Đề tài Ứng dụng các kỹ thuật array trong lĩnh vực môi trường

Còn quá sớm để nói về lịch sử của DNA array vì kỹ thuật này tương đối mới và thuộc về tương lai hơn là quá khứ. Đầu tiên có thể kể đến các mô tả đầu tiên về cấu trúc DNA của Watson & Crick (1953), cho thấy có thể tách DNA thành hai mạch đơn (biến tính) khi xử lý nhiệt hoặc dung dịch kiềm. Năm 1961, Marmur & Doty mô tả quá trình ngược lại, hồi tính, cơ sở của tất cả các phương pháp PCR và lai phân tử. Các nghiên cứu này gợi ra cách phân tích axit nucleotide dựa trên mối liên hệ trình tự giữa chúng và các phương pháp lai phân tử phát triển nhanh chóng. [1] Vào cuối những năm 1960, Pardue & Gall; Jones & Roberson tìm ra phương pháp lai in situ (sau này kết hợp với mẫu dò đánh dấu huỳnh quang gọi là FISH). Phương pháp cố định các nhiễm sắc thể và nhân trên phiến kính, sao cho DNA tạo thành mạch kép với mẫu dò, ngày nay được sử dụng để đặt DNA lên phiến kính trong phương pháp microarray. Vào thời gian này, hoá học hữu cơ cũng phát triển, cho phép tổng hợp tự động các mẫu dò oligonucleotide vào năm 1979. [1] Kỹ thuật phân tích sử dụng phương pháp gắn đồng thời nhiều trình tự đích lên một màng lọc theo thứ tự, phương pháp thấm điểm (dot blot), được Kafatos và cộng sự (1979) đưa ra. Trong kỹ thuật này, các trình tự đích được cố định trên giá thể và lai với mẫu dò (thường là trình tự axit nucleic đã đánh dấu). Saiki và cộng sự (1989) đưa ra một cách khác, dot blot ngược, trong đó gắn nhiều mẫu dò theo thứ tự trên màng và đích để phân tích được đánh dấu. Cùng thời gian này, các array đầu tiên với giá thể không thấm nước được tạo ra trong phòng thí nghiệm của Maskos (1991). Đầu những năm 1990, kỹ thuật đánh dấu phát huỳnh quang đa màu được Ried và cộng sự; Balding & Ward giới thiệu để phân tích nhiều loại mẫu dò với phương pháp FISH. Hiện nay, phương pháp này được sử dụng để phân tích so sánh mRNA từ những nguồn khác nhau. [1]

doc30 trang | Chia sẻ: ngtr9097 | Ngày: 07/06/2013 | Lượt xem: 1948 | Lượt tải: 4download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Đề tài Ứng dụng các kỹ thuật array trong lĩnh vực môi trường, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Ứng dụng các kỹ thuật array trong lĩnh vực môi trường Nguyễn Xuân Hưng MỤC LỤC Mở đầu PHẦN I_ KỸ THUẬT DNA ARRAY                                               1.     Lịch sử ra đời                                                    2.     Kỹ thuật DNA array                                               2.1     Cấu trúc và chức năng của DNA array                                    2.2     Quá trình thực hiện DNA array                                         2.2.1     Chế tạo mảng                                              2.2.2     Tiến hành thí nghiệm                                          3.     