Đánh giá sự kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus ) nuôi ở vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh - Bến tre

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN DUY PHƯƠNG ĐÁNH GIÁ SỰ KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI Ở VÙNG NƯỚC LỢ TỈNH TRÀ VINH - BẾN TRE LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version LỜI CẢM TẠ Xin bài tỏ long biết ơn sâu sắc và chân thành đến Cô Từ Thanh Dung đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, đóng gớp nhiều ý kiến quý báu và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. Thầy cô và các anh chị bộ môn Sinh Học và Bệnh Học Thủy Sản-Khoa Thủy Sản-trường Đại Học Cần Thơ đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện đề tài. Thầy cô và các bạn khoa Nông Nghiệp – Thủy Sản, trường Đại Học Trà Vinh đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện đề tài. Tập thể lớp bệnh học thủy sản K31 đã giúp đỡ tận tình. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version i MỤC LỤC Trang Mục lục ................................................................................................................. i Danh sách bảng ................................................................................................... iii Danh sách hình .................................................................................................... iv PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ ........................................................................................ 1 PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ...................................................................... 3 2.1. Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản ............................................ 3 2.2. Các bệnh thường xuất hiện trên cá tra ......................................................... 3 2.3. Đặc điểm của vi khuẩn Edwardsiella và Aeromonas ................................. 4 2.4. Các nghiên cứu về sự kháng thuốc của vi khuẩn ......................................... 5 2.5. Thuốc kháng sinh dùng trong nuôi trồng thủy sản. ...................................... 7 2.6. Các nhóm kháng sinh thường sử dụng trong nuôi trồng thủy sản ................ 9 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................. 11 3.1. Vật liệu nghiên cứu...................................................................................... 11 3.1.1 Đối tượng .................................................................................................. 11 3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm ................................................................................... 11 3.2. Hóa chất và môi trường ............................................................................... 11 3.2.1 Hóa chất .................................................................................................... 11 3.2.2 Môi trường ................................................................................................ 11 3.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 11 3.3.1 Phương pháp điều tra ................................................................................ 11 3.3.2 Phương pháp thu mẫu ............................................................................... 12 3.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn .............................................................. 12 3.3.4 Phương pháp lập kháng sinh đồ ................................................................ 12 3.3.5 Phương pháp xác định MIC ...................................................................... 13 PHẦN IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN .................................................................. 15 4.1 Kết quả điều tra ........................................................................................... 15 4.1.1 Thông tin chung ........................................................................................ 