Đề tài Chiết xuất polyphenol từ vỏ cam dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm

Mục lục Lời mở đầu Những năm gần đây, thế giới đang có xu hướng quay về với các hợp chất tự nhiên, ưu tiên sử dụng các hoạt chất tự nhiên trong việc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe con người [1]. Ở Việt Nam, chi cam chanh (citrus) là một trong các chi có giá trị kinh tế quan trọng và được trồng rộng rãi khắp nước ta, đặt biệt là ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Có đến 76% cam chanh được sản xuất từ vùng này và sản lượng cũng cao hơn so với bình quân của cả nước: 12,9 tấn/ha so với 10.5 tấn/ha [2]. Trái cây và dịch ép trong chi Citrus cũng là nguồn tài nguyên quan trọng chứa các hợp chất tự nhiên chống oxi hóa như acid ascorbic, flavonoids, hợp chất phenolic và pectin. Flavanon, flavon and flavonol là ba loại flavonoid chính trong chi Citrus và cụ thể hơn là các thành phần như: hesperidine, narirutin, naringin and eriocitrin. Chúng ngày càng được quan tâm và chú ý nhiều hơn không chỉ liên quan đến khả năng chống oxy hóa của chúng mà còn là khả năng chống tác nhân gây ung thư và viêm nhiễm nhờ khả năng chống peoxyd hóa chất béo [1]. Trong tài liệu này, chúng tôi muốn trình bài một phương pháp chiết xuất với sự hỗ trợ sóng siêu âm (UAE) các polyphenols (flavanone glycosides) từ vỏ cam, một nguyên liệu đơn giản và rẻ tiền, dễ tìm ở Việt Nam. Phương pháp này hứa hẹn nhiều tiềm năng ở quy mô công nghiệp trong lĩnh vực chiết xuất các hoạt chất tự nhiêncó khả năng chống oxi hóa thay thế cho các chất chống oxi hóa tổng hợp từ phòng thí nghiệm. PHẦN TỔNG QUAN Khái niệm về siêu âm (ultrasound): Khái niệm Siêu âm là một dạng sóng điện từ cao tần (>20 KHz) tai người không nghe được (20 KHz > 1-16 KHz). Tần số: 10.000 KHz (> 10 MHz) dùng trong y học, 20 - 100 KHz sử dụng trong kỹ thuật định vị, 20 - 40 KHz sử dụng để tẩy sạch (nha, kim hoàn). Siêu âm làm dung môi (tại các hốc ở bề mặt tiếp xúc) bị sủi bọt, đẩy tạp chất ra khỏi bề mặt mẫu. Bản chất sóng siêu âm khác với sóng điện từ. Nguyên tắc, cơ chế hoạt động của siêu âm Khi xuyên qua cơ thể, chỉ một lượng rất nhỏ của sóng siêu âm bị các mô hấp thụ và chuyển thành nhiệt năng. Sự tỏa nhiệt này không kéo dài, không làm tăng bề mặt nhiệt độ tại chỗ. Phần lớn năng lượng của sóng siêu âm chuyển thành cơ năng (làm rung). Sự rung kéo dài sẽ làm vỡ các bọt khí tại chỗ, gây tổn thương tại chỗ, đôi khi nghiêm trọng. Dưới tác dụng của siêu âm: dung môi tại các hốc nhỏ/dược liệu bị sủi bọt, đẩy chất cần chiết ra khỏi dược liệu, chất tan vào trong dung môi (chiết xuất). Ưu điểm: - Thiết bị tương đối đơn giản, bảo quản và vận hành đơn giản, thiết bị không quá đắt tiền. - Chiết được nhiều nhóm hoạt chất, dung môi chiết khá đa dạng -Lượng mẫu: có thể lên đến hàng trăm