Các vấn đề tồn tại trong kỹ thuật DNA array khi áp dụng trong lĩnh vực môi trường PHẦN II_ KHẢ NĂNG PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT DNA ARRAY TRONG QUẢN LÝ MÔI TRƯỜNG 1. Các cải tiến loại một                                          1.1 Cải tiến mẫu dò                                              1.2 Cải tiến mảng                                               2. Các cải tiến loại hai                                              2.1 PNA array                                                    2.2 Nanowire array                                              2.3 Peptide array                                              2.4 Glycan array                                              2.5 Array hoá học (Chemical array)                               2.6 Protein array                                               PHẦN III_ KẾT LUẬN                                               TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN I_ KỸ THUẬT DNA ARRAY 1.     Lịch sử ra đời Còn quá sớm để nói về lịch sử của DNA array vì kỹ thuật này tương đối mới và thuộc về tương lai hơn là quá khứ. Đầu tiên có thể kể đến các mô tả đầu tiên về cấu trúc DNA của Watson & Crick (1953), cho thấy có thể tách DNA thành hai mạch đơn (biến tính) khi xử lý nhiệt hoặc dung dịch kiềm. Năm 1961, Marmur & Doty mô tả quá trình ngược lại, hồi tính, cơ sở của tất cả các phương pháp PCR và lai phân tử. Các nghiên cứu này gợi ra cách phân tích axit nucleotide dựa trên mối liên hệ trình tự giữa chúng và các phương pháp lai phân tử phát triển nhanh chóng. [1] Vào cuối những năm 1960, Pardue & Gall; Jones & Roberson tìm ra phương pháp lai in situ (sau này kết hợp với mẫu dò đánh dấu huỳnh quang gọi là FISH). Phương pháp cố định các nhiễm sắc thể và nhân trên phiến kính, sao cho DNA tạo thành mạch kép với mẫu dò, ngày nay được sử dụng để đặt DNA lên phiến kính trong phương pháp microarray. Vào thời gian này, hoá học hữu cơ cũng phát triển, cho phép tổng hợp tự động các mẫu dò oligonucleotide vào năm 1979. [1] Kỹ thuật phân tích sử dụng phương pháp gắn đồng thời nhiều trình tự đích lên một màng lọc theo thứ tự, phương pháp thấm điểm (dot blot), được Kafatos và cộng sự (1979) đưa ra. Trong kỹ thuật này, các trình tự đích được cố định trên giá thể và lai với mẫu dò (thường là trình tự axit nucleic đã đánh dấu). Saiki và cộng sự (1989) đưa ra một cách khác, dot blot ngược, trong đó gắn nhiều mẫu dò theo thứ tự trên màng và đích để phân tích được đánh dấu. Cùng thời gian này, các array đầu tiên với giá thể không thấm nước được tạo ra trong phòng thí nghiệm của Maskos (1991). Đầu những năm 1990, kỹ thuật đánh dấu phát huỳnh quang đa màu được Ried và cộng sự; Balding & Ward giới thiệu để phân tích nhiều loại mẫu dò với phương pháp FISH. Hiện nay, phương pháp này được sử dụng để phân tích so sánh mRNA từ những nguồn khác nhau. [1] Vào năm 1993, array chứa các oligonucleotide ngắn, dưới 19 nucleotide được tổng hợp in situ. Năm 1994, Hoheisel và cộng sự tăng mật độ chấm (spot) bằng cách dùng robot để lấy và đặt mẫu dò lên giá thể giúp tăng tốc độ quá trình, giảm sai sót chắc chắn mắc phải khi thực hiện những thủ tục có tính lặp lại cao bằng tay, và tăng tính chính xác vị trí. [1] Tất cả các thí nghiệm tiên phong ở trên là cơ sở của kỹ thuật array hiện nay. Kỹ thuật này phát triển đến mức chỉ vài năm nữa có thể so sánh nó với kỹ thuật PCR không thể thiếu trong sinh học hiện nay. 2.     Kỹ thuật DNA array 2.     