Vi sinh vật môi trường - Vi sinh vật trong sản xuất rượu vang

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ TÀINGUYÊN Z l Z MÔN: VI SINH VẬT MÔI TRƯỜNG BÁO CÁO CHUYÊN ĐỀ VI SINH VẬT TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG GV: ThS NGUYỄN NGỌC TÂM HUYÊN NHÓM: LỚP DH10QM 1/ LÊ VĂN ĐỒNG (10149045) 2/ NGUYỄN VŨ LINH (10149099) 3/ HỒNG HẢI VINH (10149248) 4/ LÊ THỊ HỘI (10149070) 5/ BÙI KIM THÀNH (10149175) MỤC LỤC TRANG CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ 3 I.1.Tình hình chung 3 I.2. Lịch sử hình thành và phát triển của rượu vang 3 I.3. Giới thiệu về công nghệ lên men 4 I.4. Mục tiêu 4 CHƯƠNG II ỨNG DỤNG VSV TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG 12 II.1. Sơ lược về quá trình lên men 5 II.2. Nguyên liệu 12 II.3. Vi Sinh Vật Trong Quá Trình Sản Xuất Rượu Vang 17 II.4. Môt số tiêu chuẩn chọn và theo dõi quá trình lên men 26 II.5. Một số yếu tố ảnh hưởng tới nấm men trong quá trình sản xuất rượu vang. 28 II.6. Phân loại rượu vang và tác dụng của rượu vang 29 II.7. Bảo quản rượu vang 34 CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 CHƯƠNG I: ĐẶT VẤN ĐỀ I.1.Tình hình chung Ngày nay, khi nền kinh tế ngày càng phát triển, mức sống con người được nâng cao thì nhu cầu ăn uống của con người ngày càng được quan tâm và đòi hỏi các mặt hàng không những phải đa dạng phong phú mà còn phải có tính dược phẩm, dinh dưỡng. Hiện nay, các thức uống chế biến từ các loại trái cây đang có xu hướng tiêu thụ ngày càng cao trên thế giới. Do nó có nhiều ưu điểm so với các loại nước uống khác: chứa nhiều vitamin, muối khoáng, các dạng đường đơn giản dễ tiêu hóa, có hương vị thơm ngon tự nhiên hấp dẫn; vừa có giá tri dinh dưỡng cao vừa có tác dụng chữa bệnh, có thể chống ngô độc, chống ung thư,… Thức uống trái cây có nhiều dạng khác nhau về tính chất sản phẩm và công nghệ chế biến như nước trái cây tự nhiên, necta quả, nước quả cô đặc, sirô quả, rượu vang,… Trong đó rượu vang nho là loại thứ uống rất được ưa chộng với hương vị thơm ngon và tính giải khát. Đây là nước uống lên men từ một phần dịch trái cây. Nó có độ cồn thấp, giàu chất dinh dưỡng. Việc chế biến rượu vang từ nho được thực hiện rất lâu đời ở nhiều nơi trên thế giới nhất là các nước Châu Âu đặc biệt là Pháp. Nhưng ở nước ta, sản phẩm rượu vang vẫn chưa được quan tâm nhiều, qui mô sản xuất chủ yếu dưới dạng thủ công, lên men tự nhiên chưa có cơ sở khoa học cũng như phương pháp hợp lí dẫn đến năng suất cũng như chất lượng sản phẩm chưa cao. I.2. Lịch sử hình thành và phát triển của rượu vang •Các nhà khảo cổ học cho rằng, rượu vang có xuất xứ từ khu vực Capcazơ và Trung Đông khoảng 8000 năm về trước. •Khoảng năm 2000 TCN, sản xuất rượu vang du nhập tới Hy Lạp và sau đó truyền bá khắp Địa Trung Hải bởi đế chế La Mã. •Đầu thế kỉ XVI, các nhà thám hiểm Châu Âu đã mang nho tới Châu Mỹ. Năm 1530, những người Tây Ban Nha xâm chiếm Trung và Nam Mỹ bắt đầu trồng nho ở Mexico, Argentina, Peru và Chile. Năm 1655, nho được người Hà Lan trồng trọt trên thuộc địa của mình tại Mũi Hảo Vọng (Nam Phi). Việc trồng nho ở Úc và New Zealand được tiến hành vào năm 1813. Ngành sản xuất rượu vang được phát triển ở tất cả các nơi mà thực dân Châu Âu đặt chân tới. Danh từ rượu vang được dùng để chỉ loại rượu lên men từ dịch ép trái cây (nho, dâu, thơm, táo, lê,…) với một số chủng