15 4.1.2 Thông tin về kỹ thuật nuôi: ....................................................................... 16 4.1.3 Tình hình bệnh và sử dụng thuốc-hóa chất ................................................ 17 4.2 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn ...................................................... 19 4.2.1 Kết quả phân lập và chỉ tiêu sinh hóa ........................................................ 19 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version ii 4.2.2 Kết quả định danh vi khuẩn E. ictaluri và Aeromonas sp bằng bộ kit API 20E .................................................................................................... 21 4.3 Kết quả kháng sinh đồ ................................................................................. 21 4.3.1 Kết quả làm kháng sinh đồ Aeromonas sp ................................................. 23 4.3.2 Kết quả làm kháng sinh đồ E. ictaluri ...................................................... 25 4.4 Kết quả giá trị MIC ...................................................................................... 26 4.4.1 Giá trị MIC của vi khuẩn Aeromonas sp .................................................. 27 4.4.2 Giá trị MIC của vi khuẩn E. ictaluri ......................................................... 27 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ............................................................... 29 5.1 Kết luận ....................................................................................................... 29 5.2 Đề xuất ........................................................................................................ 29 PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................. 30 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 34 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iii DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Diện tích mặt nước trung bình của các hộ nuôi .................................... 16 Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra các đặc điểm hình thái, sinh hóa của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và Aeromonas sp............................................................... 19 Bảng 4.3. Giá trị MIC của vi khuẩn Aeromonas sp ............................................ 27 Bảng 4.4. Giá trị MIC của vi khuẩn E. ictaluri ................................................... 28 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version iv DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Các con đường trao đổi sự kháng thuốc của vi khuẩn giữa động vật và con người (Prescott ., 2000). ............................................................................. 8 Bảng 4.1 Bản đồ địa chính tỉnh Bến Tre và Trà Vinh ........................................... 15 Hình 4.2 Các loại kháng sinh thường được sử dụng ở Trà Vinh và Bến Tre ......... 18 Hình 4.3 Cá tra bị bệnh mủ gan. .......................................................................... 20 Hình 4.4 Cá tra bị bệnh xuất huyết. ...................................................................... 20 Hình 4.5 Khuẩn lạc Aeromonas spp phát triển trên môi trường TSA. ................... 20 Hình 4.6 Khuẩn lạc E. ictaluri phát triển trên môi trường TSA ............................ 20 Hình 4.7 Vi khuẩn E. ictaluri gram âm, que ngắn ................................................ 21 Hình 4.8 Vi khuẩn Aeromonas sp gram âm, que ngắn .......................................... 21 Hình 4.9 Kết quả định danh Aeromonas spp bằng bộ kit API 20E ....................... 22 Hình 4.10 Kết quả kháng sinh đồ chủng Aeromonas sp ....................................... 22 Hình 4.11 Tỷ lệ phần trăm kháng thuốc kháng sinh của các chủng vi khuẩn Aeromonas sp ...................................................................................................... 23 Hình 4.12 Tỷ lệ phần trăm kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri .......................................................................................... 