Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase trong nấm mốc

Xylanase (Endo – 1,4 – ß – xylanase (1,4 – D – xylan xylanohydrolase: E.C. 3.2.1.8)) là enzyme quan trọng nhất tham gia thủy phân xylan [13, 29]. Xylanase thủy phân xylan bằng cách cắt đứt các liên kết ß – 1,4– glycoside, tạo thành các xylo – oligo [30]. Tuy nhiên, do cấu trúc của xylan rất phức tạp nên để phân cắt nó hoàn toàn cần một lượng lớn enzyme xylanase [19]. Xylanase được tách chiết từ vi khuẩn, nấm chẳng hạn như: Trichoderma, Bacillus, Cryptococcus, Aspergillus, Penicillium, Aureobasidium, Fusarium, Chaetomium, Phanerochaete, Rhizomucor, Humicola, Talaromyces [22].

doc74 trang | Chia sẻ: lvbuiluyen | Ngày: 23/01/2013 | Lượt xem: 565 | Lượt tải: 2download
Tóm tắt tài liệu Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase trong nấm mốc, để xem tài liệu hoàn chỉnh bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS. TS. Nông Văn Hải – Phó Viện trưởng, Giám đốc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Trưởng phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Quyền Đình Thi, Chủ nhiệm đề tài “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng cao từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi”, thuộc Chương trình trọng điểm cấp Nhà nước: “Phát triển và ứng dụng Công nghệ sinh học trong lĩnh vực Nông nghiệp và phát triển nông thôn đến 2020”do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn chủ trì, đã tạo điều kiện cho tôi được tham gia nghiên cứu, hoàn thành luận văn theo hướng nghiên cứu của đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa Sinh – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn. Tôi xin bày tỏ biết ơn tới toàn thể các cán bộ Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng - Viện Công nghệ sinh học đặc biệt là TS. Lê Thị Thu Hiền và KS. Vũ Hải Chi đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi rất tận tình trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin gửi tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp lòng biết ơn sâu sắc vì sự quan tâm, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Học viên Nguyễn Thị Mai Hương NHỮNG TỪ VIẾT TẮT AS Acetosyringone ATP Adenosine triphosphate bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid EtBr Ethidium bromide xylB Xylanase B Hph Hygromycin photpotransferase encoding gene IM Induction medium kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria – Bertani LC Luria – Complete MES (2 – N – morpholine) – ethane sulfonic acid PCR Polymerase Chain Reaction RNase Ribonuclease RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulphate TAE Tris – acetate – EDTA vir Virulence region MỤC LỤC MỞ ĐẦU 5 Chương 1 – TỔNG QUAN 7 1.1. Xylanase và ứng dụng trong công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi 7 1.1.1. Xylanase và sự phân hủy sinh học xylan 7 1.1.2. Ứng dụng xylanase trong sản xuất thức ăn chăn nuôi 9 1.2. Nấm mốc và ứng dụng của công nghệ chuyển gen 10 1.2.1. Giới thiệu về nấm mốc 10 1.2.2. Agrobacterium và ứng dụng trong công nghệ chuyển gen thực vật và nấm 12 1.2.3. Chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens 17 1.2.3.1. Kỹ thuật chuyển gen vào nấm mốc A. niger 17 Chương 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1. Nguyên liệu 24 2.1.1. Nguyên liệu 24 2.1.2. Hóa chất 24 2.1.3. Thiết bị 26 2.2. Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1. Các phương pháp sử dụng để nối ghép gen 26 2.2.2. Biến nạp vào tế bào E. coli và A. tumefaciens 30 2.2.3. Phương pháp điện di trên gel agarose 32 2.2.4. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 33 2.2.5. Phương pháp tách chiết DNA plasmid lượng nhỏ 34 2.2.6. Phân tích DNA plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn 36 2.2.7. Xác định trình tự gen và xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng 37 2.2.8. Phương pháp nuôi nhiễm A. tumefaciens và A. niger 38 Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41 3.1.1. Lắp ghép xylB vào vector trung gian 44 3.1.2. Lắp ghép cấu trúc biểu hiện hph vào vector trung gian 50 3.1.3. Kiểm tra sự có mặt của cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung gian (pKS_xylB_hph) 56 3.2. Thiết kế Ti plasmid mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph 57 3.2.1. Lắp ghép đoạn gen mang hai cấu trúc biểu hiện xylB và hph trong vector trung gian vào Ti plasmid 57 3.2.2. Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong vector tái tổ hợp Ti plasmid 58 3.3. Tạo chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph 62 3.3.1. Biến nạp Ti plasmid tái tổ hợp vào A. tumefaciens 62 3.3.2. Kiểm tra sự có mặt của xylB và hph trong Agrobacterium 62 3.4. Kết quả chuyển vector biểu hiện xylB và hph vào A. niger thông qua A. tumefaciens 64 3.4.1. Kết quả nuôi nhiễm 64 3.4.2. Chọn lọc thể nấm chuyển gen trên môi trường kháng sinh 67 KẾT LUẬN 69 KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 MỞ ĐẦU Trong nhiều năm gần đây, nhu cầu sử dụng enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật ngày càng tăng, đặc biệt là enzyme xylanase. Xylanase được sử dụng trong nhiều ngành sản xuất công nghiệp trên toàn thế giới [18, 29]. Một trong những ứng dụng quan trọng của xylanase là được dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Sự có mặt của xylanase trong thức ăn chăn nuôi có tác dụng thúc đẩy quá trình tiêu hóa, từ đó cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột của động vật [4, 13]. Ngoài ra, xylanase còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác ví dụ: phân hủy rác thải; làm trắng trong công nghiệp sản xuất giấy… [22, 29]. Trong tự nhiên, rất nhiều loại vi khuẩn và nấm mốc tiết ra xylanase [22], trong đó xylanase do nấm mốc tiết ra được quan tâm hơn cả bởi chúng có hàm lượng cao và ổn định. Nấm mốc Aspergillus hay còn gọi là nấm sợi, là nhóm nấm đa dạng và phân bố rộng trong tự nhiên. Với tiềm năng vô cùng phong phú, Aspergillus được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất enzyme cũng như trong các ngành nghiên cứu cơ bản về cơ chế sinh lý và sinh hóa và cơ chế di truyền vi sinh vật từ nhiều năm nay trên thế giới [9, 11]. Do nhu cầu sử dụng xylanase trong nhiều lĩnh vực đặc biệt là lĩnh vực sản xuất thức ăn chăn nuôi ngày càng tăng. Bởi vậy, nghiên cứu sản xuất và ứng dụng enzyme xylanase có chất lượng cao, ổn định từ các vi sinh vật tái tổ hợp nhờ công nghệ chuyển gen đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà nghiên cứu [22, 31]. Chuyển gen vào nấm dựa trên nền tảng của công nghệ DNA tái tổ hợp, để cải biến hệ gen của nấm mốc nhằm đáp ứng nhu cầu của con người về các sản phẩm protein cũng như enzyme để sản xuất trên qui mô công nghiệp. Hơn nữa, kỹ thuật chuyển gen cho phép chọn lựa promoter đặc hiệu cũng như các chủng vi sinh vật chuyển gen mong muốn, nhờ vậy đặc tính của enzyme tái tổ hợp đã được cải thiện [22]. Hiện nay, kỹ thuật chuyển gen thông vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens được sử dụng phổ biến trên thế giới để chuyển gen vào thực vật. Bởi đây là một hệ thống chuyển gen có hiệu suất cao, ổn định và đơn giản. Agrobacterium đã và đang được nghiên cứu, áp dụng để chuyển gen vào nấm mốc [3, 9]. Xuất phát từ vấn đề trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa xylanase trong nấm mốc” Đề tài được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và Phòng Công nghệ DNA ứng dụng – Viện Công nghệ sinh học. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài Mục tiêu Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ chuyển gen để thiết kế Ti–plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B. Trên cở sở đó tạo các chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tái tổ hợp phục vụ công tác chuyển gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B vào A. niger. Nội dung nghiên cứu - Thiết kế vector tách dòng trung gian pKS_xylB_hph dựa trên vector pBluescript II KS (-) mang hai cấu trúc biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B:(GpdA promoter + xylanase gene + TrypC terminator) và (GluA promoter + hph gene + TrypC terminator). - Thiết kế Ti plasmid tái tổ hợp pCB_xylB_hph dựa trên vector pCAMBIA1300 mang hai cấu trúc biểu hiện biểu hiện gen mã hóa xylanase và gen kháng hygromycin B: (GpdA promoter + xylanase gene + TrypC terminator) và (GluA promoter + hph gene + TrypC terminator. - Tạo các chủng vi khuẩn A. tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_xylB_hph để làm nguyên liệu chuyển gen vào nấm mốc. - Chuyển vector biểu hiện pCB_xylB_hph vào nấm mốc A. niger thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Chương 1 – TỔNG QUAN 1.1. Xylanase và ứng dụng trong công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi 1.1.1. Xylanase và sự phân hủy sinh học xylan Xylanase (Endo – 1,4 – ß – xylanase (1,4 – D – xylan xylanohydrolase: E.C. 3.2.1.8)) là enzyme quan trọng nhất tham gia thủy phân xylan [13, 29]. Xylanase thủy phân xylan bằng cách cắt đứt các liên kết ß – 1,4– glycoside, tạo thành các xylo – oligo [30]. Tuy nhiên, do cấu trúc của xylan rất phức tạp nên để phân cắt nó hoàn toàn cần một lượng lớn enzyme xylanase [19]. Xylanase được tách chiết từ vi khuẩn, nấm chẳng hạn như: Trichoderma, Bacillus, Cryptococcus, Aspergillus, Penicillium, Aureobasidium, Fusarium, Chaetomium, Phanerochaete, Rhizomucor, Humicola, Talaromyces…[22].  Hình 1. 1: Cấu trúc hóa học của xylan Xylan là thành phần chính cấu tạo nên hemicellulose của thành tế bào thực vật và là một trong số hợp chất polysaccharide quan trọng nhất trong tự nhiên [12, 28]. Xylan chủ yếu tìm thấy trong cấu trúc thứ cấp của thành tế bào thực vật và tạo thành pha giữa giữa lignin và các hợp chất polysaccharide khác [29]. Xylan cũng là một trong những polysaccharid phổ biển nhất trong các loài thực vật thông thường, chiếm 30% tổng trọng lượng khô trong sinh khối thực vật nhiệt đới. Với cây gỗ mềm ở vùng ôn đới, xylan ít phổ biến hơn và chiếm khoảng 8% tổng trọng lượng khô [29]. Như vậy, vô tình xylan đã trở thành một trong những thành phần có trong thức ăn chăn nuôi [28]. Xylan đa dạng về cấu trúc và khối lượng phân tử. Xylan là polymer không đồng nhất, mạch thẳng, gồm các đơn phân d – xylose được liên kết với nhau bằng liên kết ß – 1,4 – glycoside. Trong tự nhiên, chúng được thay thế một phần bằng acetyl 4 – 0 – methyl – d – glucuronosyl và arabinofuranosyl tạo thành cấu trúc polymer không đồng nhất. Tác động của xylan về mặt cấu trúc vẫn còn chưa rõ ràng bởi những khó khăn trong việc tách chiết xylan từ nguyên liệu trong tự nhiên mà không bị biến đổi hay mất đi một số cấu trúc ban đầu của xylan cũng như sự liên kết của nó với các thành phần khác [18, 23, 29]. Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc phân hủy xylan, đặc biệt là vi sinh vật tiết ra enzyme xylanase. Ứng dụng của xylanase đã được Hoppe - Seyler báo cáo từ hơn một trăm năm qua [18]. Sự phân hủy sinh học bộ khung cấu tạo nên xylan phụ thuộc chủ yếu vào hai lớp enzyme: endo – 1,4 – ß - xylanase (1,4 – ß – D – xylanohydrolase; EC 3.2.1.8), lớp enzyme này thủy phân liên kết 1,4 – ß - Glucosid nối với xylose và ß – xylosidases (1,4 – ß – D – xylan xylanohydrolase; EC 3.2.1.37), lớp enzyme này thủy phân xylobiose và xylooligosaccharid ngắn nhờ hoạt động của enzyme endo – xylanase. Các enzyme loại mạch nhánh (debranching enzyme) chẳng hạn như α – glucuronidase và α – L – arabinifuranosidase và esterase chẳng hạn như acetylxylan esterases và ferulyl và p – coumaroyl esterase sẽ loại bỏ mạch nhánh acetyl và mạch nhánh phenol [29]. Ở cây gỗ rắn, xylan có công thức O – acetyl – 4 – O – methylglucuron – oxylan. Arabino – 4 – O – methylglucuroxylan tìm thấy trong cây gỗ mềm và arabinoxylan rất điển hình trong cây cỏ và thực vật bình thường khác [13]. Sự đa dạng của xylan dẫn đến sự đa dạng của enzyme xylanase [13]. Xylanase tiết ra từ vi sinh vật được chia làm hai họ enzyme thủy phân chính: họ 10 và họ 11 dựa trên trình tự tương đồng của amino acid [28]. Xylanase thuộc họ 10 nhìn chung có khối lượng phân tử lớn (>30 kDa), đa dạng và phức tạp hơn (có thể thủy phân cellulose và xylan), trong khi xylanase thuộc họ 11 có khối lượng phân tử nhỏ hơn (khoảng 20 kDa) và đặc hiệu hơn đối với xylan [13, 29]. Xylanase có trong nhiều loài sinh vật trong tự nhiên, ở sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn và đã được tìm thấy cả trong vi khuẩn ở nước, nấm, tảo biển, côn trùng. Cho đến nay, hầu hết xylanase được chiết xuất từ vi khuẩn và nấm [13, 29]. Trong đó, nấm sợi là nguồn vi sinh vật tiềm năng nhất để chiết xuất xylanase với hàm lượng cao [13, 29]. Trong nhiều thập kỉ gần đây, xylanase còn được tách chiết từ nấm gây bệnh trên các cây ngũ cốc nói riêng và vi sinh vật gây bệnh thực vật nói chung [29]. Hơn nữa, nhiều vi sinh vật tiết enzyme xylanase phân hủy xylan cũng có thể phân hủy cellulose do sự tương đồng của các liên kết (1,4 – ß – glucosid) giữa hai enzyme celllulase và xylanase. Một số loài Bacillus chỉ tiết ra xylanase, trong khi nhiều loài nấm sợi lại tiết ra lượng lớn protein ngoại bào và tạo thành xylanase thường kèm theo cả enzyme phân hủy cellulose, chẳng hạn như một số loài thuộc Trichoderma, Penicillium và Aspergillus [29]. Do đó, để ứng dụng xylanase đạt hiệu quả cao nhất cần phải loại bỏ ảnh hưởng của cellulase, hoạt động và bền vững với nhiệt độ. Ngày nay, xylanase đã và đang được chú trọng nghiên cứu rộng rãi trên toàn thế giới, từ Châu Âu, đến Châu Á và được áp dụng trong nhiều ngành công nghiệp [13, 30]. 