Xây dựng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bưởi bằng phương pháp sinh học phân tử

i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  TRẦN THỊ MINH TÚ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY BƢỞI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 ii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY BƢỞI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN TRẦN THỊ MINH TÚ KHÓA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 iii MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY  AMPLIFICATION MOLECULAR ENGINEERING TO IDENTY CITRUS CANKER BACTERIA GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr. LE DINH DON TRAN THI MINH TU TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 iii LỜI CẢM ƠN Xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. - Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy luôn tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt bốn năm qua. - TS. Lê Đình Đôn đã tận tình hƣớng dẫn và động viên tôi trong thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - TS. Bùi Minh Trí và anh Nguyễn Văn Lẫm và các anh chị phụ trách phòng Hóa Sinh thuộc Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Đại học Nông Lâm Tp. HCM đã tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian làm đề tài. - Toàn thể lớp CNSH 28 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Thành kính ghi ơn ông bà, cha mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo con đƣợc nhƣ ngày hôm nay, cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo mọi điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Chân thành cảm ơn. Tp. HCM, tháng 08 năm 2006 Sinh viên Trần Thị Minh Tú iv TÓM TẮT TRẦN THỊ MINH TÚ, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2006. “XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY BƢỞI BẰNG PHƢƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ”. Giáo viên hƣớng dẫn: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN Đề tài đƣợc thực hiện trên đối tƣợng là vi khuẩn Xanthomonas spp. Đây là vi khẩn có khả năng gây bệnh trên nhiều cây trồng khác nhau, ảnh hƣởng rất lớn đến năng suất của cây trồng. Chúng tôi sử dụng các kỹ thuật nông học, phƣơng pháp sinh học phân tử nhằm định danh dòng Xanthomonas sp gây bệnh loét trên cây bƣởi mục tiêu hiểu rõ bản chất sinh học của dòng gây bệnh, để dễ dàng cho việc đƣa ra các biện pháp phòng trừ bệnh do vi khuẩn này gây ra. Đề tài đƣợc thực hiện tại phòng thực tập Bệnh cây khoa Nông Học và Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm trƣờng Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, từ 06/02/06 đến 06/08/06. Nội dung nghiên cứu: 1. Phân lập, nuôi cấy, xác định gram, quan sát hình thái trên môi trƣờng PGA, YDC. 2. Chủng bệnh nhân tạo để kiểm tra lại triệu chứng gây bệnh của dòng vi khuẩn phân lập đƣợc. 3. Thực hiện sắc ký bản mỏng dựa vào sắc tố đặc trƣng để nhận Xanthomonas sp. . 4. Tiến hành nhân sinh khối, ly trích DNA tổng số. 5. Thực hiện phản ứng PCR trên 16s-23s rDNA ITS với cặp primer Xan1330 và Xan332. 6. Thực hiện phản ứng PCR trên vùng hrpW gen với cặp mồi chuyên biệt XACR và XACF cho phép xác định nhanh Xanthomonas axonopodis pv. citri. v Kết quả đạt đƣợc: 1. Phân lập đƣợc 4 dòng vi khuẩn, tất cả là gram âm, trên môi trƣờng YDC phân thành 2 nhóm vàng sữa và vàng chanh.. 