Luận án Nghiên cứu phân lập và thử nghệm hoạt tính sinh học của các hoạt chất từ một số loài thực vật và nấm nội sinh thực vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ *** NGUYỄN NGỌC HIẾU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ NGHỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HOẠT CHẤT TỪ MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT VÀ NẤM NỘI SINH THỰC VẬT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI, NĂM 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ *** NGUYỄN NGỌC HIẾU NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THỬ NGHỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC HOẠT CHẤT TỪ MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT VÀ NẤM NỘI SINH THỰC VẬT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ Mã số: 62.44.01.14 Người hướng dẫn khoa học: 1. TS. Dương Ngọc Tú 2. PGS.TS. Dương Anh Tuấn HÀ NỘI, NĂM 2019 iLỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Dương Ngọc Tú và PGS.TS. Dương Anh Tuấn. Các kết quả thu được trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Nguyễn Ngọc Hiếu ii LỜI CẢM ƠN Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến TS. Dương Ngọc Tú và PGS.TS. Dương Anh Tuấn, những người Thầy đã hướng dẫn tận tình, chu đáo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới GS. VS. Châu Văn Minh và TS. Nguyễn Văn Lạng, đã giới thiệu, cổ vũ và động viên tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Học viện Khoa học và Công nghệ, Viện Hóa học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Trung tâm Ươm tạo Doanh nghiệp CNC, Ban Quản lý Khu CNC Hòa Lạc đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian làm luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Sinh dược, các Thầy, Cô và bạn bè đồng nghiệp tại Viện Hóa học (đặc biệt là PGS. TS. Nguyễn Thị Hoàng Anh, các bạn Đức, Thủy, Minh, Hiền, Dung...), các đồng nghiệp tại Viện Công nghệ Sinh học, Viện Bảo vệ Thực vật, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học đã tận tình truyền thụ kiến thức, cùng phối hợp cũng như giúp đỡ, hướng dẫn tôi hoàn thành các nghiên cứu khoa học trong suốt thời gian thực hiện luận án này. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã luôn cổ vũ, luôn là nguồn động viên to lớn cho tôi hoàn thành luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn ! Hà Nội, ngày..tháng..năm 2019 Tác giả luận án Nguyễn Ngọc Hiếu iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii MỤC LỤC......................................................................................................... ii DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT............................................. vi DANH MỤC BẢNG......................................................................................viii DANH MỤC HÌNH ......................................................................................... ix DANH MỤC SƠ ĐỒ ........................................................................................ x CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU................................................... 5 1.1. Côn trùng, nấm bệnh gây hại và vai trò của thuốc bảo vệ thực vật........... 5 1.2. Xu hướng thay thế thuốc BVTV hóa học bằng thuốc BVTV gốc sinh học7 1.3. Thuốc BVTV sinh học chiết xuất từ nguyên liệu thực vật ........................ 9 1.3.1. Thuốc BVTV thảo mộc trừ sâu............................................................... 9 1.3.2. Thuốc BVTV thảo mộc trừ nấm bệnh .................................................. 12 1.3.3. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc BVTV thảo mộc ở Việt Nam ......................................................................................................... 13 1.4. Nấm nội sinh thực vật và triển vọng tìm kiếm các hoạt chất BVTV sinh học thế hệ mới ................................................................................................. 14 1.4.1. Khái niệm nấm nội sinh thực vật .......................................................... 14 1.4.2. Triển vọng nghiên cứu và phát hiện các hoạt chất mới từ nấm nội sinh thực vật ............................................................................................................ 15 1.5. Giới thiệu về loài Ngâu ta (Aglaia duperreana Pierre), Gội ổi (Aglaia oligophylla Miq.), Trầu không (Piper betle L.) và Nghệ vàng (Curcuma longa L.) .................................................................................................................... 23 1.5.1. Thực vật học.......................................................................................... 23 1.5.2. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học............................................ 26 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.............. 