nấm men. Rượu vang thu được không qua chưng cất, có hương vị thơm ngon của trái cây tự nhiên, có độ cồn nhẹ (10-15%) là loại nước giải khát thơm ngon giàu chất bổ dưỡng. Rượu vang là loại rượu không chưng cất có truyền thống lâu đời được sản xuất nhờ sự lên men bởi chủng tự nhiên S.cerevisiae hay do các loại nấm men tự nhiên như Saccharomyces sp, Zygosaccharomyces sp,… Ngoài ra còn có các loại rượu khác như sake, rượu cần, rượu cognac, rượu đế,rượu nếp than … I.3. Giới thiệu về công nghệ lên men 1.3.1. Công nghệ lên men Việc nuôi cấy vi sinh vật với quy mô lớn (trong khoảng 10lít đến 1.000.000lít) thường được gọi là lên men công nghiệp (industrial fermentation). Công nghệ lên men công nghiệp được hình thành từ cuối thể kỉ XIX và phát triển mạnh trong nửa cuối thế kỉ XX với hàng loạt thương phẩm. R Các công đoạn chính của quá trình lên men: - Trước khi lên men: Xử lí, chế biến, phối trộn và khử trùng nguyên liệu ban đầu. - Lên men: trong bioreactor được thông khí tốt (cần phá bọt), trong dịch lên men diễn ra quá trình nguyên khối, truyền nhiệt, tăng sinh khối tế bào và điều chỉnh hoạt sinh học để tạo nhiều sản phẩm mục tiêu. - Sau lên men: Tách tế bào bằng ly tâm hay lọc, phải phá vỡ tế bào để giải phóng chất nội bào; tủa, tinh sạch các chất; thực hiện phản ứng bổ sung tạo đúng thương phẩm; tinh chế; sấy; thương phẩm ở dạng hoàn chỉnh được bảo quản; tận dụng phụ phế phẩm. I.3.2. Ứng dụng của quá trình lên men Công nghệ lên men có ứng dụng rất rộng rãi thể hiện ở việc có rất nhiều sản phẩm được tạo ra từ công nghệ lên men. Sau đây là một số sản phẩm từ công nghệ lên men. 1/ Trong sản xuất sinh khối nhờ vi sinh vật 2/ Sản xuất men bánh mì 3/ Sản xuất phân vi sinh 4/Chế phẩm diệt côn trùng (Insecticides) 5/ Chế phẩm trợ sinh 6/Trong công nghiệp vaccine 7/ Công nghệ sản xuất nhiên liệu 8/ Sản xuất Metabolite sơ cấp 9/Sản xuất thuốc kháng sinh 10/Sản xuất các biopolymer và biosurfeactan 11/Công nghệ sinh học khai khoáng 12/Sản xuất các biopolymer và biosurfeactant 13/Công nghiệp rượu bia và cồn nhiên liệu Hình 1: Nhà máy sản xuất ethanol quy mô nhỏ. I.4. Mục tiêu Thông qua chuyên đề này, chúng ta sẽ tìm hiểu khái quát về công nghệ lên men, cơ chế của quá trình lên men, những ứng dụng trong thực tế đời sống,… Qua đó, hiểu rõ hơn về rượu vang, quá trình sản xuất cũng như thành phần và giá trị dinh dưỡng của rượu vang - một trong những ứng dụng của công nghệ lên men. CHƯƠNG II ỨNG DỤNG VSV TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG II.1. Sơ lược về quá trình lên men a/Khái niệm Lên men là một quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học. Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau. Tuy nhiên có hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí và lên men hiếu khí. b/Quá trình lên men. Giống vi sinh vật Nhân giống (cấp 1, 2, 3…) Lên men Kiểm tra sự tạo thành sản phẩm Thu hồi sản phẩm Khử trùng môi trường Chế tạo môi trường Các giai đoạn chính trong quá trình lên men Một số khâu chính trong quy trình Giống vi sinh vật Trong lên men công nghệ, bên cạnh có một quy trình hợp lý, thì vấn đề giống là khâu quan trọng, quyết định giá trị kinh tế của quy trình sản xuất. Người ta sử dụng rộng rãi một phổ rộng gồm nhiều loại vi sinh vật thuộc nhóm Procaryote (vi khuẩn, xạ khuẩn,…) và Eucaryote (nấm men, tảo,…). - Tiêu chuẩn