gam. - Giảm được nhiệt độ và áp suất, ưu điểm này được ưu tiên áp dụng để chiết cho các hoạt chất không bền với nhiệt. - Tăng được khối lượng dịch chiết và rút ngắn được thời gian chiết, và như vậy cũng kéo theo tiết kiệm năng lượng đầu vào. Như trong nghiên cứu này, lượng phenolic toàn phần thu được bằng UAE trong thời gian 15 phút cao hơn đáng kể so với chiết bằng SE trong thời gian 60 phút. Nhược điểm: - Dung môi khó được làm mới trong suốt quá trình chiết xuất, vì vậy hiệu lực của nó là một hàm số phụ thuộc vào hệ số phân ly. - Thời gian lọc và rửa dịch chiết kéo dài, vì vậy sẽ tốn nhiều dung môi, làm mất một lượng dịch chiết hoặc dịch chiết có thể bị nhiễm bẩn. - Sự thoái hóa bề mặt của đầu dò theo thời gian sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất chiết. Phạm vi ứng dụng của siêu âm Phạm vi ứng dụng của siêu âm là khá rộng. Chiết xuất nhiều nhóm hợp chất từ nhiều dược liệu khác nhau đặt biệt là những chất dùng cho thực phẩm. Làm sạch bề mặt Phá hũy cấu trúc tế bào Phân tán Nghiền mịn tinh thể Tiến trình nghiền mịn Al(OH)3 dưới kính hiển vi Các bọt khí (nếu có) trong dung môi (HPLC) cũng bị phá vỡ (ứng dụng để chuẩn bị dung môi cho HPLC) . Tổng quan thành phần về hóa học của Cam Sơ lược về cây cam: Tên khoa học: Citrus sinensis (L) Osbeck. Họ Rutaceae Cây nhỡ, cao đến khoảng 10 m, ít hoặc không có gai. Lá thường xanh dài khoảng 4-10 cm, mọc so le, cuống lá có cánh nhỏ. Hoa màu trắng, mọc thành chùm từ 6-8 hoa ở kẽ lá. Quả hình cầu, khi chín có màu vàng da cam. Loài cam là một cây lai được trồng từ xưa, có thể lai giống giữa loài bưởi (Citrus maxima) và quít (Citrus reticulata). Cam bắt nguồn từ Đông Nam Á, có thể từ Ấn Độ, Việt Nam hay miền nam Trung Quốc. Trên thế giới, cam được trồng ở các nước vùng Địa Trung Hải, Bắc Phi, Mỹ, Nam Mỹ, Trung Quốc và các nước Đông Nam Á. Bang Florida (Hoa Kỳ) và Brazin là vùng sản xuất Cam lớn nhất thế giới. Lượng sản xuất cam tính theo tấn (trong năm 2004): Brazin 18.256.500, Hoa Kỳ 11.729.900. 96% sản lượng được chế biến thành nước quả, bã còn lại chế biến thức ăn gia súc. Vỏ quả được ép lấy tinh dầu, chế biến pectin và các hợp chất flavonoid. Bộ phận dùng: Vỏ quả, dịch quả, hoa và lá Thành phần hoá học: Vỏ quả có các hợp chất flavonoid, pectin, tinh dầu (0.5%), thành phần chính của tinh dầu là limonene (>90%), các alcol, aldehyde(<3%) gồm citral và decylaldehyde, methyl ester của acid antranilic. Trong thành phần ăn được của quả có nước (80-90%), protid (1.3%), lipid (0.1-0.3%), đường (12-12.7%), vitamin C (45-61 mg%), acid citric (0.5-2%). Hoa cam có chứa tinh dầu. Thành phần chính của tinh dầu hoa cam là limonene, linalool, methylanthranilat(0.3%). Hạt có dầu béo, coumarin, limonin. Dầu béo chứa acid palmitic, acid stearic, acid oleic, beta-sitosterol. Các coumarin bao gồm imperatorin, bergapten, aurapten, 7-geranyl oxycoumarin, 6-methoxyaurapten deacetylnimilin, xanthotoxol, aloimperatorin, isopimpinelin, prangenin, prangenin hydrat.       