33 2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 33 iv 2.1.1. Mẫu thực vật.......................................................................................... 33 2.1.2. Phương pháp thu hái mẫu thực vật, lưu tiêu bản mẫu, xác định tên khoa học, lập hồ sơ lưu trữ....................................................................................... 34 2.1.3. Phương pháp xử lý và chiết mẫu thực vật............................................. 35 2.1.4. Phương pháp chiết sinh khối nấm nội sinh thực vật ............................. 35 2.1.5. Phương pháp định danh bằng PCR giải trình tự gene vùng ITS .......... 35 2.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ mẫu nghiên cứu ......................... 37 2.2.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ........................................................................ 37 2.2.2. Sắc ký cột (CC) ..................................................................................... 37 2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học ............................................... 38 2.3. Các phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của dịch chiết, phân đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm................................... 39 2.3.1. Phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ sâu của dịch chiết, phân đoạn và chất sạch trong phòng thí nghiệm ................................................................... 39 2.3.2. Phương pháp thử sàng lọc hoạt tính trừ nấm của dịch chiết, phân đoạn chiết, chất sạch trong phòng thí nghiệm ......................................................... 41 2.4. Phương pháp phân lập và nuôi cấy nấm nội sinh từ thực vật .................. 42 CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM ...................................................................... 44 3.1. Thực nghiệm phân lập nấm nội sinh từ các mẫu thực vật ....................... 45 3.1.1. Phân lập nấm nội sinh cây nghệ vàng (Curcuma longa L.) .................. 45 3.1.2. Phân lập nấm nội sinh từ cây ngâu ta (Aglaia dupenrreana) ............... 51 3.1.3. Phân lập nấm nội sinh từ lá cây trầu không (Piper betle L) ................. 55 3.2. Thực nghiệm phân lập thành phần hóa học từ thực vật và nấm nội sinh thực vật ............................................................................................................ 56 3.2.1. Phân lập các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta (Aglaia duperreana) ............ 56 3.2.2. Phân lập các hợp chất từ lá cây Gội ổi (Aglaia oligophylla) ................ 62 3.2.3. Phân lập các hợp chất từ củ Nghệ vàng (Curcuma longa) ................... 63 3.2.4. Phân lập các hợp chất từ lá cây Trầu không (Piper betle L.)................ 65 v3.2.5. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Ngâu ta (nấm M. hawaiiensis)..................................................................................................... 68 3.2.6. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây nghệ vàng (nấm F. oxysporum) ...................................................................................................... 70 3.2.7. Phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Trầu không (nấm F. solani)73 3.3. Thử hoạt tính trừ sâu và nấm bệnh của các mẫu dịch chiết, phân đoạn và chất sạch .......................................................................................................... 74 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................. 76 4.1. Kết quả phân lập thực vật và định danh các chủng nấm nội sinh thực vật76 4.2. Kết quả khảo nghiệm hoạt tính trừ sâu và kháng nấm của các dịch chiết tổng, phân đoạn dịch chiết tổng và chất sạch thực vật, nấm nội sinh thực vật77 4.3. Kết quả nghiên cứu các thành phần hóa học của thực vật và nấm nội sinh thực vật ............................................................................................................ 81 4.3.1. Thành phần hóa học cây Ngâu (A. dupperreana) và Gội ổi (A. oligophylla) ..................................................................................................... 81 4.3.2. Thành phần hóa học cây nghệ vàng (Curcuma longa L.) .................... 90 4.3.3. Thành phần hóa học của cây Trầu không (Piper betle L.).................... 92 4.3.4. Thành phần hóa học nấm nội sinh M. hawaiiensis từ cây Ngâu .......... 94 4.3.5. Thành phần hóa học nấm nội sinh F. oxysporum cây Nghệ vàng ........ 97 4.3.6. Thành phần hóa học nấm nội sinh F. sonani của Trầu không............ 102 4.4. Mối tương quan về thành phần hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học thực vật và nấm nội sinh thực vật ................................................................. 104 4.4.1. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học cây Ngâu và nấm nội sinh cây Ngâu ................................................................... 104 4.4.2. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học cây Nghệ vàng và nấm nội sinh cây Nghệ vàng.................................................. 105 4.4.3. Mối tương quan giữa các hợp chất tự nhiên với hoạt tính sinh học cây Trầu không và nấm nội sinh cây Trầu không................................................ 