2. Tất cả 4 dòng phân lập đƣợc đều tạo vết thƣơng sau khi chủng bệnh nhân tạo, triệu chứng bệnh có khác nhau. 3. Kết quả sắc ký có 1 dòng (XBDL1) có sắc tố phát sáng rõ sau khi chụp UV. 4. Thực hiện thành công phản ứng PCR trên 16s-23s rDNA ITS với cặp primer Xan1330 và Xan332 cho sản phẩm 1,1 kb. 5. Không thực hiện đƣợc phản ứng PCR trên vùng hrpW gen với cặp mồi chuyên biệt XACR và XACF. vi MỤC LỤC TRANG Trang bìa Trang tựa Lời cảm ơn ............................................................................................................. iii Tóm tắt ................................................................................................................... iv Mục lục .................................................................................................................. v Danh sách các hình ................................................................................................ viii Danh sách các bảng ............................................................................................... ix Danh sách các chữ viết tắt ..................................................................................... xi Phần 1. GIỚI THIỆU .......................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................... 1 1.2. Mục đích ......................................................................................................... 1 1.3. Yêu cầu ........................................................................................................... 2 1.4. Giới hạn của đề tài ......................................................................................... 2 Phần 2. TỔNG QUAN ......................................................................................... 3 2.1. Sơ lƣợc về nhóm cây có múi trên thế giới và trong nƣớc ............................. 3 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây bƣởi ................................................................ 3 2.1.2. Giá trị cây ăn quả có múi ở thế giới và trong nƣớc .................................... 3 2.1.3. Tình hình sản xuất cam quýt ở Việt Nam ................................................... 4 2.1.4. Tình hình sản xuất cam quýt trên thế giới .................................................. 4 2.2. Bệnh loét cam Xanthomonas citri (Hasse-Dowson) ..................................... 5 2.2.1. Triệu chứng bệnh ....................................................................................... 5 2.2.2. Đặc điểm gây bệnh của chủng vi sinh vật gây bệnh (X. a. pv. citri) ........... 7 2.3. Sơ lƣợc vùng rDNA-ITS ................................................................................ 8 vii 2.3.1. Giới thiệu vùng rDNA ................................................................................. 8 2.3.2. Vùng rDNA-ITS trên Xanthomonas ssp. ................................................... 9 2.4. Sơ lƣợc về hrpW gen ..................................................................................... 9 2.5. Những cứu về bệnh loét cam quýt trên Thế Giới và Việt Nam ................... 11 2.5.1. Trên Thế Giới ............................................................................................. 11 2.5.2. Tại Việt Nam ............................................................................................. 12 2.6. Quy trình định danh Xanthomona sp. . .......................................................... 12 2.6.1. Quy trình định danh Xanthomonas sp. theo phƣơng pháp nuôi cấy, thực hiện phản ứng sinh hóa ................................................................. 12 2.6.2 Quy trình định danh theo phƣơng pháp phân tử .......................................... 13 2.7 Phƣơng pháp PCR .......................................................................................... 13 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ....................................................... 16 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................. 16 3.2. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 16 3.3 Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 16 3.4. Phƣơng pháp tiến hành .................................................................................. 17 3.4.1 Phân lập, nuôi cấy trên 2 môi trƣờng PGA và YDC, xác định Gram âm hay Gram dƣơng các dòng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi ........ 