu đạt tuổi 3 – 4 thì sử dụng nguồn virus tinh để nhiễm. Sau 2 – 3 ngày thu lại nguồn sâu bị chết do virus cho vào lọ thủy tinh, đem ủ trong 3 – 5 ngày. Sau đó nghiền, lọc và phun ngay trên đồng ruộng.  Nuôi sâu bằng thức ăn nhân tạo: Trên cơ sở nghiên cứu môi trường thức ăn nhân tạo có thành phần giống thức ăn tự nhiên, đảm bảo cho sâu khỏe, phát triển tốt, quá trình sản xuất cho tỷ suất nhân cao, tỷ lệ còi cọc thấp, trứng nở cao, lượng trứng nở ra lớn,… Mục đích là thu được lượng sâu lớn làm nguồn sản xuất virus. 10 Bảng 1: Thành phần môi trường nuôi sâu keo da láng không có agar. TT Thành phần Khối lượng (g) TT Thành phần Khối lượng (g) 1 Bột ngô 100 6 Axit accorbic 10 2 Bột đậu xanh 150 7 Axit benzoic 5 3 Bột đậu tương 30 8 Formalin 2 ml 4 Bã đậu 30 9 Nước 1000 ml 5 Men bia 30 Phương pháp: Đun sôi nước rồi cho các nguyên liệu theo thứ tự từ 1 đến 8 rồi khuấy đều, để nguội rồi cho sâu keo da láng ăn. 3.3. Công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu bằng vi nấm côn trùng 3.3.1. Giới thiệu chung Có rất nhiều loài nấm có khả năng gây bệnh cho côn trùng nhưng hiện nay trên thế giới và cả nước ta, các nhà khoa học chỉ mới tập trung nghiên cứu 2 chi chính là Beauveria và Metarhizium 3.3.1.1. Một số đặc tính của nấm Beauveria bassiana Chi Beauverra có 3 loại có khả năng diệt côn trùng là: Beauveria bassiana (Bb), Beauveria tenella, Beauveria brongniartii. Trong đó tỉ lệ kí sinh trên côn trùng nhiều nhất là loài Beauveria bassiana (80% - 90%). Đặc điểm hình thái của nấm Beauveria bassiana: Sinh ra bào tử trần đơn bào có đường kính từ 1 – 4 m , không màu, hình trứng, sợi nấm dài từ 3 – 5 m, các bào tử trần phân nhánh, ngọn bào tử có hình hẹp zích zắc không đều. Hình 7: Nấm Beauveria bassiana 11 Độc tố của nấm Beauveria: là Boverixin, vòng Depxipeptit