106 vi KẾT LUẬN................................................................................................... 107 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ .................................... 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................. 111 DANH MỤC KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Diễn giải 13C-NMR Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 1H-NMR Proton nuclear magneticresonance spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton CC Column chromatography Sắc kí cột COSY Correlation spectroscopy Phổ tương tác 2 chiềuđồng hạt nhân 1H-1H DEPT Distortionless enhancement by polarisation transfer Phổ DEPT DMSO Dimethyl sulfoxide ESI-MS Electron spray ionizationmass spectra Phổ khối lượng ion hóa phun mù điện tử HMBC Heteronuclear mutiplebond connectivity Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HR-ESI-MS High resolutionelectronspray ionization mass spectrum Phổ khối lượng phân giải cao phun mù điện tử HSQC Heteronuclear single- Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết vii quantum coherence NOESY Nuclear overhauser effect Spectroscopy Phổ NOESY IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại IC50 Inhibitory concentration at50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm RP18 Reserve phase C-18 Silica gel pha đảo RP-18 TLC Thin layerchromatography Sắc ký lớp mỏng TMS Tetramethylsilane Tetramethyl silan PCR Polymerase ChainReaction Phản ứng chuỗi trùng hợp ADN DNA, DeoxyribonucleicAcid Vật chất di truyền ITS Internal transcribed spacer PDA Potato dextrose agar Môi trường nuôi cấy khuẩn nấm gồm khoai tây, đường, agar MEA Malt extract Agar Môi trường nuôi cấy khuẩn nấm gồm mạch nha và agar rRNA Ribosomal RNA RNA ribosome viii DANH MỤC BẢNG Bảng 4.2.1. Kết quả thử hoạt tính trừ sâu khoang (Spodoptetra litura) của các mẫu dịch chiết cây ngâu.................................................................................. 77 Bảng 4.2.2. Hoạt tính kháng nấm Botrytis cinerea của các mẫu dịch chiết thực vật .................................................................................................................... 78 Bảng 4.2.3. Hoạt tính ức chế nấm B. cinera của các dịch chiết F. oxysporum80 Bảng 4.2.4. Khả năng ức chế nấm B. cinera của các dịch chiết nấm nội sinh thực vật ............................................................................................................ 81 Bảng 4.3.1.1 Dữ liệu NMR của hợp chất 7 (CDCl3)...................................... 90 Bảng 4.3.4.1. Dữ kiện phổ NMR của hợp chất 13 và 14................................ 96 Bảng 4.3.5.1. Kết quả GC-MS các chất 15-26................................................ 97 Bảng 4.3.5.2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất 28 và 29................................ 100 Bảng 4.3.5.3 Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 30................................ 102 Bảng 4.3.6.1 Dữ liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất 31............................... 104 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1.5.1 Cây Ngâu ta................................................................................... 24 Hình 1.5.2. Cây Gội ổi .................................................................................... 24 Hình 1.5.3. Cây Trầu không............................................................................ 25 Hình 1.5.4. Cây Nghệ vàng............................................................................. 26 Hình 2.1. Các bước phân lập và sinh khối nấm nội sinh từ mẫu thực vật Hình 3.1. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium solani ......... 45 Hình 3.2. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium sp. .............. 46 Hình 3.3. Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng Trichoderma atroviride47 Hình 3.4. Cây phân loại của chủng Trichoderma atroviride .......................... 48 Hình 3.5. Khuẩn lạc và cơ quan sinh sản của chủng Fusarium oxysporum ... 49 Hình 3.6. Vị trí phân loại của chủng Fusarium oxysporum............................ 51 Hình 3.7. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng C. gloeosporioides ..... 52 Hình 3.8. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng C. crassipes ................ 52 Hình 3.9. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng M. hawaiiensis ........... 53 Hình 3.10. Vị trí phân loại của chủngMicrodiplodia hawaiiensis................. 54 Hình 3.11. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Colletotrichum sp..... 55 Hình 3.12. Khuẩn lạc và cuống sinh bào tử của chủng Fusarium solani ....... 56 Hình 3.3.1. Một số hình ảnh thử nghiệm hoạt tính trừ sâu trong phòng ........ 75 thí nghiệm........................................................................................................ 75 Hình 3.3.2. Một số hình ảnh thử nghiệm sàng lọc hoạt tính kháng nấm tại phòng thí nghiệm............................................................................................. 