17 3.4.2. Chủng bệnh nhân tạo .................................................................................. 18 3.4.3. Thực hiện sắc ký bản mỏng định danh vi khuẩn ........................................ 18 3.4.4. Phƣơng pháp ly trích DNA tổng số của vi khuẩn ...................................... 20 3.4.5. Khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS và vùng hrpW gen .......................... 21 3.4.5.1 Khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS dòng vi khuẩn phân lập với cặp mồi Xan1330 và Xan332 ......................................................................... 22 3.4.5.2 Khuếch đại đoạn hrpW gen dòng vi khuẩn phân lập với cặp mồi XACF và XACR .............................................................................. 23 3.5.6. Điện di kiểm tra sản phẩm ly trích và sản phẩm PCR ................................ 23 viii Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 25 4.1. Phân lập, xác định gram vi khuẩn gây bệnh loét ở cây bƣởi da láng và bƣởi đƣờng cam ................................................................... 25 4.2 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh loét trên môi trƣờng PGA và YDC ...... 25 4.2. Chủng bệnh bệnh nhân tạo ............................................................................. 26 4.3. Sắc ký định danh vi khuẩn gây bệnh ............................................................ 28 4.4 Ly trích DNA tổng số .................................................................................... 28 4.5. Thực hiện PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan 332 trên vùng ITS ................ 29 4.6 Thực hiện PCR với cặp mồi XACR và XACF trên hrpW gen ...................... 29 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 32 5.1. Kết luận .......................................................................................................... 32 5.2. Đề nghị ......................................................................................................... 32 Phần 6.TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................... 33 Phần 7. PHỤ LỤC ............................................................................................... 35 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1. Triệu chứng bệnh loét trên lá bƣởi Da Láng .................................................. 6 Hình 2.2. Triệu chứng bệnh loét trên trái bƣởi Da Láng ............................................... 6 Hình 2.3. Triệu chứng bệnh loét trên cành bƣởi Da Láng ............................................. 7 Hình 2.4. Cấu trúc vùng 16s-23s rDNA ITS trên Xanthomonas ssp ........................... 10 Hình 2.5. Sơ đồ hình cây thể hiện mối tƣơng quan giữa các dòng Xanthomonas ssp. dựa trên vùng 16s-23s rDNA ITS ................................................................................ 10 Hình 3.1(a) Tấm sắc ký vừa nhỏ dung dịch sắc tố ..................................................... 19 Hình 3.1(b). Tấm sắc ký ngâm methanol trong bình hút ẩm ...................................... 19 Hình 4.1. Sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng PGA nhiệt độ 28oC ................................................................................................................ 25 Hình 4.2. Sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng YDC ở nhiệt độ 28oC ................................................................................................................ 26 Hình 4.3. Các triệu chứng bệnh sau khi chủng bốn dòng phân lập đƣợc trên lá non bƣởi Da Láng quan sát dƣới kính hiển vi độ phóng đai 4x10 lần ............................... 27 Hình 4.4. Kết quả sắc ký trƣớc ................................................................................... 28 Hình 4.5. DNA tổng số ly trích theo quy trình 3.2.4.4 ............................................... 