Kỹ thuật DNA array  DNA microarray đầu tiên được thiết kế khám phá các loại thuốc mới [2], phân tích biểu hiện gen [3], tái giải trình tự DNA [4]. Kỹ thuật này mới được ứng dụng trong lĩnh vực vi sinh môi trường trong vài năm gần đây [5] nhưng đã cho thấy những tiềm năng vô cùng to lớn trong phân tích quần xã vi sinh vật, xác định sinh vật gây bệnh cũng như kiểm soát các quá trình trong cả khoa học cơ bản và khoa học ứng dụng về môi trường [6]. 2.1     Cấu trúc và chức năng của DNA array Trong kỹ thuật DNA array, người ta cố định các axit nucleic có trình tự xác định (mẫu dò) trên giá thể (mảng) thích hợp theo thứ tự. Axit nucleic cần nghiên cứu (đích) được đánh dấu sau đó lai với mẫu dò trên mảng. Ở những điều kiện lý tưởng, các axit nucleic có trình tự bổ sung bắt cặp chính xác với nhau. Hơn nữa dưới các điều kiện này, cường độ phát hiện tín hiệu tỷ lệ trực tiếp với lượng mẫu dò nên có thể định lượng các loại axit nucleic trong mẫu ban đầu [7]. Đường kính chấm (mỗi chấm đại diện cho một loại mẫu dò) trên macroarray thường ≥ 300 µm và có thể được hiện hình bằng kỹ thuật gel thông thường hoặc máy quét dùng trong những kỹ thuật blot trước đây. Ngược lại, các chấm trên microarray thường có đường kính 200 µm và cần thiết bị hiện ảnh đặc biệt như máy quét laser tiêu điểm (confocal laser scanner) [8; 9]. Các phương pháp mới đây có thể tạo ra đường kính chấm 100 µm và nếu dùng phương pháp in quang hoạt (photolitho-graphy) để tổng hợp mẫu dò oligonucleotide in situ thì có thể tạo ra chấm có đường kính 20 µm [8]. Microarray mật độ thấp Trong ứng dụng này, axit nucleic gắn chặt với màng nylon hoặc phiến kính đã biến đổi hoá học. Nếu cần, có thể sử dụng tia cực tím để tạo liên kết đồng hoá trị giữa mẫu dò với màng nilon. Plasmid và các sản phẩm của phản ứng PCR thường được đặt trên màng hoặc phiến kính với mật độ 80 - 200 chấm/cm2 với microarray mật độ thấp và 500 - 10.000 chấm/cm2 với microarray mật độ trung bình [10].    Microarray mật độ cao Đó là microarray có trên 10.000 mẫu dò/cm2. Ngày nay người ta đã tạo ra các DNA microarray với hơn 250.000 mẫu dò/cm2 gọi là DNA chip. Giá thể thường dùng là thuỷ tinh hoặc silicon. Trên chip có thể chứa các oligonucleotide dài từ 25 đến 60 base, sản phẩm PCR hoặc đôi khi là các plasmid lớn từ 500 đến 5.000 base [7]. 2.2     Quá trình thực hiện DNA array Về cơ bản, quá trình thực hiện thí nghiệm DNA array gồm hai bước: (i) chế tạo mảng và (ii) tiến hành thí nghiệm [1]. ▲Hình 1: Sơ đồ thực hiện kỹ thuật microarray. 2.2.1     Chế tạo mảng Cơ chất dùng để chế tạo mảng cần có các tính chất sau: gắn ổn định với mẫu dò, tín hiệu nền gây nhiễu thấp, tính chất hoá học bề mặt đồng nhất và chất lượng dữ liệu cao [11]. Một số chất đáp ứng được những điều kiện này và thường được sử dụng là thuỷ tinh, polypropylene, hoặc silicon [1], trong đó thuỷ tinh thường được dùng nhất [11]. Giá thể thường được biến đổi hoá học để dễ dàng gắn với mẫu dò. Trong trường hợp cơ chất thuỷ tinh, người ta phủ lên đó polymerase-lysine, amino silance hoặc silance có gốc amin hoạt hoá [3] để tăng tính kỵ nước và khả năng bám dính của mẫu dò [12]. Thành phần thứ hai của mảng là mẫu dò. Mẫu dò để gắn trên mảng cần được lựa chọn kỹ theo đích sử dụng. Hiện đã có nhiều phần mềm cũng như cơ sở dữ liệu