25 Hình 4.13 Kết quả MIC của Aeromonas sp ở nồng độ 2 µg/ml ............................ 28 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version TÓM TẮT Mục tiêu của nghiên cứu là đánh giá sự kháng thuốc của hai loại vi khuẩn Aeromonas spp và Edwardsiella ictaluri bệnh trên cá tra (pangasianodon hypophthamus) nuôi ở vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh và Bến Tre. Kết quả khảo sát ban đầu cho thấy 100% số hộ nuôi được phỏng vấn đều sử dụng thuốc kháng sinh để phòng và trị bệnh. Kết quả phân lập, kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản và định danh bằng bộ kit API 20E xác định được 20 chủng vi khuẩn gây bệnh trên cá tra trong đó có 12 chủng E. ictaluri và 8 chủng Aeromonas spp. Để đạt được mục tiêu đề ra, phương pháp lập kháng sinh đồ với 7 loại thuốc kháng sinh được thực hiện trên 20 chủng vi khuẩn đã tìm được. Kết quả cho thấy đa số chủng E. ictaluri đã kháng với florfenicol (50%), chloramphenicol (58%) và tetracycline (42%), nhưng với ampicillin và cefazoline đều nhạy với 100% số vi khuẩn E. ictaluri phân lập được. Kết quả không tìm thấy vi khuẩn Aeromonas spp kháng với florfenicol và chloramphenicol, trong khi đó có tới 50% vi khuẩn Aeromonas spp kháng với streptomycine và 100% kháng với cefazoline. Phương pháp pha loãng thuốc kháng sinh trên môi trường lỏng dựa theo tài liệu Clinical and Laboratory Standards Institure (CLSI), (2006b) được sử dụng làm MIC trên ba loại kháng sinh chloramphenicol, oxytetracycline và streptomycine. Kết quả đã tìm thấy E. ictaluri kháng với chloramphenicol ở mức cao (6/8 chủng). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 1 PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1. Giới thiệu Thủy sản được xem là một trong những ngành kinh tế quan trọng của Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL). Những năm gần đây đã phát triển rất nhanh, góp phần tích cực vào việc nâng cao nguồn thu nhập của cộng đồng và tăng kim ngạch xuất khẩu. Trong vòng 10 năm từ 1995 đến 2005, diện tích nuôi trồng thủy sản vùng ĐBSCL đã tăng hơn 2,37 lần và sản lượng tăng vọt hơn 3,68 lần (Lê Tuấn Anh, 2008). Cùng với sự phát triển khá nhanh về sản lượng, diện tích nuôi và mô hình nuôi thủy sản, nghề nuôi cá tra có tốc độ phát triển cao nhất. Theo thống kê của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn cho thấy sự phát triển khá nhanh về diện tích nuôi cá tra. Sáu tháng đầu năm 2007 tổng diện tích nuôi gần 5.000 ha và đến sáu tháng đầu năm 2008, diện tích đã tăng lên đạt gần 6.000 ha, và sản lượng cá cũng tăng theo rất nhanh từ 1 triệu tấn của năm 2007 có thể tăng lên 1,2 triệu tấn trong năm 2008. Ngoài những tỉnh có truyền thống nuôi cá tra như Đồng Tháp, An Giang, gần đây những tỉnh như Sóc Trăng, Trà Vinh và Bến Tre cũng đầu tư phát triển. Năm 2007, ngành thủy sản Bến Tre tập trung nuôi các đối tương: tôm sú, tôm càng xanh, nghêu và cá da trơn. Tổng diện tích nuôi thủy sản năm 2007 là 43.000 ha. Trong đó, diện tích nuôi cá da trơn 230 ha, với năng suất 35.000 tấn. ( cập nhật ngày 28/11/2008). Nuôi trồng thủy sản đang phát triển mạnh trên nhiều khía cạnh về diện tích nuôi, mức độ thâm canh, loại hình nuôi, đầu tư cơ sở hạ tầng và chế biến sau thu hoạch. Việc sử dụng thuốc, hóa chất đóng góp không nhỏ cho sự phát triển của ngành trong việc cải tạo, duy trì chất lượng môi trường nuôi và trong các trường hợp bệnh bộc phát cần đến sự can thiệp của thuốc-hóa chất. Tuy nhiên, việc sử dụng và quản lý thuốc, hóa chất trong nuôi trồng thủy sản còn rất nhiều hạn chế do trình độ của người nuôi và người cung cấp. Điều đó dẫn đến việc sử dụng không đúng các loại thuốc kháng sinh. Theo điều tra của Mai Văn Tài (2004) có tới 138 loại kháng sinh đã được sử dụng trong các loại hình nuôi và sản xuất giống thủy sản ở Việt Nam. Khi việc sử dụng kháng sinh quá mức, không được kiểm soát để trị bệnh cho cá, tôm thì một điều tất yếu sẽ xảy ra đó là vấn đề kháng thuốc của các chủng vi khuẩn gây bệnh