29 Hình 4.6. Kết quả diện di sản phẩm PCR đoạn 16s-23s rDNA ITS với cặp mồi Xan1330 và Xan332 ..................................................................................................... 29 Hình 4.7. Sơ đồ các bƣớc cơ bản định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi theo phƣơng pháp sinh học phân tử...................................................................................... 31 x DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1. Môi trƣờng phân lập một số loài X. campestis ............................................. 14 Bảng 2.2. Đặc tính sinh hóa Xanthomonas sp. ............................................................. 14 Bảng 3.3.Thành phần dung dịch đệm TE...................................................................... 20 Bảng 3.2. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồiXan1330 và Xan332 .................... 22 Bảng 3.3. Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan332 .............. 22 Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi XACF và XACR ........................... 23 Bảng 3.5. Chu trình nhiệt phản ứng với cặp mồi XACF và XACR ............................. 23 Bảng 4.2. Hình thái vi khuẩn đƣợc phân lập từ bƣởi Da Láng và bƣởi Đƣờng Cam ..................................................................................................... 25 Bảng 4.3. Khả năng nhiễm bệnh của 4 dòng XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 ........................................................................... 27 xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ITS : Internal Transcribed Spacer – vùng dịch mã trong nhân DNA : Deoxyribonucleotide Acid rDNA : ribosome DNA PCR : Polymerase chain reaction – phản ứng chuỗi Polymerase PGA : Potato Glucose Agar STT : Số thứ tự ng : nano gram µM : micro mol TE : Tris EDTA µg : micro gram µl : micro lit TAE : Tris Acetic EDTA bp : base pair dNTP : deoxyribonucleotide triphosphate ISGs : intraspecific groups SDS : sodium dodecyl sulfate EDTA : ethylenediamine – tetraacetic acid IGS : intergenic spacer 1 Phần 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Nƣớc ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa rất thuận lợi cho nhiều loại cây nhiệt đới phát triển. Đặc biệt các loại cây ăn quả rất đa dạng và phong phú về chủng loại. Trong đó bƣởi (Citrus grandis L Rutaceae) là loại cây ăn quả thuộc nhóm cây có múi đƣợc trồng phổ biến và lâu đời tại các vùng đông Nam Bộ với các vùng trồng bƣởi lâu đời và nổi tiếng nhƣ Vĩnh Cửu (Đồng Nai), Tân Uyên (Bình Dƣơng). Cây bƣởi có tuổi thọ lâu hơn các loại cây có múi khác, thời gian bảo quản cũng lâu hơn. Bƣởi còn là loại quả giàu vitamin đƣợc thị trƣờng trong nƣớc cũng nhƣ ngoài nƣớc ƣa chuộng về hƣơng vị cũng nhƣ dinh dƣỡng nên ngƣời trồng bƣởi có thu nhập cao và ổn định hơn so với các loại cây nông nghiệp khác. Vì vậy, cây bƣởi đã góp phần cải thiện và nâng cao đời sống của ngƣời dân. Tuy nhiên cho đến nay diện tích trồng bƣởi không tăng. Mặt khác, giống bƣởi năng suất và phẩm chất rất tốt là cây Bƣởi Đƣờng Da Láng lại giảm rõ rệt. Nguyên nhân chính là do bị nhiễm bệnh nghiêm trọng do vi khuẩn Xanthomonas sp. gây nên. Vi khuẩn không ảnh hƣởng nhiều đến chất lƣợng quả nhƣng gây nên những vết sần sùi trên mặt trái làm mất vẻ thẩm mỹ nên rất khó tiêu thụ trên thị trƣờng. Ngoài ra, vi khuẩn còn gây bệnh trên cành, lá làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của cây. Không chỉ gây hại trên cây bƣởi mà vi khuẩn Xanthomonas sp. gây hại hầu hết các loại cây có múi từ mức độ nhẹ đến nặng. Để xác định rõ dòng vi khuẩn gây bệnh này chúng tôi thực hiện đề tài “Xây dựng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi bằng phƣơng pháp sinh học phân tử”. Từ đó, chúng tôi có thể tìm ra phƣơng pháp phòng và trị bệnh đạt hiệu quả nhằm khôi phục lại giống bƣởi Đƣờng Da Láng mang lại hiệu quả kinh tế cao. 1.2. Mục đích - Xây dựng quy trình định danh vi khuẩn gây bệnh loét trên cây có muối (cây bƣởi). - Phân loại tính độc của chủng gây bệnh. 2 1.3. Yêu cầu - Thành thạo các thao tác phân lập, nuôi cấy, chủng bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm. - Thực hiện đƣợc phƣơng pháp sắc ký bản mỏng định danh vi khuẩn. - Thành thạo phƣơng pháp ly trích DNA vi khuẩn. - Tính toán, thiết lập đƣợc phản ứng PCR, hạn chế tối đa tạp nhiễm. 