Chuyên đề Đại cương sắc ký ion giới thiệu hệ thống ic dionex ứng dụng trên máy ic

ĐẠI CƯƠNG SẮC KÝ ION GIỚI THIỆU HỆ THỐNG IC DIONEX ỨNG DỤNG TRÊN MÁY IC Người trình bày : ThS. Phan Bích Hà Cn. Nguyễn Thị Hà Linh KHOA XÉT NGHIỆM ĐẠI CƯƠNG SẮC KÝ ION GIỚI THIỆU HỆ THỐNG IC DIONEX ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 2 PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ 1903 Tswett (1872–1919) công bố tách được các chất màu trong cây cỏ. CHROMATOGRAPHY ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 3 Phân tích sắc ký Nguyên lý cơ bản - Sắc ký là kỹ thuật tách các cấu tử ra khỏi hỗn hợp dựa trên ái lực khác nhau của mỗi cấu tử đối pha tĩnh và pha động + pha tĩnh: có tác dụng giữ cấu tử cần tách (lớp chất cố định) + pha động: có tác dụng kéo cấu tử cần tách ra khỏi cột (chất lỏng, khí) ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 4 PPPT sắc ký + khả năng phân tách cao, có thể tách những chất rất giống nhau về mặt hóa học lẫn vật lý + là 1 trong những PPPT mạnh nhất ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 5 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 6 Phân loại sắc ký theo bản chất của 2 pha sử dụng Pha Pha tĩnh Tên gọi của kỹ Ứng dụng động thuật sắc ký Chất rắn Sắc ký lỏng - rắn Sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký Chất lỏng cao áp lỏng Chất lỏng Sắc ký lỏng - lỏng Sắc ký lỏng cao áp Chất rắn Sắc ký khí - rắn Chất khí Sắc ký khí Chất lỏng Sắc ký khí - lỏng ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 7 Phân loại sắc ký theo cấu hình Hình học Cấu hình sắc ký Chiều di chuyển của pha động Giấy Đi lên, đi xuống, từ tâm lan toả tròn Phẳng Lớp mỏng Đi lên, đi xuống, từ tâm lan toả tròn Cột hở Đi xuống Cột Sắc ký khí Nhờ vào ngoại lực Sắc ký lỏng cao áp Nhờ vào ngoại lực ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 8 Cột sắc ký ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 9 Thứ tự ra khỏi cột • Hợp chất có ái lực nhiều với pha động thì có xu hướng ra khỏi cột trước • Hợp chất có ái lực nhiều với pha tĩnh thì bị giữ lại lâu hơn trong cột và ra sau ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 10 Sắc ký đồ ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 11 SẮC KÝ ION A special application of HPLC 1975 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 12 So sánh với HPLC HPLC IC - CD Đối tượng Phân tử Ion (chủ yếu trung hòa anion) Pha động Hỗn hợp Dung dịch dung môi Ion Thể tích chết ngoài cột Nhỏ hơn Lớn hơn Đường kính, chiều dài, Nhỏ hơn Lớn hơn cỡ hạt của cột Chiều rộng mũi sắc ký Nhỏ hơn Lớn hơn ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 13 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 14 ĐỊNH NGHĨA • Sắc ký ion là kỹ thuật tách các cấu tử anion hay cation từ hỗn hợp qua cột sắc ký dựa trên ái lực khác nhau của mỗi ion đối với pha tĩnh và pha động. – Ion càng bị giữ mạnh bởi pha tĩnh thì càng ra trễ. – Gradient : tăng nồng đô/điện tích của eluent. ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 15 Nguyên lý • Sắc ký ion tách các ion và phân tử phân cực dựa trên điện tích của chúng. – IC-CD : Phát hiện ion chủ yếu dựa trên độ dẫn điện – Dung dịch ion có tính dẫn điện nên khi sử dụng CD cần khử nền. ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 16 Thành phần cơ bản của sắc kí ion ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 17 SƠ ĐỒTHI ẾT BỊS ẮC KÝ ION ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 18 Ion Chromatography - 2- HCO3 /CO3 Eluent Eluant 0.0028M NaHCO 3 0.0022M Na CO2 3 ~2 ml/min flow Sample Loop 500 - 5,000 psi Pump 1,000 nominal 50 ul Check for air bubbles Sample Inject Valve Sample in Syringe or from Autosampler Waste Guard Column 3- PO 4 = SO 4 Separator Column + - - + - - - RNR 3 HCO 3 + Cl RNR 3 Cl + HCO 3 NO 3 + = = + = = 2RNR 3 CO 3 + SO 4 2RNR 3 SO 4 + CO 3 Cl - "R" = latex resin particle Cation Exchange Membrane Exchange