chọn giống + Năng suất sinh tổng hợp một chất nào đó hay tạo sinh khối với hiệu suất cao. + Có khả năng sử dụng được các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm. + Trong quá trình lên men không tạo sản phẩm phụ không mong muốn. + Ít mẫn cảm đối với sự tập nhiễm do vi sinh vật khác và phage. + Có sản phẩm hay sinh khối có thể tách dễ dàng ra khỏi môi trường dinh dưỡng. - Các phương pháp giữ giống chính + Bảo quản trên môi trường thạch, định kỳ cấy chuyền. + Giữ giống trong cát hoặc đất sét vô trùng. + Giữ giống bằng phương pháp lạnh đông. + Giữ giống bằng phương pháp đông khô. Nhân giống vi sinh vật - Giống là tế bào sinh dưỡng: sử dụng phương pháp nuôi cấy dịch thể (nuôi cấy chìm). - Giống là bào tử (đối với xạ khuẩn và nấm mốc): Thông thường người ta thực hiện nhân giống thu bào tử trên môi trường đặc (nuôi cấy bán rắn có cám, bột bắp, thóc, trấu,…). Lên men Đây là khâu quyết định kết quả của một quá trình lên men. Để thực hiện lên men, người ta thường sử dụng hai phương pháp chủ yếu sau: lên men bề mặt và lên men chìm. - Lên men bề mặt: thực hiện nuôi cấy vi sinh vật trên bề mặt môi trường dịch thể hoặc môi trường bán rắn. + Nuôi cấy bề mặt sử dụng môi trường dịch thể (dùng cho vi sinh vật hiếu khí): Phương pháp lên men này yêu cầu thiết bị đơn giản, nhưng đòi hỏi diện tích sử dụng lớn, khó tự động hóa quy trình sản xuất nên ít được sử dụng. + Nuôi cấy bề mặt sử dụng môi trường bán rắn hay lên men bán rắn (có thề dùng cho vi sinh vật hiếu khí và kị khí). Phương pháp này được các nước đang phát triển sử dụng nhiều. Nguyên liệu: các loại hạt, các loại phế liệu,… Phương pháp này sử dụng để: sản xuất kháng sinh, sản xuất enzym từ nấm mốc, đường hóa tinh bột để sản xuất rượu ethanol từ nấm men. - Lên men chìm + Dùng cho cả vi sinh vật hiếu khí và kị khí. + Trong quá trình lên men, liên tục theo dõi và thực hiện một số công việc sau Thực hiện quá trình khuấy đảo và sục khí. Theo dõi sự tạo bọt trong lên men và có biện pháp phá bọt. Điều chỉnh pH của môi trường lên men. Theo dõi và điểu chỉnh nhiệt độ của môi trường lên men. Tiếp thêm nguyên liệu và bổ sung các chất tiền thể. Thu hồi sản phẩm Các sản phẩm của quá trình tổng hợp vi sinh vật thường được tích lũy hoặc bên trong tế bào hoặc ở trong pha lỏng của dịch nuôi cấy. Cũng có trường hợp sản phẩm vừa nằm trong tế bào, vừa nằm trong pha lõng của dịch nuôi cấy. Việc đầu tiên sau khi kết thúc lên men là tìm cách tách tế bào vi sinh vật ra khỏi pha lõng của dịch lên men. - Nếu là các vi sinh vật có cấu tạo sợi như nấm, tảo…dùng phương pháp lọc, vớt. - Nếu là các vi sinh vật đơn bào, có kích thước tế bào nhỏ như nấm men, vi khuẩn…dùng phương pháp li tâm thường hay li tâm tốc độ cao… Bản chất hóa học của sản phẩm quyết định phương pháp xử lý tiếp theo. Thông thường người ta sử dụng các phương pháp sau: chiết rút, hấp phụ, kết tủa, kết tinh, điện di,… c/ Quá trình lên men rượu Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol và CO2. Quá trình lên men rượu chia làm 2 thời kỳ chính: - Thời kỳ phát triển sinh khối - Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2 Glucose Hexokinaza Glucose – 6 – phosphat Photphoglucoza isomeraza Fructose – 6 – phosphat PhosphoFructokinaza Fructose – 1,6 – diphosphat Aldolaza Triophosphat izomeraza Glyceraldehyd – 3 – phosphat Dihydro aceton phosphat