1.4. Giới hạn của đề tài - Chỉ xác định đƣợc chủng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi Da Láng, bƣởi Đƣờng Cam là Xanthomonas sp. - Chƣa giải đƣợc trình tự sản phẩm PCR đoạn 16s-23s rDNA ITS, chƣa thực hiện đƣợc phản ứng PCR trên hrpW để định danh chính xác chủng vi khuẩn gây bệnh ở mức độ loài. 3 Phần 2. TỔNG QUAN 2.1. Sơ lƣợc về nhóm cây có múi trên thế giới và trong nƣớc 2.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây bƣởi Cây có múi hiện đang trồng ở nhiều nƣớc trên thế giới đều có nguồn gốc từ các nƣớc vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Đông Nam Á. Đƣờng ranh giới của vùng xuất xứ cây ăn quả có múi nằm ở dãy chân núi Himalaya, phía đông Ấn Độ qua miền nam Trung Quốc, về phía nam đƣờng ranh giới vùng đi qua Australia (theo Taraka, 1971). Lịch sử trồng cây có múi ở nƣớc ta xuất hiện từ rất lâu đời cách đây 3000-4000 năm (Đƣờng Hồng Dật). Ngày nay, cây có múi đƣợc trồng trên khắp đất nƣớc ta từ Lào Cai đến Cà Mau, từ Quảng Ninh đến Lai Châu. Đặt biệt là bƣởi với nhiều giống đƣợc trồng ở nƣớc ta: bƣởi Da Láng, bƣởi Năm Roi, bƣởi Lông Cổ Cò, bƣởi Đƣờng Cam, bƣởi Da Xanh, bƣởi Lông Hồng.Các vùng trồng bƣởi nổi tiếng ở nƣớc ta nhƣ Đồng Nai và các tỉnh Đồng Bằng Sông Cửu Long. 2.1.2. Giá trị cây ăn quả có múi ở thế giới và trong nƣớc Cây ăn quả có múi nhƣ cam, quýt, bƣởi là một trong những loại quả cao cấp đƣợc nhiều ngƣời ƣa chuộng và đƣợc sản xuất ở nhiều nƣớc trên thế giới. Giá trị dinh dƣỡng cây ăn quả có múi rất cao. Trong thành phần thịt quả có chứa 6-12% đƣờng, chủ yếu là sacaroza. Hàm lƣợng vitamin C trong quả là 40-90% mg/100g tƣơi. Các loại axit hữu cơ chứa trong thịt quả là 0,4-1,2%, trong đó có nhiều axit có hoạt tính sinh học cao. Trong quả còn chứa các chất khoáng và dầu thơm. Tinh dầu đƣợc cất từ vỏ quả, lá, hoa đƣợc dùng trong công nghiệp thực phẩm. Đặc biệt là chanh yên, một tấn quả có thể đạt đƣợc 67 lít tinh dầu, tinh dầu ca quýt có giá trị khá cao trên thị trƣờng quốc tế. Ở nhiều nƣớc trên thế giới, từ những thời xa xƣa, ngƣời ta đã biết dùng các thuộc chi Citrus làm thuốc chữa bệnh. Ở thế kỷ thứ XVI, các thầy thuốc Trung Quốc, Ấn Độ đã dùng quả cam quýt để phòng ngừa bệnh dịch hạch, chữa trị bệnh phổi và bệnh chảy máu dƣới da. Ở nƣớc ta ngƣời dân đã dùng cây, lá, hoa, quả các loại cây ăn có múi để phòng và chữa bệnh từ thời xa xƣa. Lê Quý Đôn vết trong sách “ Vân đài loại ngữ” “Quýt 4 vàng là thƣợng phẩm, quýt đỏ, quýt vá, quýt cát là hạ phẩn, vỏ quýt có tính khoan trung hạ khí”, vỏ quýt có tên dƣợc liệu là “ trần bì” đƣợc sử dụng nhiều trong một số bài thuốc y học cổ truyền. Giá trị kinh tế, cây ăn quả có múi là cây lâu năm chóng cho thu hoạch, cây cam quýt có thể sống và chóng cho thu hoạch quả trong vòng 25-30 năm vẫn cho năng suất cao, đạt từ 100-250 kg quả/1cây trong một vụ.(Đƣờng Hồng Dật, 2000). 2.1.3. Tình hình sản xuất cam quýt ở Việt Nam Theo thống kê của ngành nông nghiệp thì đến năm 1993 diện tích trồng cam quýt ở nƣớc ta là 27.640 ha, tăng hơn năm 1989 năm là trên 10.000 ha (năm 1989- 17.205ha). Những năm gần đây diện tích trồng cam quýt ở một số nơi, nhất là ở một số tỉnh ĐBSCL tăng nhiều, trong khi một số tỉnh miền trung nhƣ Nghệ An, Hà Tỉnh, Quảng Bình, diện tích trồng cam quýt bị giảm xuống, năm 1999 cả nƣớc có vào khoảng trên dƣới 30.000 ha. Sản lƣợng cam quýt ở nƣớc ta năm 1993