1.1.2. Ứng dụng xylanase trong sản xuất thức ăn chăn nuôi Xylanase được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Xylanase hỗ trợ quá trình tẩy trắng trong công nghiệp sản xuất giấy thay vì phải sử dụng các hóa chất độc hại; xylanase tham gia quá trình xử lý rác thải nông, lâm nghiệp [8]; trong công nghiệp sản xuất bánh, xylanase được dùng để làm tăng độ phồng và giảm độ dính của bánh; xylanase được dùng trong công nghiệp sản xuất đồ uống, sản xuất nhiên liệu [20, 29]. Một trong những ứng dụng quan trọng của xylanase là được dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Sự có mặt của xylanase trong thức ăn chăn nuôi làm giảm độ nhớt trong đường tiêu hóa, giảm rối loạn tiêu hóa, tăng cường hấp thu thức ăn, nhờ vậy cải thiện hệ vi sinh vật đường ruột, giúp phân thải ra khô hơn [4, 5, 13, 27]. Ngoài xylanase, một số enzyme khác cũng được dùng để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, bao gồm: mananase, ß – glucanase và cellulase, α – amylase, protease và phytase. Các loại enzyme này đều được sử dụng rộng rãi trong nhiều năm qua trên toàn thế giới, từ Châu Âu, đến Châu Mĩ và Châu Á [5, 13, 27]. Do tiềm năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực mà xylanase đã thu hút mạnh mẽ sự quan tâm của các nhà nghiên cứu. Xylanase tách chiết từ Aspergillus đã được tách dòng và biểu hiện thành công. Đặc tính của enzyme này cũng đã được phân tích [13]. Những thành tựu trên là cơ sở để nghiên cứu tạo sinh vật chuyển gen mã hóa xylanase vào vật chủ mong muốn với mục đích thu lượng lớn enzyme phục vụ cho các ngành sản xuất công nghiệp. 1.2. Nấm mốc và ứng dụng của công nghệ chuyển gen vào nấm mốc thông qua A. tumefaciens 1.2.1. Giới thiệu về nấm mốc Nấm mốc hay còn gọi là nấm sợi là vi sinh vật đa dạng nhất trong tự nhiên. Ước tính có khoảng 1,5 triệu loài nấm, trong đó chiếm số lượng lớn là các loài thuộc chi Aspergillus. Chúng là các vi sinh vật nhân chuẩn bậc thấp, sinh bào tử và sống hoại sinh nhờ khả năng sinh enzyme để phân hủy các hợp chất hữu cơ [8, 22]. Aspergillus là một chi thuộc ngành Eumycota và gồm rất nhiều loài phổ biến, ví dụ: A. niger, A. oryzae... Giống như các loài khác trong chi Aspergillus, A. niger sinh bảo tử có màu đen, vì thế chúng còn được gọi là mốc đen [33]. A. niger gây ảnh hưởng đến các sản phẩm nông sản sau khi thu hoạch nhưng chúng ít gây bệnh cho con người so với một số loài thuộc chi Aspergillus chẳng hạn như A. flavus, A. fumigatus. A. niger cũng đã được sử dụng từ rất lâu trong sản xuất thực phẩm, sản xuất citric acid, gluconic acid gluconic [33]. Nhờ khả năng tiết enzyme với hàm lượng cao, A. niger được sử dụng phổ biến trong sản xuất thực phẩm và được coi là loài một vi sinh vật quan trọng trong sản xuất công nghiệp [10, 13]. Ngoài ra, chúng còn được sử dụng trong sản xuất bánh, rượu, bia. Dựa trên lịch sử ứng dụng lâu đời trong sản xuất thực phẩm lên men, A. niger đã được coi là vi sinh vật an toàn và thân thiện với con người, mặc dù một số chủng (chiếm khoảng 3 – 10%) có thể sản xuất ra một số chất chuyển hóa thứ cấp gây độc trong điều kiện lên men như mycotoxin nhưng với hàm lượng rất thấp. Kỹ thuật chuyển gen đã được áp dụng để chuyển các gen mong muốn vào thực vật, nấm (nấm men) nhằm nâng cao năng suất, kháng sâu bệnh và nâng cao chất lượng sản phẩm [22]. Chuyển gen vào A. niger đã được khai phá từ những năm cuối thập kỉ 80 và đầu thập kỉ 90, trong gen mã hóa enzyme là một trong những mục tiêu được quan tâm nhất. Hiện nay, nhiều loại enzyme được sử dụng trong các ngành sản xuất công nghiệp, đặc biệt là các enzyme có nguồn gốc từ vi sinh vật tái tổ hợp bằng kỹ thuật di truyền bởi đặc tính của chúng đã được cải thiện [31]. A. niger là loài có khả năng sinh enzyme với hàm lượng cao và ổn định, do đó chúng trở thành vật chủ để biểu hiện các loại enzyme mong muốn [9, 10, 31]. Chuyển gen vào nấm thường được tiến hành theo hai cách: trực tiếp và gián tiếp. Kỹ thuật chuyển gen trực tiếp được thực hiện bằng xung điện, polyethylene glycol (PEG), và bom vi tiêu để chuyển gen vào thể nguyên sinh, bào tử, hay thể sợi nấm. Ngoài các kỹ thuật trên, một số các kỹ thuật chuyển gen khác được áp dụng ví dụ: chuyển gen nhờ các transposon hay nhờ các enzyme giới hạn. Tuy nhiên, các kỹ thuật này bộc lộ nhiều nhược điểm, chẳng hạn như tần suất tái tổ hợp tương đồng thấp; có thể chuyển nhiều loại gen, kể cả những gen không mong muốn [11, 16]; có thể tạo ra những vùng gen không mã hóa hoặc sau khi chuyển gen thường xảy ra hiện tượng sắp xếp lại genome hoặc tồn tại những trình tự có tốc độ sao mã cao [12]. Ngoài các kỹ thuật chuyển gen trực tiếp, chuyển gen có thể được thực hiện một cách gián tiếp thông qua vi khuẩn A. tumefaciens. Phương pháp này đã và đang được nghiên cứu và ứng dụng để chuyển gen vào nấm mốc [1, 9, 12]. 1.2.2. Agrobacterium và ứng dụng trong công nghệ chuyển gen thực vật và nấm 1.1.2.1. Giới thiệu về vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens Trong tự nhiên, chúng ta thường gặp ở vùng cổ rễ các loài thực vật hai lá mầm một loại khối u gồm khối các tế bào không phân hóa và phát triển không có tổ chức. Những tế bào trong khối u này mất khả năng phân cực và phân chia liên tục giống như tế bào ung thư ác tính ở động vật.  Hình 1. 2: Khối u thực vật do Agrobacterium [18] Theo cơ chế hình thành, người ta phân biệt hai loại khối u chính: khối u di truyền và khối u cảm ứng. Khối u di truyền thường xuất hiện ở một vài cặp lai có tính hòa hợp không cao ở một nhiễm sắc thể riêng rẽ nào đó, đặc biệt khi lai các loài khác của chi thuốc lá Nicotiana hoặc của chi rau cải Brassica. Loại khối u cảm ứng được biết đến nhiều nhất là mụn cây do loài vi khuẩn A. tumefaciens gây nên [1]. Agrobacterium là chi vi khuẩn Gram âm (–), bao gồm các loài gây bệnh kí sinh và vi sinh vật sống trong đất. A. tumefaciens là loài vi khuẩn đất có khả năng chèn gen của mình vào tế bào vật chủ và sau đó sử dụng bộ máy của sinh vật chủ để biểu hiện các gen này dưới dạng hợp chất dinh dưỡng cho chúng. A. tumefaciens sẽ tạo ra các khối u thực vật gần điểm tiếp nối giữa rễ và thân, gây ra những nốt sần ở cây (bệnh mụn cây–crown gall disease) [12, 18]. Cơ chế hình thành loại khối u cảm ứng này được nghiên cứu từ nhiều năm nay và mang lại nhiều thành tựu quan trọng trong chuyển gen thực vật [18]. A. tumefaciens được sử dụng như một hệ thống trung gian hữu hiệu để chuyển gen vào nhiều loài nấm, chẳng hạn như A. awamori, A. fumigatus, Penecillium digitatums [18, 19]. Không chỉ vậy, chuyển gen thông qua A. tumefaciens cũng đã được áp dụng để chuyển gen vào tế bào người [26]. Đến nay người ta đã khám phá được bản chất phân tử của quá trình cảm ứng phát sinh khối u do vi khuẩn A. tumefaciens gây ra ở thực vật. Trước hết là quá trình nhiễm khuẩn ở vùng tế bào của cây bị thương. Các tế bào bị thương tiết ra những hợp chất polyphenol thu hút các tế bào vi khuẩn A. tumefaciens. Tuy nhiên, vi khuẩn không thâm nhập vào tế bào thực vật mà chỉ chuyển gen vào chúng một đoạn DNA nhỏ (T – DNA: tranferred DNA) nằm trên một loại plasmid đặc biệt và gây nên trình trạng phát sinh khối u. Plasmid đặc biệt là Ti plasmid (tumor inducing) [12, 26]. T – DNA sẽ tạo ra khối u thực vật và sự phát triển của khối u sau đó sẽ không phụ thuộc vào sự có mặt của vi khuẩn Agrobacterium [19, 29]. 1.2.2.1. Ti plasmid Ti plasmid là một phân tử DNA vòng tương đối lớn, kích thước khoảng 15