Các flavonoid thuộc chi Citrus phần lớn thuộc nhóm flavanon: Hesperidin (7-Rutinosid Hesperitin) Naringin (Naringenin-7-neohesperidosid) Eriodictiosid (Eriodictyol-7-rhamnosid) Eriocitrin (Eriodictyol-7-rutinosid) . Thành phần của flavonoid trong nước ép cam, quýt Thành phần hóa học chính trong vỏ quả là Flavonoid  Hoạt chất chính : bao gồm chủ yếu là naringin, hesperidin, narirutin,và neohesperidin.  Cấu trúc, tính chất lý hóa của nhóm polyphenol (flavanone) Flavonoid là nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật. Rau quả thường dùng (hơn ½) chứa flavonoid. Có khoảng 4.000 chất đã được xác định cấu trúc. Khung Flavonoid: C6 – C3 – C6 sdiphenyl propan Phân loại Flavonoid theo khung genin: gồm 3 loại: Eu-Flavonoid, Iso-Flavonoid, Neo-Flavonoid. Sự phân loại flavonoid phụ thuộc vào : - Vị trí của vòng B (gốc aryl) - Mức độ oxy hóa của mạch 3C Eu-flavonoid: gốc aryl ở vị trí C2 Công thức Flavanon: Hesperitin: Hesperidin: Naringenin Naringin: Lý tính : Flavanone không màu vì cấu trúc có ít nhóm –OH, không mùi, vị đắng. Độ tan khác nhau: dạng glycosid dễ tan trong nước và các dung môi phân cực, dạng aglycon tan được trong dung môi hữu cơ, khó tan trong nước. Nếu mạch dài thì có thể tan trong nước nóng. Có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại, thường phát quang màu vàng. Cực đại hấp thu/UV flavanon : band II là 275-295nm và band I là 300-330 nm  Phổ UV của Hesperidin Phổ UV của Naringin: band II là 282 nm, band I là 326 nm Phổ IR của Naringenin Hoá tính : Vòng dihydropyron kém bền nên dễ bị mở vòng bởi kiềm hoặc acid để chuyển thành chalcon có màu vàng đậm. Hesperitin và Naringenin thể hiện các tính chất của flavonoid: - Tính chất của nhóm -OH phenol: có tính acid yếu nên có khả năng: Tạo glycosid với đường hoặc dẫn xuất của đường. Tạo muối: với kiềm loãng tạo ra muối phenolat kém bền và tạo sulfat-glycosid (-OH thành –OSO3K). Tạo phức với kim loại (Al3+, Fe3+, Mg2+, Pb2+, Zn2+, Zr2+). - Vòng -pyron: + Tính kiềm yếu tác dụng với acid tạo muối kém bền nhóm -OH ở C-5,7,4' làm tăng tính kiềm của vòng C + Tính oxi hóa khử khi khử vòng -pyron tạo vòng pyrilium (tăng màu )   khi oxi hóa flavanon flavanonol flavon flavonol - Vòng thơm: phản ứng thế azoic flavanon/Na2SO3 + thuốc thử diazonium ra màu đỏ cam tác nhân là p-nitroanilin, acid sulfanilic đã được diazo hóa điều kiện môi trường kiềm, có H ở ortho/para với nhóm OH, không cản trở lập thể. PHẦN THỰC NGHIỆM Vị trí – mục đích của nghiên cứu này Cho đến nay - tháng 2, 2009 - từ các báo cáo công bố, các kỹ thuật chiết xuất phenols từ vỏ cam đã được tiến hành như: Chiết bằng dung môi