Chuyên đề Kỹ thuật lai phân tử, nguyên tắc và ứng dụng trong kiểm tra động vật chuyển gen

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÁI NGUYÊNKHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM “Chuyên đề: Kỹ thuật lai phân tử, nguyên tắc và ứng dụng trong kiểm tra động vật chuyển gen Thái Nguyên, 2014 Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH Đặt vấn đề Nội dung Kết luận Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH Đặt vấn đề Động vật chuyển gen: là những động vật có hệ gen bị biến đổi bằng cách đưa thêm DNA ngoại lai gắn vào hệ gen của nó. Đoạn DNA ngoại lai dùng để đưa vào cơ thế khác gọi là gen chuyển. Để khẳng định ĐV có được chuyển gen lạ vào hay không người ta phải kiểm tra xem có gen lạ xâm nhập được vào bộ máy di truyền của động vật hay không. Phương pháp thường hay sử dụng đó là các kỹ thuật lai phân tử trên pha rắn (Southern blot, Nouthern blot….) Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH Hình ảnh một số động vật chuyển gene Mèo phát sáng Cá gấu trúc phát sáng Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH Hình ảnh một số động vật chuyển gene Dê tạo tơ nhện Lợn thân thiện với môi trường Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH Nội dung 1. Khái niệm về lai phân tử 2. Các phương pháp lai phân tử 3. Các phương pháp khác 4. Kết luận Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 1.Khái niệm về lai phân tử Lịch sử: - 1960 Julius Marmur và những đồng nghiệp của ông quản lý ngành học tại Đại học Harvard đã khám phá ra quá trình ủ lại (reannealing).Quá trình này bao gồm sự kết hợp của những mạch đơn thành các phân tử 2 mạch đôi bền vững. Từ sự khám phá ra quá trình reannealing phương pháp lai các nucleic được phát triển. - Sử dụng kỹ thuật những mạch bổ sung từ các nguồn khác nhau của acid nucleic có thể trọn lẫn thành dạng phân tử 2 mạch đôi được đặt tên là thể lai (hybrid). Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 1.Khái niệm về lai phân tử => Việc lai phân tử mở rộng ra nhiều kỹ thuật khác nhau và được dùng vào những mục đích đa dạng với mục đích sử dụng lai DNA như 1 kỹ thuật so sánh dùng cặp base bổ sung để đối chiếu bộ gene chứa toàn bộ nội dung di truyền của 2 loài khác nhau và đánh giá những điểm tương đồng giữa chúng Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 1.Khái niệm về lai phân tử *Cơ sở của lai phân tử : là sự biến tính và hồi tính của DNA. Khi 1 phân tử DNA mạch đôi được đun lên 1 nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ nóng chảy Tm thì 2 mạch đơn sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết Hydro nối liền mạch. Sau khi 2 mạch tách rời, nếu nhiệt độ phản ứng được làm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, chúng sẽ bắt cặp trở lại. Hiện tượng này gọi là lai phân tử. * Đặc điểm của lai phân tử: -Đặc hiệu tuyệt đối: Sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa 2 trình tự có trình tự hoàn toàn bổ sung. -Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA dẫn đến sự hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay các phân tử lại DNA-RNA. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 1.1 Các nhân tố ảnh hưởng đến lai phân tử  - Ảnh hưởng của thành phần các base trong phân tử DNA. - Ảnh hưởng của độ dài DNA Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch). Ảnh hưởng của môi trường phản ứng. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 1.1.1 Ảnh hưởng của thành phần base Do số lượng các liên kết hidro giữa A và T, G và C không bằng nhau  (A=T; G =C) nên thành phần các base cấu tạo một DNA mạch đôi có  ảnh hưởng rất quan trọng cho sự bền vững của phân tử này, đặc biệt là  tỷ lệ các base G,C. Trong điều kiện chuẩn , Tm được đánh giá bằng  công thức sau: Tm = 69,3 + 0,41 (% G+C). Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH  1.1.2 Ảnh hưởng của độ dài DNA Đọan DNA càng dài bao nhiêu thì số lượng liên kết hidro nối 2  mạch càng lớn bấy nhiêu và do đó “nhiệt độ nóng chảy” cũng  càng cao. Sự thay đổi Tm theo chiều dài phân tử DNA được tính theo công thức sau: ∆Tm = -500/số lượng cặp base   Công thức trên cho thấy ảnh hưởng của độ dài chỉ quan trọng đối với những đoạn DNA ngắn. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH  1.1.3Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch) + Bắt cặp sai lệch ngoài quy tắc ( A=T, G=C) => Giảm tính ổn định của phân tử lai. + Tm giảm 10ºC => 1% bắt cặp sai lệch. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 1.1.4 Ảnh hưởng của môi trường phản ứng * Ảnh hưởng của nồng độ muối:  + Sự giảm lực ion  sẽ làm giảm nhiệt độ nóng chảy. + Dung dịch càng loãng càng làm mất tính ổn định của chuỗi xoắn kép DNA. * Ngoài ra còn các yếu tố như : nhiệt độ tốc độ phản ứng lai phụ thuộc vào nhiệt độ. Thông thường phản ứng lai đạt cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm của chính nucleic acid đó 25%.   Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 2. Phân loại - Lai trong pha lỏng ( dùng quang phổ kế, nuclease S1 , sắc kí trên hydroxylapatite). - Lai trên pha rắn ( thường sử dụng hơn) : + Southern blot +Nouthern blot +Western blot +Dot ( slot ) blot. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 2.1 Lai trong pha lỏng Nguyên tắc: +Các mạch đơn nằm trong môi trường lỏng là một dung dịch đệm. +Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 2.1.1 Phương pháp dùng quang phổ kế - DNA hấp thụ ánh sáng yếu hơn DNA mạch đôi. - Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn được xác định dễ dàng thông qua việc đo biến động giá trị mật độ quang (OD) ở bước sóng 260 nm. - Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, hiện tượng này có tên gọi là phản ứng siêu sắc (hyperchromic effect). Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 2.1.1 Phương pháp dùng quang phổ kế Nhuộm tím phân tử DNA, nếu đem chúng đun nóng và làm lạnh từ từ thì kết quả là các phân tử DNA sẽ trở nên tím đậm. Nếu hạ nhiệt độ một cách đột ngột thì chúng sẽ trở nên rất đậm. Đó là hiện tượng các mạch đơn DNA hấp thụ tia UV mạnh hơn DNA mạch đôi. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 2.1.2 Phương pháp sử dụng nuclease S1 Nuclease S1 là enzyme thủy giải các nucleic acid mạch đơn bất kể là DNA hy RNA trong một số điều kiện thực nghiệm. Dung dịch phản ứng lai được trích ra một phần đem xử lý với nuclease S1. Các mạch đơn sẽ bị thủy giải, các NA còn lại tương ứng với các phân tử lai được thu nhận qua phương pháp tủa rồi đem định lượng. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 2.1.3 Phương pháp sắc ký trên hydroxylapatite Hydroxylapatite là những tinh thể phosphat calci. Kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu (đoạn nucleotide hoặc kháng thể ) để lai với DNA, RNA hoặc với các protein ở trong các tế bào mà không cần tách chiết. Sau khi bị đốt nóng chúng được làm lạnh để những mạch đơn va chạm ngẫu nhiên. Các hỗn hợp được ủ khoảng 120h ở 600 trong một dung dịch đệm Natri phosphat. Ở nồng độ muối cao chỉ những nucleic mạch đôi mới gắn được vào giá thể này, phần nucleic không gắn sẽ được thu nhận. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 2.2 Lai trên pha rắn * Nguyên tắc: Giống với nguyên tắc lai trên pha lỏng. Khác ở chỗ một trong 2 trình tự bổ sung được cố định trên một giá thể rắn. *Ưu điểm: -Dễ dàng trong thao tác tách các trình tự không lai ra khỏi các phân tử. -ngăn sự tái bắt cặp giữa hai mạch của cùng 1 phân tử. *Nhược điểm: -Phân tích và định lượng các phân tử lai kém chính xác và hiệu quả lai thấp. -Vận tốc lai kém so với lai trên pha lỏng. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 2.2.1 Phương pháp Southern blot Nguyên tắc: Màng lai nitrocelluse có khả nagw tiếp nhậ DNA đã được biết từ lâu và đã được sử dụng trong các nghiên cứ lai nucleic acid khác nhau vào những thập niên 1950 và 1960. Các bước tiến hành: Cắt DNA bằng enzyme giới hạn Điện di sản phẩm cắt trên gel Làm biến tính DNA Chuyển DNA lên màng lai Lai DNA đã được cố định với mẫu dò DNA có đánh dấu Định vị các phân tử lai DNA-mẫu dò. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 2.2.1 Phương pháp Southern blot Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 2.2.2 Phương pháp Nouthern blot Vị trí của mẫu dò được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi nếu nó được đánh dấu phóng xạ. Trong trường hợp mẫu dò được gắn với enzyme thì đem ủ với cơ chất không màu. Enzyme liên kết với nó sẽ biến đổi thành một sản phẩm không màu có thể nhìn thấy hoặc phát ra ánh sáng mà sẽ được phát hiện bằng phim X quang một cách trực tiếp. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 2.2.2 Phương pháp Nouthern blot Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 2.2.3 Phương pháp Western blot Là phương pháp có độ nhạy cao dựa trên tính đặc hiệu của kháng nguyên-kháng thể để phát hiện protein điện di trên gel SDS-PAGE và chuyển lên màng lai. Phương pháp này cho phép xác định sự có mặt, trọng lượng phân tử, định lượng protein có mặt trong các mẫu khác nhau. * Các bước thực hiện: Protein được phân tách bằng điện di trên gel SDS-PAGE Các pr được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí như đã phân tách trên gel. Ủ màng lai với một kháng thể sơ cấp. Tiếp tục ủ màng lai trong hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme. Đặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra do enzyme. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 2.2.3 Phương pháp Western blot Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 2.2.4. Dot và slot blot  Mục đích: Định lượng tương đối cho 1 RNA đặc trưng trong 1 hỗn  hợp RNA mà không cần phải phân tách chúng ra. Phương pháp này  có thể sử dụng cho RNA.  Đặc điểm: Trong phương pháp này người ta không chuyển acid nulceic từ gel lên mà mà đặt trực tiếp 1 lượng mẫu nhỏ lên màng lai ( thành 1 điểm_Dot hay 1 khe_Slot).  Bản phóng xạ tự ghi sau đó đươc phân tích bằng kỹ thuật mật độ kế cho phép ước lượng số lượng các phân tử lai có trong mẫu. Trong thực nghiệm, người ta sử dụng một dụng cụ ( tên là manifold) cho phép đặt một lúc nhiều mẫu DNA hay RNA lên màng lai.  Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 3.Các phương pháp khác Lai tại chỗ Lai khuẩn lạc Lai trên NST Lai trên tế bào và mô. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 3.1 Lai tại chỗ *Định nghĩa: + Lai tại chỗ là một kiểu lai phân tử trong đó trình tự cần tìm nằm ngay trong tế bào hay trong mô + Lai tại chỗ được sử dụng để định vị những đoạn acid nucleic bổ sung với mẫu dò được đánh dấu đặc thù trên NST trong tế bào sinh vật nhận thật hoặc tế bào vi khuẩn. *Nguyên tắc: Nghiên cứu acid nucleic mà không cần giai đoạn tách chiết chúng ra khỏi mô hay tế bào. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 3.2. Lai khuẩn lạc *Mục đích: Dùng để phát hiện dòng vi khuẩn có mang vector tái tổ hợp cần tìm trong một ngân hàng gen. *Các bước tiến hành: - Mỗi khuẩn lạc sẽ để lại vài tế bào vi khuẩn trên màng lai. - Màng lai sau đó sẽ được xử lý bằng NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn và làm biến tính DNA. - Việc cố định trên màng lai và thao tác lai diễn biến theo các bước tương tự như ở các phương pháp lai trên pha rắn. - Kết quả phóng xạ tự ghi của dấu ấn cho phép các định dòng vi khuẩn cần tìm trên hộp petri ban đầu. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 3.2. Lai khuẩn lạc Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 3.3. Lai trên NTS *Mục đích: Cung cấp thông tin chính xác về vị trí và sự phân bố của 1 trình tự DNA cần tìm trên NST nhờ một mẫu dò chuyên biêt. *Các bước thực hiện: Các NST ở giai đoạn trung kỳ (các NST này thường có nguồn gốc từ bạch cầu) được xử lý bằng các kỹ thuật tế bào học trên lame. NTS cố định trên lame được đem lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ. Để phát hiện phân tử lai, người ta sẽ phủ lên lame 1 dịch huyền nhạy cảm với tia xạ. Sau một thời gian cho tia xạ tác động lên huyền dịch. Lame được quan sát dưới kính hiển vi, kết quả thể hiện thành những hạt nằm trong lớp huyền dịch ngay trên vị trí có phân tử lai. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 3.3. Lai trên NTS Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 3.4. Lai trên tế bào và mô *Mục đích: Nghiên cứu chức năng và sự điều hòa biểu hiện của gen cũng như sự tương tác giữa mRNA với các thành phần khác nhau của tế bào và mô. *Ứng dụng: - Trong đối tượng nghiên cứu phức tạp bao gồm nhiều tập hợp tế bào khác nhau như não bộ. - Xác định mối tương quan giữa các hoạt động phiên mã và dịch mã của cùng một gen. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH 4.Kết luận Những phần trên đã trình bày về kỹ thuật lai phân tử, nguyên tắc và ứng dụng trong kiểm tra động vật chuyển gen. Các phương pháp lai phân tử rất có ý nghĩa trong việc kiểm tra động vật chuyển gen nên việc ứng dụng của các phương pháp này đang được sử dụng phổ biến. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH Tài liệu tham khảo Bài giảng CNSHĐV, TS. Nguyễn Văn Duy, khoa CNSH & CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. “Công nghệ sinh học trên người và động vật”, (2007), Phan Kim Ngọc, NXB Giáo dục. Bài giảng “ Công nghệ sinh học thú y”,GS.TS Nguyễn Quang Tuyên, trường Đại học Nông lâm Thái Nguyên. Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH Cảm ơn thầy giáo và các bạn đã chú ý lắng nghe Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH Thành viên nhóm 1. Mạc Văn Dương 2. Nguyễn Thị Thanh Dung 3.Đỗ Thị Hào 4.Nguyễn Thị Hằng 5.Mông Thị Hương 6. Lý Thị Liễu Nhóm SVTH : Nhóm 5 - Lớp 43CNSH