75 Hình 4.2.1. Khả năng ức ché nấm của tinh chất curcumin ............................. 79 Hình 4.2.2. Hoạt tính ức chế sự phát triển chủng nấm Botrytis cinera của các cặn chiết F. oxysporum ................................................................................... 80 Hình 4.3.5.1. Phổ sắc ký GC-MS của các chất 15-26.................................... 98 xDANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 3.2.1 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ vỏ cây Ngâu ta............................... 57 Sơ đồ 3.2.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây Gội ổi .................................. 62 Sơ đồ 3.2.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ củ Nghệ vàng................................. 64 Sơ đồ 3.2.4 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ lá cây Trầu không.......................... 66 Sơ đồ 3.2.5. Sơ đồ tách chiết hợp chất từ nấm nội sinh cây ngâu ...................... 68 Sơ đồ 3.2.6. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Nghệ vàng............ 71 Sơ đồ 3.2.7. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ nấm nội sinh cây Trầu không....... 74 1MỞ ĐẦU Chất lượng cuộc sống của con người ngày càng nâng cao, đòi hỏi các sản phẩm nông nghiệp và môi trường an toàn. Tuy nhiên để giữ vững năng suất, chất lượng nông sản, đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng, người ta lại phải sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật, chủ yếu là các loại thuốc hóa học độc hại, và cứ như vậy vòng luẩn quẩn tăng sản lượng, tăng đầu vào, nguy cơ sản phẩm không an toàn và ô nhiễm môi trường lại tiếp tục diễn ra. Vì vậy việc tìm kiếm các giải pháp phòng trừ sâu bệnh, bảo vệ sản phẩm nông nghiệp dễ sử dụng hơn, có hiệu lực trừ dịch hại cao hơn và thân thiện hơn với môi sinh và môi trường đang được đặt ra với toàn thể nhân loại chúng ta. Từ những thập niên cuối của thế kỷ XX, đầu thế kỷ XXI, các biện pháp sinh học (biological control) bảo vệ sản xuất nông nghiệp ngày càng phát huy tác dụng và dần được xác định là hướng biện pháp chủ đạo trong quản lý dịch hại tổng hợp trong thời gian tới. Ưu điểm nổi bật nhất của các biện pháp sinh học (ví dụ, thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học) là hầu như không độc với người và các sinh vật có ích nên có thể bảo vệ được sự cân bằng sinh học trong tự nhiên, ít gây tình trạng bùng phát dịch hại. Bên cạnh đó, thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học (thuốc BVTVSH, bio-pesticide) còn mau phân hủy trong tự nhiên, ít để lại dư lượng độc trên nông sản và có thời gian cách ly ngắn nên rất thích hợp sử dụng cho các nông sản yêu cầu có độ sạch cao và thời gian bảo quản, sử dụng ngắn như các loại rau củ, hoa quả Thêm nữa, các nguyên liệu để tạo thuốc BVTVSH thường có sẵn và rất phổ biến ở mọi nơi, mọi lúc. Chi phí sản xuất thuốc BVTVSH thấp hơn so với thuốc BVTV hóa học, do vậy sẽ tiết kiệm hơn cho người dân mà vẫn mang lại hiệu quả cao. Với những lợi ích mang lại, thuốc BVTVSH sẽ giúp người nông dân “thân thiện” hơn với cánh đồng của mình để có thể thụ hưởng lợi ích kinh tế lâu dài từ chính “người bạn” này. 2Nấm nội sinh thực vật (nấm NSTV, Plant endophytic fungi) là những vi sinh vật sống trong tế bào thực vật mà không gây ra bất kì tác động tiêu cực nào tới cây chủ. Nấm NSTV cũng có thể thúc đẩy tăng trưởng thực vật thông qua các cơ chế khác nhau như sản xuất phytohormones, tổng hợp siderophores, cố định đạm hay qua hỗ trợ phytoremediation...[1]. Chúng được xem như là một tác nhân giúp cân bằng hệ vi sinh trên cây chủ nhằm ngăn chặn những tác nhân vi sinh gây bệnh. Ngoài việc bảo vệ cây chống lại một số yếu tố bất lợi như động vật ăn cỏ hoặc côn trùng, nhiều hoạt chất được sinh ra từ nấm NSTV cũng đã được quan sát, theo dõi và được kết luận về khả năng ngăn chặn, kìm hãm hay diệt nhiều mầm bệnh khác nhau xâm nhập mô thực vật. Trước thực tế này, một câu hỏi được đặt ra rằng các hoạt chất quý giá này do chính cây sản xuất, do nấm NSTV sản xuất hay là kết quả của mối quan hệ tương sinh của các nấm NSTV có ích trong mô thực vật và cây chủ sinh ra. Nhiều tài liệu nghiên cứu cho thấy một số chất biến dưỡng của nấm NSTV không những tác động trên những mầm bệnh thực vật mà còn có khả năng trị liệu trên vi khuẩn, nấm, virus và những sinh vật đơn bào gây bệnh cho người và động vật. Vì vậy, nấm NSTV hiện đang được nghiên cứu sâu và rộng trên thế giới và được coi như là nguồn tài nguyên vô tận chưa khám phá hết với ngành công nghệ sinh học - dược phẩm. Kết quả thống kê gần đây, với ước lượng 51% số hợp chất có hoạt tính được phân lập từ các chủng nấm NSTV là hợp chất mới, đã cho thấy tiềm năng nghiên cứu và ứng dụng vô cùng to lớn của nấm NSTV. Các hợp chất do nấm NSTV sản sinh ra là con đường quan trọng để giải quyết nhu cầu thuốc mới trong y tế, nông nghiệp vì giá thành sản xuất rẻ, sự phong phú về cấu trúc (xanthones, anthraquinones, pestalotheols, octadrides, dihydroxyanthones, pyrenocine, steroids...) với rất nhiều hoạt tính mới [2,3]. Điều quan trọng nữa là nếu có thể khai thác được nguồn nguyên liệu từ nấ