đồng thời gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người. Và như vậy thì việc phòng và xử lý bệnh cho động vật thủy sản củng như con người sau này sẽ gặp rất nhiều khó khăn. Vấn đề kháng thuốc kháng sinh của các chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản từ lâu cũng đã được nhiều tác giả nghiên cứu và đã xác được nhiều nhóm vi khuẩn phân lập được từ các ao nuôi cá da trơn đã kháng với nhiều loại kháng sinh như Oxytetracycline, Tetracycline, Ampiciline, …(Depaola et al, 1995; Matyar et al., 2004; Mohamed Nawaz et al., 2006). Ở PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 2 Việt Nam sự kháng thuốc kháng sinh của các dòng vi khuẩn phân lập từ các ao nuôi thủy sản ở ĐBSCL cũng đã được nghiên cứu và cũng tìm thấy được 169 dòng vi khuẩn kháng với 6 loại kháng sinh thường dùng để trị bệnh cho động vật thủy sản (Nguyễn Thanh Phương và ctv., 2005). Gần đây, Từ Thanh Dung và ctv (2008) nghiên cứu sự kháng thuốc của 64 chủng Edwardsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra đã tìm ra đa số kháng với streptomycin (83%), oxytetracyline (81%)… Trong thời gian gần đây thì cá tra cũng đã được nhiều người dân ở các tỉnh Trà Vinh, Bến Tre, Sóc Trăng đưa về nuôi ở những vùng nước lợ, hiện nay việc kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên cá tra nuôi ở vùng nước ngọt khá phổ biến vậy còn cá tra nuôi ở vùng nước lợ thì sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh sẽ như thế nào? Do đó, vấn đề hết sức cấp thiết hiện nay là nghiên cứu sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên cá tra nuôi ở vùng nước lợ xảy ra như thế nào để góp phần giảm thiểu thiệt hại về kinh tế, tăng năng suất và sản lượng cá tra do sự kháng thuốc của vi khuẩn gây ra. Vì vậy mà đề tài “Đánh giá sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh và Bến Tre” được thực hiện. 1.2 Mục tiêu đề tài Đánh giá sự kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh mủ gan, xuất huyết trên cá tra nuôi ở vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh và Bến Tre đồng thời tìm những loại thuốc đặc hiệu để tạm thời điều trị 2 loại bệnh nguy hiểm này khi cần thiết nhằm làm giảm thiệt hại cho người nuôi. 1.2.1 Nội dung thực hiện: Điều tra tình hình sử dụng kháng sinh của các hộ nuôi cá tra ở vùng nước lợ hai tỉnh Trà Vinh và Bến Tre. Phân lập, định danh và lập kháng sinh đồ của 20 chủng vi khuẩn gây bệnh (E.ictaluri và Aeromonas spp). Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chủng vi khuẩn gây bệnh trên. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 3 PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản Nghề nuôi trồng thủy phát triển rất mạnh ở nước ta nói chung và ở Đồng Bằng Sông Cửu Long nói riêng trong thời gian gần đây làm cho môi trường nuôi ngày càng xấu đi nghiêm trọng, sự bùng phát của dịch bệnh xảy ra ngày càng nhiều. Sự lan truyền dịch bệnh trong thủy sản đã dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng về kinh tế - xã hội, môi trường và thương mại quốc tế khó mà tính toán được. Tại Việt Nam, mỗi năm có hàng nghìn hộ dân nuôi luân canh tôm lúa bị thua lỗ do tôm bị chết, tổng thiệt hại trên 4,5 tỉ đồng, trong các năm 1995-1997 có khoảng 4.000 trong số 5.000 lồng nuôi cá trắm cỏ bị bệnh đốm đỏ gây thiệt hại 500.000 USD (Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản I., 1998, trích dẫn bởi www.fistenest.gov.vn cập nhật ngày 31/10/2008). Trong số các bệnh của thuỷ sản thì nguyên nhân chủ yếu là do vi khuẩn gây ra với những vụ dịch bệnh có qui mô lớn. Thông thường, người ta sử dụng thuốc kháng sinh để kiểm soát các vi khuẩn gây bệnh. Do việc sử dụng không đúng cách và quá nhiều các loại thuốc kháng sinh được sử dụng sai nên đã gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc và tích tụ dư lượng thuốc kháng sinh trong thịt thuỷ sản. Một nguyên nhân khác gây ra hiện tượng vi khuẩn kháng thuốc là việc sử dụng các loại kháng sinh với hàm lượng nhỏ trong thức ăn của thuỷ sản như một chất kích thích sinh trưởng (Mai Văn Tài và ctv., 