giúp đơn giản hoá công đoạn này. Tuỳ mục đích sử dụng, mẫu dò có thể là oligonucleotide ngắn (15-25 nucleotide), oligonucleotide dài (50-120 nucleotide) hoặc cDNA (dài 100-3000 bp) [11]. Sau khi chọn được mẫu dò, gắn (hay còn gọi là in) chúng trên bề mặt mảng bằng hai cách: (i) cố định (cDNA) (ii) tổng hợp in situ (oligonucleotide). Cách thứ nhất thường sử dụng robot với các kỹ thuật in kim (contact-tip deposition printing), in vi tiếp xúc (micro-contact printing (µCP)), in vi kênh (micro-fluidics networks (µFN)) và in mạ (electro capture) để đặt mẫu dò đã tổng hợp từ trước lên mảng. Kỹ thuật in quang hoạt (photolithographic) được dùng cho các ứng dụng cách hai. Ngoài ra, in áp điện (piezoelectric printing) và in vi lỏng (micro wet printing (µWP)) có thể sử dụng cho cả cố định và tổng hợp in situ [7]. In kim (Contact-tip deposition printing) Kỹ thuật này có giá trị thương mại vào năm 1997 bởi công ty Synteni, được nhiều nhóm nghiên cứu sử dụng để chế tự tạo mảng DNA. Đầu tiên người ta hoà tan axit nucleic sau đó nhúng kim nhọn vào để lấy ra một lượng dung dịch xác định tại đầu của nó. Sau đó gắn dung dịch này lên bề mặt của cơ chất (Hình 2). Trong thực nghiệm, dùng nhiều đầu kim cùng lúc [13]. ▲Hình 2: Sản xuất DNA microarray sử dụng contact tip deposition printing [Theo 7]. Trong hầu hết các trường hợp, kim nhọn có rãnh giống như bút mực để giữ dung dịch. Phương pháp này có thể tạo ra các mảng mật độ cao chứa khoảng 10.000 cDNA khác nhau có kích thước từ 500 đến 5.000 base trên bề mặt thuỷ tinh 3,6 cm2 [7]. In vi tiếp xúc (µCP- Micro-contact printing) Phương pháp µCP có nguyên lý tương tự in kim. Trong đó, dùng “con dấu” polydimethysilane (PDMS) để chuyển axit nucleic lên bề mặt giá thể (Hình 3). Trên thực tế, kỹ thuật này không sản xuất thành công các mảng mật độ cao [7]. ▲Hình 3: Sản xuất DNA array sử dụng micro-contact printing [Theo 7]. In vi kênh (µFN- Micro-fluidics network) µFN là kỹ thuật µCP cải tiến. Trong đó, con dấu PDMS có các kênh nhỏ được đặt trên thuỷ tinh, vàng, polystyrene hoặc bề mặt silicone/silicone dioxide. Dung dịch cơ chất chứa đầy trong những kênh này được gắn lên bề mặt mảng bởi sức hút mao quản (Hình 4). ▲Hình 4: Sản xuất mảng bằng kỹ thuật µFN [Theo 7]. Giống như µCP, tính khả thi của µFN để sản xuất các DNA array đang được chứng minh [7]. In mạ (Electro capture) Các array này giống như một con chip silicon. Giá thể ở đây là silicon có lớp bề mặt bị ôxi hoá bởi nhiệt. Ở những vị trí xác định trên bề mặt này có các điện cực platin dày 500 nm. Sau đó tiến hành một loạt các biến đổi hoá học có thứ tự để tạo ra chip gồm nhiều lớp. Toàn bộ chip trừ phần không gian của điện cực platin được phủ lớp lưỡng điện (dielectric) Si3N4 dày 2 mm, bằng cách này có thể thao tác với điện cực từ trên xuống trong khi xung quanh nó được bảo vệ bởi lớp Si3N4. Trên cùng của chip là lớp streptavidin-agarose giúp cố định các phân tử axit nucleic đã biotin hoá (Hình 5). ▲Hình 5: In mạ [Theo 7]. Gắn mẫu dò lên chip bằng cách phủ lên bề mặt dung dịch chứa các oligonucleotide đã biotin hoá [7]. Chúng được vận chuyển đặc hiệu tới các chấm chứa strepta-vidin bằng cách cho dòng điện lần lượt chạy qua