hữu cơ (Anagnostopoulou et al., 2006; Jeong et al., 2004; Li et al., 2006a; Manthey & Grohmann, 1996; Xu, Ye, Chen, & Liu, 2007; Zia-ur-Rehman, 2006) Chiết bằng nước nóng (Xuet al., 2008) Chiết bằng kiềm (Bocco et al., 1998; Curto, Tripodo, Leuzzi, Giuffrè, & Vaccarino, 1992) Chiết xuất dựa trên resin (Calvarano, Postorino, Gionfriddo, Calvarano, & Bovalo, 1996; Kim, Kim, Lee, & Kim, 2007) Chiết xuất dưới sự hỗ trợ của enzyme (Li et al., 2006b) Chiết xuất dựa trên chùm electron và bức xạ g (Kim, Lee, Lee, Nam, & Lee, 2008; Oufedjikh, Mahrouz, Amiot, & Lacroix, 2000) Và chiết xuất bằng dung môi siêu tới hạn (Giannuzzo, Boggetti, Nazareno, & Mishima, 2003). Các kỹ thuật chiết xuất này có thể gặp hạn chế hoặc là làm giảm hoạt tính hay biến tính chất cần chiết do nhiệt độ cao và thời gian chiết kéo dài như khi chiết bằng dung môi, hoặc là các vấn đề về an toàn đối với sức khỏe trong quá trình chiếu xạ… Đối với kỹ thuật chiết với sự hổ trợ của enzyme, thì còn gặp hạn chế do vấn đề biến tính của enzyme. Những năm gần đây, cùng với sự phát triển các quan niệm về "Hóa Học Xanh", người ta càng quan tâm hơn đến các kỹ thuật thân thiện với môi trường thì việc chiết xuất các hoạt chất có hoạt tính sinh học dưới sự hổ trợ của sóng siêu âm (20 -100 kHz) là một kỹ thuật tiềm năng trong thời gian tới. Kỹ thuật này cho độ lập lại cao, thời gian chiết xuất ngắn, vận hành đơn giản, giảm nhiệt độ, giảm tiêu thụ dung môi chiết, và năng lượng. Các báo cáo dùng kỹ thuật chiết có hỗ trợ của sóng siêu âm (UAE) đối với các phenolic gần đây: Chiết xuất hesperidin tử vỏ quýt (Penggan - Citrus reticulata) (Ma, Chen, Liu, & Ye, 2008a) Chiết xuất phenolic acids và flavanone glycosides từ vỏ quýt Satsuma (Satsuma Mandarin - Citrus unshiu Marc) Ma, Chen, Liu, & Ye, 2009; Ma et al., 2008b) Chiết xuất phenolic toàn phần từ vỏ Quýt (Penggan - Citrus reticulata) (Ma, Chen, Liu, & Ye, 2008a) Trong các nghiên cứu này, methanol tỏ ra làm một dung môi chiết thích hợp, cho kết quả tốt đối với các phenolic đã đề cập. Tuy nhiên, các dung môi hữu không độc cấp thực phẩm (non-toxic food grade solvent) và thân thiện hơn với môi trường như ethanol, n-butanol và iso propanol thì được khuyến cáo bởi FDA cho mục đích chiết xuất (Bartnick, Mohler, & Houlihan, 2006). Các công bố chiết xuất polyphenols bằng UAE gần đây: Đối tượng Nhóm chất Ghi chú Tác giả Quýt – Satsuma MandarinCitrus unshiu Marc Phenolic acids (PA) Thời gian UAE = 10–40 min; lượng PA thu được tương đương với 8h ngấm kiệt Ma et al. (2009) Du Zhong YeFolium eucommiae Flavonoids UAE hiệu quả hơn chiết nhiệt, vi sóng- và chiết xuất với sự hổ trợ của enzyme Huang, Xue, Niu, Jia, and Wang (2009) Wheat branTriticum aestivum Phenolics-rich heteroxylans Thời gian chiết từ 60 min (phương pháp thông thường) xuống còn 5 min (UAE) Hromádková, Košt’álová, and Ebringerová (2008) Quýt - PengganC. reticulata Hesperidin So với chiết bằng Soxhlet, lượng hesperidin thu được gần nhau nhưng hesperidin ít bị biến tính hơn ở UAE Ma et al. (2008c). Quýt - Satsuma mandarinC. unshiu Marc Phenolic acids và flavanone glycosides So với phương pháp ngấm kiệt, UAE tăng lượng polyphenol thu được và cả về hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết. Ma et al. (2008b) PengganC. reticulata Phenolic toàn phần (TPC) TPC tăng khi tăng thời gian chiết on increasing irradiation time and temperature Ma et al. (2008a) Cây chỉ suốt Winged burning bushEuonymus alatus Flavonols rutin và quercetin Khi scan bằng kính hiển vi điện tử, UAE chứng minh phá màng tế bào rất nhanh so với ngấm kiệt Yang and Zhang (2008) Và trong các nghiên cứu được công bố trước đó, thì chưa có nghiên cứu nào sử dụng sự hỗ trợ của sóng siêu âm để chiết xuất phenolic từ vỏ cam mà sử dụng dung môi cấp thực phẩm (food grade solvent). Nghiên cứu này khảo sát tiềm năng của việc ứng dụng UAE để chiết xuất làm giàu các polyphenols (đặc biệt flavanone glycosides) từ vỏ cam với dung môi cấp thực phẩm. Chiết xuất các polyphenol từ vỏ cam với sự hổ trợ sóng siêu âm Nguyên liệu: Dùng khoảng 10 kg vỏ cam. Thu thập xong chúng được lưu giữ trong tủ đông ở nhiệt độ -20 0C. Hóa chất Dung môi phân tích (công ty VWR International , Darmstadt, Đức)   Flavanone glycosides (naringin, hesperidin) ( hãng Extrasynthese , Genay, Pháp) Caffeic acid ( hãng Sigma-Aldrich, Steinhaus, Đức) Trolox (hãng Acros Organics Slangerup, Đan Mạch) DPPH (2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl) (hãng Alfa Aesar , Karlsruhe, Đức)  AAPH ((2,20-azobis (2-methyl) propionamidine-dihydrochloride) (hãng Sigma-Aldrich, Steinhaus, Đức) Fluoresceine (hãng Acros Organics , Morris Plains, Hoa Kỳ) Thiết bị siêu âm:   Sự chiết xuất có hỗ trợ bằng siêu âm (UAE) được thực hiện bằng máy Sonifier PEX 3 (R.E.U.S, Contes, France) bao gồm một bình inox có kích thước 23 x 13.7cm, dung tích tối đa là 3 lít, và một bộ biến năng, bình được hoạt động với tần số 25 kHz, với cường độ siêu âm đầu vào tối đa là 150 W. Các lớp vỏ che kép của hệ thống làm mát/sưởi ấm đi kèm giúp kiểm soát nhiệt độ trung bình. Cường độ siêu âm đầu ra của máy siêu âm là 150W trong khi cường độ siêu âm hao phí trung bình khoảng 60 W, điều này được đo bằng phép đo nhiệt lượng. Xem sơ đồ chi tiết ở Hình.1 Hình 1 Sơ đồ chi tiết máy siêu âm Sonifier PEX 3 Phân tích HPLC Sử dụng hệ thống HPLC Waters bao gồm: 1 bơm 600E Waters 1 bơm mẫu tự động Water 717 Đầu dò màng quang diot Waters 2996 Hệ thống bơm HPLC, bơm mẫu tự động, nhiệt độ cột và hệ thống màng quang diot được theo dõi và kiểm soát bởi phần mềm Data Chromatography Waters Empower 2. Sử dụng bước sóng 280nm để định lượng flavanones glycosides với đầu dò diot. Các cột được sử dụng: Cột phân tích: Purospher Star RP – 18e ( 250 x 4mm I.D, 5) Tiền cột: RP – 18 (4 x 4mm I.D, 5) Cả 2 cột được giữ ở nhiệt độ 37oC, tốc độ dòng 1 mL/phút Pha động gồm acid acetic 0.5% (A) và acetonitrile 100% (B). Tỉ lệ thể tích của 2 dung môi thay đổi theo thời gian: 10 – 30% (B) trong 20 phút, sau đó tỉ lệ (B) tăng đến 35% ở phút 25 và duy trì ở tỉ lệ này trong 5 phút. Thể tích bơm mẫu là 20. Phân tích ít nhất 3 lần và báo cáo kết quả trung bình. Sử dụng phương pháp chuẩn ngoại để định lượng và nồng độ cuối cùng tính toán bằng mg/100g mẫu (fresh weight). Hình 2 Phân tích dịch chiết vỏ cam thu được dưới sự hỗ trợ của sóng siêu âm bằng HPLC Quang phổ kế Phép đo độ hấp thụ được tiến hành trên máy đo quang phổ UV – vis GENESYS 5 (khoảng bước sóng: 200 – 1100nm) với giá đỡ có 8 vịt trí đặt mẫu. Đo mật độ huỳnh quang bằng máy đo mật độ huỳnh quang SPEX – Fluoromax 2. Quy trình chiết xuất Một nghiên cứu được tiến hành để so sánh giữa kỹ thuật cổ điển và kỹ thuật có sự trợ giúp của sóng siêu âm sau khi kỹ thuật này được tối ưu hóa. Chiết xuất với sự hỗ trợ của siêu âm (UAE: ultrasound – assisted extraction): thử nghiệm hướng đến mục tiêu tối ưu hóa nhiệt độ chiết xuất, cường độ siêu âm, tỉ lệ ethanol, lượng vỏ cam (0.25g/mL) được đánh siêu âm trong dung môi (hỗn hợp cồn – nước) trong 30 phút. Các thông số tối ưu được sử dụng để thăm dò thời gian cần thiết để đạt hiệu suất tối đa trong quá trình chiết xuất. Kích thước hạt 5 nghiên cứu được tiến hành trên 5 cỡ hạt khác nhau (0.5, 1.0, 1.5, 2.0 và 2.5 cm2), áp dụng quy trình chiết xuất cổ điển (25oC, hỗn hợp ethanol – nước theo tỉ lệ 1 : 1, có khuấy trộn). Hàm lượng phenolic toàn phần (TPC) Đo lường hàm lượng phenolic toàn phần trong mẫu bằng kit SEPPAL (Isiteclab ,France) – bộ kit đặc biệt phù hợp để định lượng hàm lượng phenolic toàn phần trong thực phẩm. Bộ kit bao gồm thuốc thử A (thuốc thử Folin – Ciocalteu), thuốc thử B (đệm kiềm) và dung dịch acid gallic (3g/L). Chuẩn bị 20H2O (mẫu trắng), dung dịch acid gallic (mẫu chuẩn), dịch chiết (mẫu thử) đã được trộn với 2mL thuốc thử A. Sau 1 phút, thêm vào mỗi mẫu 1mL thuốc thử B. Bảo quản các mẫu trong tối ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian 30 phút, sau đó đo độ hấp thu các mẫu ở bước sóng 60nm. Hàm lượng phenolic toàn phần được tính bởi công thức: : độ hấp thu của mẫu thử : độ hấp thu của mẫu trắng : độ hấp thu của mẫu chuẩn Tiến hành đo 3 lần và tính giá trị trung bình, kết quả biểu diễn dưới dạng mg acid gallic/100g mẫu (mg GA/100g FW) Xác định hiệu suất Ethanol được loại bỏ khỏi dịch chiết bằng cách cho bay hơi ở 40oC trong máy cô quay chân không. Sau đó mẫu được đông lạnh và làm khô lạnh để loại nước. Cuối cùng hiệu suất của mỗi lần chiết được tính theo khối lượng và biểu diễn bằng %. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng của kích thước hạt Từ các nghiên cứu trước đó (Cuoco, Mathe, Archier, Chemat, & Vieillescazes, 2009; Garcia-Ayuso & Luque de Castro, 1999; Vilkhu, Mawson, Simons, & Bates, 2008; Wang & Weller, 2006), kích thước hạt được lưu ý như là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả chiết xuất polyphenol từ vỏ cam. Các thử nghiệm sơ bộ đánh giá được tiến hành với 5 kích thước vỏ cam khác nhau 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 và 2.5 cm2 cho hiệu suất cuối cùng lần lượt là 3.44%, 3.65%, 4.32%, 4.41% và 4.38%. Kích thước vỏ cam 2.0 cm2 cho kết quả tối ưu nhất và được sử dụng trong thí nghiệm chiết xuất này. Thiết kế thử nghiệm Box-Wilson Các kích thước nhỏ hơn cho hiệu suất thấp hơn một ít có thể do các tiểu phân này ở lại trên bề mặt của dung môi trong suốt quá trình chiết xuất và vì vậy hạn chế tiếp xúc hơn với sóng siêu âm. Các giá trị của các biến độc lập và các kết quả thu được từ các nghiên cứu đa biến trong mỗi thử nghiệm được trình bày trong bảng 2. Trong phần hai của nghiên cứu, ảnh hưởng của nhiệt độ (oC) X1, cường độ siêu âm (W) X2 và tỉ lệ ethanol:nước (% tt/tt) X3 trên UAE những polyphenol từ vỏ cam dưới những dạng như: TPC (mg GA/100g FW) Y1, nồng độ naringin (mg/100g FW) Y2 và nồng độ hesperidin (mg/100g FW) Y3 được đánh giá bằng phương pháp phản ứng bề mặt. Phân biệt naringin và hesperidin dựa vào thời gian lưu và phổ UV với chất chuẩn (hình 2). Hiệu suất (%) Y4 và hằng số tốc độ chiết xuất (k) (phút -1) Y5 cũng được xác định. Kiểm định Anova đối với sự xác định TPC (30 phút) đã đưa ra được hệ số xác định (R2) ở mức 98.3%, điều này chỉ ra sự tương đương giữa giá trị thực nghiệm và giá trị tính toán. Dữ liệu của kiểm định Anova đối với TPC cũng được trình bày trong biểu đồ Pareto (hình 3), mô tả những ảnh hưởng quan trọng của tất cả các biến và tương tác qua lại của chúng. Chiều dài của cột tỉ lệ với cường độ hấp thu của những hệ số ảnh hưởng đã được ước lượng, trong khi đường gạch ngắt quãng biểu diễn độ hấp thu tối thiểu của những ảnh hưởng quan trọng về mặt thống kê (khoảng tin cậy 95%) . Có thể thấy được rằng cường độ siêu âm có ảnh hưởng quan trọng nhất đến TPC , sau đó là nhiệt độ, tỉ lệ ethanol:nước, tương tác cường độ – tỉ lệ ethanol:nước. Bảng thiết kế thử nghiệm với 3 tham số và kết quả. Thử nghiệm Nhóm tham số 1 Nhóm tham số 2 Đáp ứng X1 X2 X3 T P E TPC 30 min (mg GA/100 g) Naringin (mg/100 g) Hesperidin (mg/100 g) Hiệu suất(%) Hằng số chiết xuất (min−1) 1 0 0 0 25 100 50 185.493 36.193 119.290 7.8 0.0260 2 1 1 1 40 150 80 233.460 48.610 146.729 10.03 0.0402 3 0 0 0 25 100 50 185.068 32.721 112.853 7.77 0.0197 4 1 −1 1 40 50 80 197.646 33.347 113.332 8.09 0.0170 5 −1 −1 −1 10 50 20 121.259