2004). Đối với tác nhân gây bệnh là vi khuẩn thì các loài vi khuẩn gây bệnh cho một số đối tượng nuôi quan trọng mà Việt Nam phải đối mặt đó là Vibrio harveyi, Aeromonas hydrophila, Pseudomonas flouresent, Streptococcus sp., Edwardsiella tarda, Edwardsiella ictaluri…(Bùi Quang Tề, 2006). Riêng đối với cá tra một số tác giả đã tìm thấy một số bệnh phổ biến như: bệnh gan thận mủ do vi khuẩn E. ictaluri, bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila, A. sobria và A. caviae. Trong đó, vi khuẩn E. ictaluri là nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế nguy hiểm nhất trong các mô hình nuôi công nghiệp ở ĐBSCL. Ký sinh trùng thuộc nhóm nội ký sinh protozoa bao gồm vi bào tử trùng (Microsporidium), bào tử trùng (Myxobolus spp., Henneguya spp.), trùng roi (Trypanosoma sp.), trùng lông nội ký sinh (Balantidium, Ichthyonyctus sp.),. Nhóm ngoại ký sinh gồm trùng quả dưa (Ichthyophthirius multifiliis), trùng mặt trời (Trichodina spp.) và trùng loa kèn (Epistylis sp.). Một số loài ký sinh trùng thuộc nhóm ký sinh đa bào như Metazoa đã tìm thấy trên cá như Monogenea (Thaparocleidus spp.) và 1 số loài khác thuộc nhóm trematoda. Một số bệnh chưa rõ tác nhân như hội chứng thịt philê có những đốm đỏ hoặc vàng da (Dung et al., 2008). 2.2 Các bệnh thường xuất hiện trên cá tra Dịch bệnh trên cá tra nuôi xảy ra quanh năm, kể cả mùa khô và mùa mưa nhưng nặng nhất vào lúc giao mùa, thời tiết và nhiệt độ thay đổi đột ngột kế đó là mùa mưa và mùa nước đỗ (Từ Thanh Dung và ctv., 2005). Các bệnh PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 4 thường gặp trên cá tra là: bệnh nhiễm khuẩn, xuất huyết, bệnh đốm đỏ, bệnh gan thận có mủ, lở loét, bệnh ký sinh trùng…(Bùi Quang Tề, 2006). Bệnh mủ gan trên cá tra xuất hiện đầu tiên vào mùa lũ năm 1998 ở các tỉnh nuôi thâm canh cá tra phát triển như An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ. Sau đó bệnh lây lan sang các vùng nuôi cá tra lân cận. Đặc biệt, những năm gần đây bệnh xuất hiện cả một số tỉnh mới phát triển nuôi cá tra như Trà Vinh, Bến Tre và Sóc Trăng. Bệnh mủ gan đã được nghiên cứu và mô tả đầu tiên ở Việt Nam vào năm 2001 do Fugerson và ctv. Qua nghiên cứu của Từ Thanh Dung và ctv (2004) cho thấy bệnh xuất hiện cuối năm 1998 và trở nên trầm trọng vào năm 1999. Ở ĐBSCL bệnh thường xuất hiện trong suốt mùa lũ. Tuy nhiên, bọc phát cao điểm vào tháng 7-8. Bệnh xuất hiện và gây thiệt hại chủ yếu ở giai đoạn cá con, cả cá nuôi ao và nuôi bè. Theo điều tra của Trần Anh Dũng (2005), tần số xuất hiện bệnh mủ gan do Edwadsiella ictaluri gây ra chiếm 61%. Nguyễn Tấn Duy Phong (2008), tần số này lên đến 93,8% số hộ nuôi cá ở Cần Thơ và An Giang, tỉ lệ cá chết khi bị bệnh này có thể lên đến 90,0%. Ngoài ra, trên cá tra còn có một số bệnh như bệnh xuất huyết đốm đỏ xảy ra ở mọi lứa tuổi, tần số 75,0% số hộ nuôi. Bệnh trắng mang, bệnh vàng da, lồi mắt, nổ mắt có tần số xuất hiện thấp hơn. 2.3 Đặc điểm của vi khuẩn Edwadsiella và Aeromonas 2.3.1 Vi khuẩn Edwadsiella Edwardsiella thuộc họ Enterobacteriaceae có đặc điểm Gram âm, hình que mãnh, yếm khí tuỳ tiện, catalase dương, Cytocrom oxidase âm oxy hoá âm và lên men trong môi trường O/F glucose. Thường gặp hai loài: E. tarda và E. ictaluri (Bùi Quang Tề, 2006) Vi khuẩn E. ictaluri được báo cáo đầu tiên vào năm 1979, là tác nhân gây bệnh viêm ruột nhiễm khuẩn huyết (ESC-Enteris Septicaemia of Catfish) trên cá nheo Mỹ (Ictalurus punctatus) (Hawke, 1979). Năm 2001, ở Việt Nam E. ictaluri đã được Fugerson và ctv (2001) phân lập và ghi nhận xuất hiện đầu tiên trên cá tra bị bệnh mủ gan ở ĐBSCL vào năm 1998 (Fugerson et al., 2001; Crumlish et al., 2002; Nguyễn Hữu Thịnh và Trương Thanh Loan, 2007). Ngoài ra, theo Từ Thanh Dung và ctv (2005) vi khuẩn này là tác nhân gây bệnh mủ gan trên cá tra ở cá tỉnh nuôi cá tra thâm canh như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, sau đó bệnh lan dần sang các vùng nuôi lân cận. Đặt biệt, trong thời gian gần đây bệnh này cũng đã xuất hiện ở một số tỉnh mới nuôi cá tra