mỗi điện cực (Hình 6). Hiện tại, chip với trên 400 điện cực đang phát triển trong các phân tích di truyền ( ▲Hình 6: Sơ đồ chip electric silicon. (A) Sơ đồ chip có 25 điện cực platin, chiều dài mỗi cạnh 1 cm. Phần ngoại biên của chip có các điện cực platin (ô vuông màu sáng) để nối chip với nguồn điện. Khi có dòng điện sẽ xuất hiện các đường sáng chạy giữa điện cực ngoại biên và điện cực nhỏ hơn ở trung tâm. (B) Mặt cắt vùng điện cực trong trung tâm. Vùng này chứa điện cực đường kính 160 µm tại bốn góc và 25 điện cực khác xếp thành hình vuông. (C) Vùng điện cực [Theo 7]. In quang hoạt (Photolithography) Công ty Affymetrix đã phát triển phương pháp in quang hoạt để tổng hợp oligonu-cleotide in situ trên giá thể rắn [14]. Quá trình này dựa trên các kỹ thuật công nghiệp bán dẫn [15]. Đầu tiên, gắn các phân tử có nhóm bảo vệ dễ phân huỷ bởi tia cực tím trên bề mặt giá thể rắn. Dùng mặt nạ để hoạt hoá chọn lọc các vị trí trên bề mặt bằng tia cực tím nhằm loại trừ nhóm bảo vệ nhạy sáng tại đó. Sau đó ủ với các nucleotide để chúng phản ứng với nhóm OH tự do tại bề mặt những vùng đã hoạt hoá, kết thúc một chu kỳ (Hình 7). Lặp lại chu kỳ trên với mặt nạ và nucleotide khác sẽ tạo ra một “bãi chông dày đặc các oligonucleotide có trình tự bất kỳ” tại những vị trí xác định trên cơ chất [14]. Hiện tại, có thể gắn hơn 500.000 oligonucleotide khác nhau trên diện tích 1,28x1,28 cm ( In áp điện (Piezoelectric printing) In áp điện sử dụng công nghệ được phát triển cho các máy in đen trắng để phân phối lượng nhỏ dung dịch DNA thay vì mực in như bình thường [16]. Đầu áp điện tạo ra các giọt nhỏ trên đầu phân phối (hình 8). Hiện tại có thể dùng phương pháp này để tạo ra các mảng có trên 10.000 chấm/cm2. Cũng có thể dùng kỹ thuật này để chế tạo các mảng oligonucleotide bằng cách dùng 5 đầu phân phối áp điện khác nhau (mỗi đầu chứa một loại phân tử phosphoramidite nucleotide cần để tổng hợp oligonucleotide, đầu thứ năm chứa chất khử trityn hoá, hình 9) [16]. ▲Hình 7: Sơ đồ phương pháp in quang hoạt [Theo 16]. ▲Hình 8: Sơ đồ ống phun áp điện. Đơn vị sử dụng trong hình.|U|: giá trị tuyệt đối của điện áp [Theo 7]. ▲Hình 9: Tổng hợp oligonucleotide in situ sử dụng ống phân phối áp điện. Thủ tục nhiều ống phun. DMTr: nhóm phát hiện dimethoxytrityl, DTR: chất khử trityl hoá [Theo 7]. In vi lỏng (µWP - Micro wet printing) Kỹ thuật này được Ermantraut và cộng sự (1998) phát triển, dùng hộp mực in khung silicon để định vị mặt nạ chắn trên bề mặt mảng. Khung silicon kết hợp với đường ống phân phối thuỷ tinh tạo thành hệ thống kênh. Kênh này sẽ liên kết các đường vào riêng biệt với mặt nạ trong hộp mực. Mặt nạ đóng vai trò giao tuyến của hộp mực và bề mặt mảng đảm bảo chỉ một số vùng nhất định được tiếp xúc với hộp mực chứa chất khử nhóm bảo vệ. Khi dung dịch oligonucleotide và dung dịch rửa đi qua chỗ khử nhóm bảo vệ trên bề mặt, mặt nạ bị tách đi kết thúc một chu kỳ (hình 10). Tiếp tục chu kỳ mới ở đó thay đổi các nucleotide thêm vào và vị trí mặt nạ, ta sẽ tổng hợp được các oligonucleotide ngắn tại những vị trí xác định trên cơ chất. Hệ thống này cũng có thể được sử dụng để cố định các oligonucleotide và các chất khác như protein hoặc kháng thể. ▲Hình 10: Sơ đồ nguyên lý của kỹ thuật in vi lỏng [Theo 7]. 