Glyceraldehyd phosphatdehydrogenaza Acid – 1,3 – diphosphoglyceric Phosphoglyceratkinaza Acid – 3 – phosphoglyceric Phosphoglycerat-mutaza Acid – 2 – phosphoglyceric Enoiaza Acid phosphoenolpyruvic Pyruvat kinaza Acid – enol – pyruvic Acid pyruvic Pyruvate – decarboxylaza Ethanal Aldodeshydrogenaza Ethanol Hình 2: Cơ chế phân hủy đường trong tế bào nấm men d/Quá trình sản xuất rượu vang Hình 3: Công nghệ lên men rượu vang  II.2. Nguyên liệu II.2.1. Nho Trong sản xuất rượu vang, nho là một nguyên liệu truyền thống rất được ưa thích và có giá trị dinh dưỡng cao. Nho được trồng nhiều ở các nước Châu Âu nhất là ở Pháp và Mĩ. Ở nước ta nho cũng đã được trồng ở một số tỉnh miền Trung như Ninh Thuận(chiếm sản lương nhiều nhất)và đang phát triển nghề trồng nho với đầy triển vọng phía trước. Trên quả nho có rất nhiều loại nấm men có mặt một cách tự nhiên là nhân tố chính tham gia vào quá trình sản xuất rượu vang nho lên men tự nhiên truyền thống. Quả nho ép được 85 – 95% dịch quả. Nước nho lên men tạo ra một loại rượu vang có giá trị dinh dưỡng cao, hương vị đặc trưng, thơm ngon và màu sắc rất đẹp. JNho có thành phần hóa học trung bình như sau: - Nước: 70 – 80% - Đường: 10 – 25% (trong đó chủ yếu là glucose, fructose và saccharose) - Acid hữu cơ: 0,5 – 1,7% (chủ yếu là acid malic và factoric) - Protein: 0,1 – 0,9% - Pectin: 0,1 – 0,3% - Khoáng: 0,1 – 0,5% - Vitamin: C, B1, B2, PP - Các hợp chất màu: màu chính là anthocyanin. - Các hợp chất thơm và một số hợp chất khác. JNho là loại quả lí tưởng nhất để lên men chế biến rượu vang vì: - Quả nho có chất lượng, giá trị dinh dưỡng cao, tạo hương vị đậm đà, đặc trưng. - Thành phần hóa học trong dịch nho rất thích hợp cho nấm men phát triển. - Tỉ lệ dịch nước ép được cao. Bảng 1: Thành phần chủ chốt trong dịch quả nho Thành phần Nồng độ, đặc điểm Nguồn cacbon Glucose Fructose Sucrose Pentose Pectins 75 – 150 g/l 75 – 150 g/l Vết Không lên men được bởi Saccharomyces cerevisiae Lượng nhỏ Nguồn nitơ Acid amin tư do Ion ammoni Protein 0,2 – 2,5 g/l Lượng nhỏ thường thiếu cho nấm men Lượng nhỏ Acid hữu cơ Acid tartaric Acid malic 2 – 10 g/l: nấm men rượu vang không dùng được 1 -8 g/l: có thể sử dụng một phần bởi nấm men Khoáng chất P, K, Mg, S, nguyên tố vi lượng Các yếu tố đa lượng và vi lượng đều đầy đủ Vitamin Nồng độ thấp nhưng đủ cho nấm men Những thành phần khác Nồng độ Sulphite thường cao Acid decanoic và octanoic có thể ức chế nấm men Sterol và acid béo không no có thể là yếu tố hạn chế Bảng 2: Thành phần vitamin của nước nho tươi và của rượu vang nho Vitamin Nước nho Rượu vang Trắng, lên men không xác quả Đỏ, lên men có xác quả Thiamine (B1) – microgram Riboflavine (B2) – microgram Acid pantothenic – miligram Pyridoxine (B6) – miligram Nicotinamide (PP) – miligram Biotin (H) – microgram Cobalamine (B12) – microgram Acid P-aminobenzoic – microgram Cholin - miligram 160 – 450 3 – 60 0,5 – 1,4 0,16 – 0,5 0,68 – 2,6 1,5 – 4,2 0 15 – 92 19 – 39 2 – 58 8 – 133 0,55 – 1,2 0,12 – 0,67 0,44 – 1,3 1 – 3,6 0 – 0,16 15 – 133 19 – 27 103 – 245 0,47 – 1,9 0,12 – 0,68 0,13 – 0,68 0,79 – 1,7 0,6 – 4,6 0,04 – 0,1 15 – 133 20 - 43 II.2.2. Nấm men Nấm men là tên chung chỉ nhóm nấm men có cấu tạo và sinh sản bằng cách nảy chồi và phân cắt. Chúng phân bố rộng rãi khắp nơi. Đặc biệt chúng có mặt nhiều ở đất trồng nho và các nơi trồng