Cation Chromatogram - + - = 3- HCO 3 Na Self Regenerating Cl - NO SO PO O 2 H 2 - 3 4 4 Anion Suppressor F + Na + -- + H + - OH - + - (uS) Conductivity Cathode - Anode - + water dip Cation Cation Exchange Membrane H 2O H 2 CO 3 H 2O time Computer/Integrator Conductivity Detector ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 19 Ion Chromatography OH - Eluent Degas Degas Eluant Eluant 40 mM DI Water NaOH Sample Loop Quaternary 500 - 5,000 psi 100 ml Pump 1,650 psi nominal Sample Inject Valve Sample in Syringe or from Autosampler Waste Guard Column 3- PO4 2- SO4 Separator Column - RNR + - Cl - RNR + Cl - - NO3 3 OH + 3 + OH + - 2- + 2- - 2RNR 3 2(OH ) + SO4 2RNR 3 SO4 + 2OH Cl- "R" = latex resin particle Cation Exchange Membrane Exchange Cation S) Chromatogram m OH- Na+ - - 2- Self Regenerating Cl NO SO4 3- O2 H2 3 PO4 Anion Suppressor F- + Na+ -- + H+ - OH- + - 2- - CO3 Cathode - +Anode - Cation Cation Exchange Membrane H O H O H O 2 2 2 ( Conductivity time Computer/Integrator Conductivity Detector ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 20 Pump Mode Degas Mode He Gas He Gas To Pump To Pump Eluent Eluent ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 21 Non-Suppressed IC S) m Conductivity ( Conductivity time Suppressed IC S) m Conductivity ( Conductivity time ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 22 Hệ thống sắc ký ion Metrohm IC850 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 23 Hệ thống sắc ký ion Shimadzu ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 24 Hệ thống sắc ký ion Dionex 3000 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 25 Sắc ký ion Dionex 3000 tại Viện ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 26 CÁC BỘ PHẬN ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 27 CÁC BỘ PHẬN • Bơm SP : Single pump • EGC : Eluent genarator cartridges RFIC Reagent Free Ion Chromatography – CT-RC : Continously Regenerated Trap Column • Injector : AS-AP • DC : Detector/Chromatography: Separation (Guard column, column); detection(CD và ED); automation – ASRS : Anion Self-Regenerating Suppressor • Hệ xử lý dữ liệu ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 28 PHÂN LOẠI SẮC KÝ ION • Sắc ký trao đổi ion. (Ion exchange) • Sắc ký ghép cặp ion. (Ion pair) –Không sử dụng đầu dò độ dẫn • Sắc ký đuổi ion. (Ion exclusion) –Ứng dụng cho acid hữu cơ ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 29 Sắc ký ghép cặp ion • Sử dụng cột sắc ký lỏng pha đảo với đầu dò thường ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 30 Sắc ký loại ion • Phân tích acid và baz yếu R-COOH  RCOO- + H+ • Sự lưu giữ phụ thuộc – Kích cỡ của R. – Tương tác của R với chất nền pha tĩnh. – pKa • R tương tác với eluent và chất nền pha tĩnh ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 31 Size exclusion chromatography Phân biệt ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 32 Ion exclusion chromatography • Pha tĩnh trao đổi cation có các nhóm SO3H. Pha động có nước làm pha tĩnh bị hidrat hóa. Lớp nước hidrat hóa tạo màng đặc biệt gọi là màng Donnan, mang điện tích âm chỉ cho qua các phân tử trung hòa về mặt điện tích. • Các acid hữu cơ không phân ly, có thể được lưu giữ trên pha tĩnh, khi phân ly sẽ bị loại ra và sẽ rửa giải theo pha động ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 33 Sắc ký trao đổi ion ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 34 Cơ chế trao đổi ion The cation exchange mechanism The anion exchange mechanism ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 35 CÁC ĐẠI LƯỢNG TRONG SẮC KÝ ION • Tương tự như trong HPLC • Ba đại lượng liên quan đến độ phân giải R : – Hệ số lưu giữ : không nên lớn quá. – Số đĩa lý thuyết N : tương đối lớn. – Độ chọn lọc : không bị ảnh hưởng nhiều bởi các thông số pha động mà chịu ảnh hưởng do pha tĩnh. ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 36 Retention time – Thời gian lưu Dùng để định tính ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 37 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 38 Retention time – Ion phân tích • Charge = valency – điện tích ion • Size - Kích thước • Polarizability – khả năng phân cực của ion ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 39 Điện tích ion ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 40 Điện tích ion ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 41 Kích thước ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 42 Kích thước ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 43 Kích thước ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 44 Khả năng phân cực của ion ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 45 Khả năng phân cực của ion ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 46 Khả năng phân cực của ion ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 47 Retention time • Nồng độ pha động • Nhiệt độ cột • pH của pha động ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 48 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 49 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 50 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 51 QUÁ TRÌNH PHÂN TÍCH MẪU BẰNG IC ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 52 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 53 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 54 Ion chromatography system configuration ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 55 Dionex - Ion Chromatography Product Line ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 56 RFIC (Reagent free Ion chromatography) system - DIONEX ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 57 Bơm (Pump) Bền hơn PEEK (Polyether ether ketone) P(IC) < P(HPLC) SP Single Pump DP Dual Pump ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 58 BỘ TẠO PHA RỬA GIẢI EGC Sử dụng điện phân để tạo pha động nồng độ chính xác ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 59 BỘ TẠO PHA RỬA GIẢI EGC (phân tích Anion) ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 60 BỘ TẠO PHA RỬA GIẢI EGC (phân tích Cation) ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 61 BỘ TẠO PHA RỬA GIẢI EGC (phân tích Anion) ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 62 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 63 EPM (Electrolytic pH Modifier) ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 64 CR-TC Continously Regenerated Trap Column ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 65 CR-ATC ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 66 CR-CTC ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 67 RFIC (Reagent free Ion chromatography) system - DIONEX ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 68 Injector ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 69 Injector ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 70 AUTOSAMPLER ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 71 RFIC (Reagent free Ion chromatography) system - DIONEX ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 72 DC MODULE ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 73 SEPARATION ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 74 Column Material Composition of the stationary phase Substrate: substrate / resin carrier • Polystyrene / divinylbenzene spacer group • Polymethacrylate functional group • Polyvinylalcohol • Silica gel • Hydroxyethylmethacrylate (HEMA) Spacer • Alkyl chain Cation exchanger Anion exchanger • sulfonates • quaternary • carboxylates ammonium groups • alkyl amines • hydroxy-alkylamines ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 75 The stationary phase ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 76 Column Material ion exchangers for IC silica gels polymer resins polymer coated