2.2.2     Tiến hành thí nghiệm Về cơ bản, các bước tiến hành thí nghiệm với microarray là như nhau và gồm 3 bước: (i) chuẩn bị mẫu; (ii) tiến hành lai; (iii) xác định tín hiệu và chuẩn hoá dữ liệu. Chuẩn bị mẫu Hiệu quả phân tích bằng microarray phụ thuộc đáng kể vào khâu chuẩn bị mẫu. Mẫu để lai (đích) có thể là RNA hoặc DNA được đánh dấu nhằm mục đích phát hiện trực tiếp chúng sau khi lai. Cho đến nay đã có rất nhiều phương pháp đánh dấu khác nhau được phát triển nhằm tăng độ nhạy và tính đặc hiệu của thí nghiệm. Các phương pháp đánh dấu bao gồm gắn trực tiếp chất đánh dấu vào đích bằng phản ứng của các nhóm hoạt động hoá học, PCR với mồi đánh dấu hoặc dùng enzyme biến đổi trực tiếp trình tự đích. Các chất chỉ thị phát hiện có thể là chất phát huỳnh quang (Cy3/Cy5, streptavidin /phycoerythrin), chất phóng xạ (32P, 33P, 35S), chất phát quang hoá học (Chemilumi-nescent) như digoxigenein, biotin; và nhuộm vàng/bạc [7]. Trong đó, Cy3/Cy5 được sử dụng rộng rãi nhất [17]. Tiến hành lai Sau khi đánh dấu, tiến hành lai trên mảng. Do sử dụng chất mang rắn nên phương pháp microarray dễ tiến hành hơn các phương pháp blot. Trong quá trình lai, cho dung dịch đích đã đánh dấu đi qua mảng. Ở đó mẫu dò bắt cặp bổ sung (nếu có) với đích. Nếu dùng chất mang thuỷ tinh, có thể đặt úp một phiến kính thuỷ tinh lên trên sau đó cho dung dịch đích đi qua khe trống giữa chúng bởi lực mao dẫn [1]. Một cách đơn giản khác là đặt trực tiếp mảng trong bể nhỏ chứa dung dịch lai. Các điều kiện lai (như nồng độ mẫu, lực ion, nhiệt độ) phụ thuộc lớn vào kích thước mẫu dò trên mảng và phải được xác định cho từng thí nghiệm [17]. Hiệu quả lai có thể tăng lên nếu dung dịch lai luôn ở trong trạng thái động so với bề mặt mảng [1]. ▲Hình 11: Sơ đồ đánh dấu mẫu dò dùng Cy3/Cy5 [Theo Yu et al., 2002]. Xác định và phân tích tín hiệu lai Sau khi lai, tiến hành rửa để loại bỏ đích không bắt cặp hoặc bắt cặp không đặc hiệu với mẫu dò [9]. Tiếp đó dùng thiết bị hiện ảnh xác định tín hiệu lai do chất đánh dấu trên đích phát ra. Cường độ tín hiệu cho phép đánh giá tương đối hiệu quả bắt cặp giữa đích và mẫu dò (hình 12). Điều đáng nói ở đây là lượng dữ liệu cần phân tích trong thí nghiệm microarray rất lớn do trên một mảng có thể đặt hàng chục ngàn mẫu dò, tương ứng với nó là hàng chục ngàn tín hiệu, trong đó lại có những tín hiệu nhiễu vì nhiều nguyên nhân. Do đó cần có các phần mềm máy tính để chuẩn hoá dữ liệu, đơn giản hoá quá trình phân tích nhằm đưa ra các kết luận nhanh và chính xác. Các bước chung khi tiến hành kỹ thuật microarray là như vậy, nhưng vì có hai loại mảng ứng với mẫu dò là cDNA và oligonucleotide nên có đôi chút khác nhau khi sử dụng chúng. ▲Hình 12: Hiệu quả lai khác nhau tạo ra các tín hiệu màu khác nhau trên mảng. Mảng chứa mẫu dò cDNA Trong hầu hết các thí nghiệm microarray thông thường, mảng được tạo ra từ mẫu dò cDNA có kích thước tương đối lớn sẽ lai với mRNA từ hai mẫu khác nhau. Mỗi mẫu được đánh dấu một loại thuốc nhuộm phát huỳnh quang có màu khác nhau (hình 13). Sau khi lai, tỷ lệ tín hiệu phát huỳnh quang của mỗi chấm sẽ phản ánh mức độ chiếm ưu thế của sản phẩm phiên mã, trực tiếp nói lên các đáp ứng liên quan tới điều kiện nghiên cứu [18]. Nhược điểm: (i) Tính tái sử dụng kém - mỗi phiến kính là duy nhất, luôn phải có mẫu đối chứng cho mỗi phiến kính. (ii) Cấu trúc bậc hai của cDNA làm giảm hiệu quả lai hoặc gây ra hiện tượng lai chéo [19]. (iii) Không phân biệt được các gene liên quan gần và các gene khác nhau một nucleotide. (iv) Sự đan xen giữa hai kênh màu tạo ra nhiễu. Hơn nữa, hai loại chất phát huỳnh quang khác nhau sẽ luôn tạo ra hiệu quả lai khác nhau (cho dù là nhỏ). Do đó, cần phải chuẩn hoá dữ liệu [20]. (v) Không có khả năng định lượng. (vi) Cần lượng lớn đích [9]. Ưu điểm: (i) Rẻ, có thể tự chế tạo. (ii) Cho kết quả tốt với những gen chưa biết trình tự [9]. (iii) Độ dài mẫu dò lớn (xấp xỉ 2x103 bp) xuất phát từ mẫu tham khảo thực tế nên tăng tính đặc hiệu [21]. (iv) Tính đặc hiệu cao [21]. ▲Hình 13: Thủ tục lai sử dụng mẫu dò cDNA. Mảng chứa mẫu dò oligonucleotide Các chip tổng hợp in situ này có thể chứa đến 6.500 gene khác nhau, mỗi gene được đại diện bởi ít nhất một tập hợp của xấp xỉ 20 “cặp mẫu dò” khác nhau [22]. Do phương pháp này không sử dụng mẫu đối chứng và mẫu dò có trình tự ngắn (25-60 base) nên để tăng tính chính xác và loại bỏ các tín hiệu nhiễu người ta đã nghĩ ra mô mẫu dò bắt cặp không hoàn hảo/hoàn hảo (MM/PM). Oligonucleotide bắt cặp hoàn hảo khác oligonucleotide bắt cặp không hoàn hảo chỉ một base chính giữa (hình 15). So sánh cường độ dấu hiệu MM/PM để quyết định tính đặc hiệu gắn. Ô đầu tiên trong hình cho thấy hiệu quả lai của các mẫu dò MM/PM như nhau nên không được dùng để đánh giá. Tương tự, vùng 3 không được đánh giá vì cường độ tín hiệu lai MM/PM như nhau, cho thấy kết quả lai không đặc hiệu. Tất cả các vùng khác có kết quả lai đặc hiệu và là đối tượng phân tích. Ưu điểm: (i) Các điều kiện được điều khiển chính xác, chip có chất lượng đồng nhất và có thể so sánh hiệu quả. (ii) Có thể xác định các gene liên quan gần. (iii) Có khả năng định lượng. (iv) Cần lượng nhỏ đích [9]. (v) Mật độ mẫu dò lớn cho phép phân tích nhiều gen hơn trên một array [21]. (vi) Chỉ dựa trên thông tin trình tự tức chỉ việc dựa trên các trình tự đã biết và tổng hợp mẫu dò rồi gắn trên mảng mà không phụ thuộc vào bất cứ một phương pháp nào khác như PCR, tách dòng… do đó tránh được sai số thực nghiệm cũng như lãng phí nếu xác định sai dòng, cDNA hoặc chấm từ những công việc này như gặp phải với phương pháp blot [14]. ▲Hình 14: Thủ tục lai dùng mẫu dò tổng hợp in situ. Nhược điểm: (i) Các trình tự được chọn dựa ngân hàng gene nên có thể phải chỉnh sửa. (ii) Mẫu dò ngắn làm giảm độ nhạy và tính đặc hiệu. (iii) Không thể so sánh đồng thời sự biểu hiện gene của hai mẫu thí nghiệm liên quan trên cùng một mảng [21; 23]. ▲Hình 15: Sơ đồ nguyên lý hệ thống MM/PM [Theo 14]. 3.     Các vấn đề tồn tại trong kỹ thuật DNA array khi áp dụng trong lĩnh vực môi trường 3.     Các vấn đề tồn tại trong kỹ thuật DNA array khi áp dụng trong lĩnh vực môi trường Mặc dù microarray ra đời mở ra một kỷ nguyên mới trong rất nhiều lĩnh vực, song khi ứng dụng trong môi trường nó gặp phải một số vấn đề. Vấn đề kỹ thuật Tồn tạ
Luận văn liên quan