hoa quả. Ngoài ra thấy chúng có mặt trên trái cây chín, trong nhụy hoa, trong không khí và cả nơi sản xuất rượu vang. Hình dạng và kích thước { Hình dạng tế bào nấm men Nấm men thường có hình dạng khác nhau, thường có hình cầu, hình elip, hình trứng, hình bầu dục và cả hình dài. Một số loài nấm men có tế bào hình dài nối với nhau thành những dạng sợi gọi là khuẩn ty (Mycelium) hay khuẩn ty giả (Pseudo mycelium). Tuy nhiên hình dạng của chúng không ổn định, phụ thuộc vào tuổi của nấm men và điều kiện nuôi cấy. { Kích thước tế bào nấm men Tế bào nấm men thường có kích thước rất lớn gấp từ 5 – 10 lần tế bào vi khuẩn. Kích thước trung bình - Chiều dài: 9 – 10m - Chiều rộng: 2 – 7m Kích thước cũng thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau. Cấu tạo tế bào nấm men Tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ yếu từ các phần cơ bản như sau - Thành tế bào: cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau. Trong đó chủ yếu là: glucan, manan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác như kitin, volutin,… - Màng nguyên sinh chất: gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipit enzyme permeaza… - Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nước, protit, gluxit, lipit và các muối khoáng, enzyme và có các cơ quan trong đó. - Nhân tế bào - Những thành phần – cơ quan con khác: không bào, ty lạp thể, riboxom,… Sự sinh sản của nấm men Nấm men có một số hình thức sinh sản sau: - Sinh sản bằng cách nảy chồi. - Sinh sản bằng cách phân đôi. - Sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử. + Tiếp hợp đẳng giao + Tiếp hợp dị giao + Sinh sản đơn tính Phân loại nấm men Chủ yếu có hai lớp: nấm men thật (Ascomyces) và lợp nấm men giả (Fungi imporfecti) - Lớp nấm men thật (lớp Ascomyces – lợp nấm túi): + Phần lớn nấm men dùng trong công nghiệp thuộc lớp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces. + Giống Endomyces + Giống Schizosaccharomyces - Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti – nấm men bất toàn) + Crytococus (toscula, tornlopsis) + Mycoderma + Eandida + Geotrichum (đã được xếp vào lớp nấm mốc) + Rhodotorula * Quá trình sinh trưởng và phát triển - Sự sinh trưởng Trong quá trình nuôi cấy, trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấm men tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều. - Sự phát triển Các nấm men sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng sinh khối rất lớn sau một thời gian ngắn. Trong trường hợp sinh sản theo phương pháp này thì trong dịch nuôi cấy sẽ không có tế bào già. Vì rằng tế bào được phân chia thành hai cứ như vậy tế bào lúc nào cũng ở trạng thái đang phát triển. Tế bào chỉ già khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng và tế bào không có khả năng sinh sản nữa. Tuy nhiên đa số nấm men sinh sản bằng phương pháp nảy chồi nên hiện tượng phát hiện tế bào già rất rõ. Khi chồi non tách khỏi tế bào mẹ để sống độc lập thì nơi tách đó trên tế bào mẹ tạo thành một vết sẹo. Vết sẹo này sẽ không có khả năng tạo ra chồi mới. Cứ như vậy tế bào mẹ sẽ chuyển thành tế bào già theo thời gian. Để xác định số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời gian hiện nay người ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như: + Xác định số lượng tế bào bằng phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi hay gián tiếp trên mặt thạch. + Đo độ đục của tế bào trong dung dịch nuôi cấy trên cơ sở xây dựng một đồ thị chuẩn của mật độ tế bào… Quá trình sinh trưởng của nấm men trong dịch lên men tĩnh có thể chia làm 5 giai đoạn N t Hình: Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men - Giai đoạn tiềm phát: giai đoạn này tế bào làm quen với môi trường, sinh khối chưa tăng nhiều.