surface microporous macroporous functionalized Metrosep C 4 polymer coated surface functionalized Metrosep C 2 latex layer PS/DVB PVA MA particles DIONEX A Supp 10 A Supp 4 A Supp 15 &16 A Supp 5 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 77 Cấu trúc nhựa latex ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 78 OH- OH- + NH3 Latex - + 2- OSO3 H N SO 3 + 4 Bead NH3 Cl- OH- ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 79 DETECTOR ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 80 DETECTOR ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 81 SRS 300 Self-Regenerating Suppressor ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 82 SRS 300 Self-Regenerating Suppressor ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 83 Các loại khác ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 84 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 85 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 86 The assembly of key SRS components ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 87 The electrolytic suppression processes in the ASRS ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 88 Self Regenerating Anion Suppressor From Separator Column - + HCO3 Na O2 O2 + Na+ + - + H - OH- + - Anode - Cathode + - H O H CO Membrane Exchange Cation H O 2 Membrane Exchange Cation 2 3 2 Conductivity Detector ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 89 ~ pH 10 OH- Na+ - H O NO3 2 2 Cation Membrane Exchange - + Na+ - + - + H+ - OH- - - Cation Exchange Exchange Membrane Cation - + H+ Cathode - Anode NO3 H O H2O 2 H2O ~ pH 3 Conductivity Detector ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 90 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 91 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 92 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 93 ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, TP. Hồ Chí Minh 2. Tổng hợp các tài liệu của Dionex ThS. Phan Bích Hà Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM 95 ỨNG DỤNG TRÊN MÁY IC Trình bày: Cn. Nguyễn Thị Hà Linh Khoa Xét Nghiệm - Viện VSYTCC TP.HCM Phân tích trên mẫu nước Phân tích các anion • Column: ionpac As22 ( 4x250mm), ionpac AG22 ( 4x250mm); • Eluent: 4.5mmol/L Na2CO3; 1.4mmol/L NaHCO3 • Flow rate: 1.2 mL/min • Injection volume: 2.5µL • SRS suppressor: ASRS 300(2mm) • Background: 20-23µL Phân tích các anion • Column: ionpac As22 ( 4x250mm), ionpac AG22 ( 4x250mm); • Eluent: 4.5mmol/L Na2CO3; 1.4mmol/L NaHCO3 • Flow rate: 1.2 mL/min • Injection volume: 10µL • SRS suppressor: asrs 300(4mm) • Background: 20-23µL >< Phân tích các anion • Column: AS23, AG23 Peak ppb • Eluent: 4.5mmol/L Na2CO3; 1.0mmol/L NaHCO3 • Fluoride 10 • Flow rate: 1.0 mL/min • Chlorite 10 • Detection: suppressed conductivity with CRD-300 • Bromate 5 • Scrubber: 0.5 mol/L KOH • Chloride 100 • Background: < 1.0µL • Chlorate 10 • Bromide 500 • Nitrate 500 • Sulfate 100 Phân tích các anion Phân tích cation Phân tích cation Phân tích trên mẫu thực phẩm Phân tích trên mẫu thực phẩm Phân tích Phương pháp trên IC Anion vô cơ HPIC/ Suppressed Conductivitty, DC Amperometry, UV/Vis Kim loại kiềm thổ HPIC/ Suppressed Conductivity Acid hữu cơ HPIC/ Suppressed Conductivity; HPICE/ Suppressed Conductivity Amine béo HPIC/ Suppressed Conductivity/ Pulsed Amperometry Carbohydrates HPIC/ Pulsed Amperometry Alcolhols/ aldehydes HPICE/ Pulsed Amperometry Amino acids HPIC/ Pulsed Amperometry - - Phân tích NO2 , NO3 trong thịt Phân tích iodide trong sữa bột Phân tích polyphosphates trong phomai Anion trong trà • Column: ionpac AS19(0.4x250mm and AG19(0.4x50mm) • Eluent: KOH(EG) • Flow rate: 10µL/min • Inj.volume: 0.4µL • Detection: suppressed conductivity Phân tích phosphate và citrate trong nước ngọt Phân tích chất hữu cơ trong nước Phân tích đường Phân tích đường monosaccharides trong càphê hòa tan ỨNG DỤNG TRÊN IC