( pha lag) - Giai đoạn logarit: đây là giai đoạn phát triển rất nhanh, sinh khối tăng ào ạt, kèm theo sự thay đổi mạnh mẽ của dịch lên men.(log) - Giai đoạn chậm dần: tốc độ sinh trưởng nấm men giảm dần, thành phần dịch lên men còn lại ít, các sản phẩm lên men được tích tụ nhiều. - Giai đoạn ổn định: số lượng tế bào nấm men không tăng nữa, tốc độ sinh sản bằng tốc độ chết. - Giai đoạn chết: tốc độ chết tăng nhanh, tốc độ sinh sản rất ít do đó số lượng tế bào nấm men giảm dần. II.3. Vi Sinh Vật Trong Quá Trình Sản Xuất Rượu Vang II.3.1.Khái quát về vi sinh vật trong quá trình sản xuất rượi Vang Trong nước nho tươi có những nhóm vi sinh vật khác nhau từ môi trường xung quanh, có chủ yếu ở vỏ quả, thân, cuống và thiết bị. Phần lớn trong phức hệ này là nấm mốc (76 – 90%), nấm men (9 – 22%), số còn lại chiếm tỷ lệ thấp là vi khuẩn không sinh bào tử hoặc có bào tử, xạ khuẩn và Micobacter. Độ acid của nước nho khá cao (pH = 2,7 – 3,8) là điều kiện không thuận lợi cho các vi sinh vật phát triển. Ở môi trường có độ chua lớn thường chỉ thích hợp với nấm mốc và nấm men. Nấm men trong nước quả tươi thường ít hơn nấm mốc, nhưng nấm men lại có khả năng phát triển và tăng sinh khối nhanh trong điều kiện thiếu oxy hoặc kỵ khí, đồng thời lên men tích tụ cồn. Điều kiện kỵ khí và trong dung dịch có cồn làm ức chế nấm mốc. Chính trong điều kiện này nấm men đã cạnh tranh và phát triển chiếm ưu thế trong quá trình lên men tự nhiên. Trong các loài nấm men cũng cạnh tranh nhau chỉ có các loài có khả năng đồng hóa đường nhanh tạo độ cồn cao mới dần dần chiếm ưu thế ở giai đoạn lên men chính và lên men phụ. Hệ nấm men trong giai đoạn đầu lên men nước nho là kloeckera–nấm men có dạng hình chùy chiếm phần lớn và hoạt động tích tụ được 2 – 4 độ cồn rồi ngừng hoạt động và chết dần, sau đó là nấm men rượu vang thực thụ (Saccharomyces cerevisiae và Saccharomyces oviformics) phát triển và đóng vai trò chủ yếu trong lên men chính và lên men phụ. Vi sinh vật đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình lên men rượu vang. Cả nấm men và vi khuẩn đều có thể đóng vai trò tích cực và tiêu cực trong sản xuất. Mật độ tế bào vi sinh vật trên quả nho trung bình vào khoảng 103 – 105cfu/g. Vi sinh vật liên quan tới rượu vang có thể được chia làm hai dạng: dạng nội sinh (từ quả nho, bề mặt thiết bị) và dạng đưa vào (các chủng giống khởi động phục vụ lên men). Trong lên men truyền thống, người ta chỉ sử dụng nhóm vi sinh vật nội sinh, tức nhóm có sẵn trong nguyên liệu nho và quan trọng hơn là nhóm vi sinh vật trên bề mặt thiết bị (với thành phần chủ chốt là Saccharomyces cerevisiae). Những vi sinh vật chính có trên bề mặt quả nho bao gồm: + Nấm men: chủ yếu là Kloeckera/Hanseniaspora, và một lưọng nhỏ các đại diện như Candida, Metchnikowia, Cryptococcus, Pichia, Kluyveromyces và một lượng rất nhỏ Saccharomyces cerevisiae. + Vi khuẩn lactic: Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococ