Đề tài Chiết xuất và phân lập Eugenol từ nụ hoa Đinh hương

MỤC LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU Từ xưa, các vị hoàng đế thời Hán thường bắt những người tùy tùng của mình nhai lá cây Đinh hương để tạo hơi thở tươi mát. Được tìm thấy từ thời cổ đại, hoa Đinh hương trở thành một loại hàng hóa có giá trị và đã gây ra một cuộc cạnh tranh khốc liệt giữa người Bồ Đào Nha, Hà Lan và Anh để chiếm vị trí thống trị thị trường mua bán gia vị. Vì hoa Đinh hương đã được xem là một loại gia vị quý để chế biến bột cà ri cùng với nghệ, gừng, hồ tiêu đen, ớt,... Hoa Đinh hương còn được dùng để ướp thuốc lá thơm và pha chế rượu mùi, nước hoa. Ngày nay, ở nhiều nước châu Á, người dân vẫn còn tập quán dùng hoa Đinh hương để làm thơm hơi thở, chống chứng hôi miệng và nhai hoa Đinh hương với mục đích phòng bệnh trong các vụ dịch. Ở nước ta, Hải Thượng Lãn Ông cũng đã dùng hoa Đinh hương phối hợp với quế, gừng sống, dây đau xương, hồi hương, vỏ sòi, vỏ núc nác, lá canh châu, mủ xương rồng bà, lá thầu dầu tía, lá náng, lá kim cang, lá mua, huyết giác, nghệ, hạt trấp, hạt máu chó, lá bưởi bung, lá tầm gửi cây khế, lượng các vị bằng nhau 10-20g, giã nhỏ, sao nóng và chườm để chữa bong gân, sai khớp. [1] Eugenol là thành phần chính của tinh dầu chiết xuất từ nụ hoa Đinh hương. Đây là thành phần đầu tiên của tinh dầu đã được chứng minh có vai trò là chất sát trùng và giảm đau trong nha khoa mà ngày nay vẫn còn dùng. Eugenol cũng là tác nhân quan trọng trong mỹ phẩm và hương liệu thực phẩm. Những thuộc tính của nó đối với các gốc khác nhau như DPPH, ABTS, superoxide và azide, hydroxyl và các gốc aloperoxyl đã được báo cáo. Nó được chứng minh khả năng ức chế tổng hợp prostaglandin-7 và ức chế COX-2 với giá trị IC50 là 129 mmol. [2] Trong thử nghiệm chất gây ung thư của các nhóm khác nhau trên chuột CD-1 và F344, Eugenol đã không gắn kết với khối u. Trong nghiên cứu “skin painting” do Van Duuren và Gold-schmidt thì Eugenol có góp phần hiệu quả trong ức chế benzopyrene, chất gây ung thư da. Eugenol có thể ức chế DMBA-tinh dầu khổ sâm-gây ung thư khoảng 84%. Trong thử nghiệm ghép mô B16, trị liệu bằng Eugenol làm giảm sự tăng trưởng khối đáng kể (p = 0,0057), giảm gần 40% kích thước khối u và tăng 19% thời gian trung bình đến điểm kết thúc. Nhiều bằng chứng khoa học đã chứng minh Eugenol có khả năng gây độc tế bào, ứng dụng điều trị tế bào ung thư ở người. [3] Vì Eugenol có những đặc tính sinh học quan trọng và ứng dụng rộng rãi nên việc chiết xuất, phân lập và tinh khiết hóa Eugenol cần phải có những phương pháp hiệu quả hơn để thay thế phương pháp cổ điển thường đòi hỏi nhiều bước sắc ký trên silicagel. Mặt dù, Eugenol có thể được hóa tổng hợp, tuy nhiên việc dùng các chất hữu cơ tạo ra nhiều chất thải độc hại sẽ ảnh hưởng đến môi trường nên việc lựa chọn phương pháp chiết xuất và phân lập từ Đinh hương ngày càng được quan tâm. Vì lý do trên, tài liệu này xin trình bày một số phương pháp chiết xuất và phân lập Eugenol từ nụ hoa Đinh Hương. TỔNG QUAN Về thực vật học Giới thiệu Tên khoa học: Eugenia caryophyllata Thunb. Tên đồng nghĩa: Eugenia aromaticum, Syzygium aromaticum (L.) Đinh hương còn được gọi là Công Đinh hương, Hùng tử hương, Đinh tử. Phân loại khoa học: Giới (regnum) Plantae Bộ (ordo) Myrtales Họ (familia) Myrtaceae Chi (genus) Eugenia Loài (species) E. caryophyllata Thunb. Mô tả hình thái thực vật Đinh hương là cây nhỡ, cao từ 10-12 m. Lá hình bầu dục, đầu nhọn, không rụng. Hoa mẫu 4, tập hợp thành xim nhỏ ở đầu cành. Đài màu đỏ, tồn tại. Tràng màu trắng hồng, rụng khi hoa nở. Đế hoa dài, hình như cái Đinh. [4] Sinh thái Người ta trồng Đinh hương bằng hạt tuy rằng có thể giâm cành. Các hạt được gieo trực tiếp trên những luống đất đỏ hay đất thịt nhiều mùn thoát thủy. Các hạt nẩy mầm sau 10 hay 15 ngày, và người ta đem đặt vào các túi nhựa chứa đất trộn với phân bò, rồi để vào nơi mát mẻ để chăm sóc. Khoảng 18 hay 24 tháng sau, cây con được đem trồng vào các hố đào sẵn xen giữa vườn cây, đặc biệt giữa các vườn dừa, tiêu, cà phê, ca cao hay đào lộn hột. Đất trộn phân bò với các mùn cây rất được cây non ưa chuộng. Cây Đinh hương sẽ cho hoa lần đầu vào khoảng năm thứ sáu đến thứ chín, nhưng phải đến năm thứ 20 mới cho trái làm giống sau mùa trổ bông kéo dài từ năm đến sáu tháng. Các cây mạnh khỏe tiếp tục cho nụ tươi tốt cho đến trên tuổi 60, thậm chí trên cả trăm tuổi, tạo nên nguồn lợi rất lớn và bền vững cho nhiều nhà nông giữa vùng nhiệt đới. Phân bố Cây Đinh hương có nguồn gốc ở đảo Moluccas (Indonesia) và được sản xuất chủ yếu ở Tanzania, Malaysia, Indonesia, các quần đảo Zanziba, Pemba (Tandania), Madagasca. Nước ta di thực chưa thành công còn phải nhập. [4] Bộ phận dùng Thường dùng nụ hoa, được thu hái khi bắt đầu có màu hồng đỏ, ngắt bỏ cuống để riêng (đôi khi cuống cũng được dùng) đem phơi âm can hoặc sấy nhẹ cho khô. Nếu hái muộn lúc hoa đã nở, cánh hoa rụng đi hoặc quả non hình thành thì chất lượng dược liệu sẽ giảm nhiều. Chất lượng tinh dầu tốt nhất ở nụ hoa, rồi đến cuống hoa và lá. Quả Đinh hương chứa ít tinh dầu, hàm lượng Eugenol lại thấp nên không được sử dụng. Về hóa học Thành phần hóa học của Đinh hương Đinh hương chứa tinh dầu với hàm lượng 15-20% ở nụ hoa, 5-6% ở cuống hoa và 2-3% ở lá, protein 6%, lipid 20%, carbohydrat 61%, campestrol, stigmasterol, quercetin, kaempferol. Tinh dầu Đinh hương là chất lỏng màu vàng đến nâu vàng, nặng hơn nước, mùi thơm dễ chịu. Tỷ trọng d15: 1.043-1.068 Chỉ số khúc xạ Năng suất quay cực . [4] Thành phần chính của tinh dầu Đinh hương Eugenol (4-Allyl-2-methoxyphenol) chiếm 78-95%, có khi lên đến 98%. Cấu trúc, tính chất lý hóa của Eugenol Lý tính Không màu hoặc vàng nhạt, lỏng trong suốt, thẫm màu do tiếp xúc với không khí. Nó có mùi mạnh của cây Đinh hương. Độ hòa tan: Thực tế không tan trong nước, tan trong ethanol 70% (V/V), thực tế không hòa tan trong glycerol, trộn lẫn được với ethanol 96%, với axit acetic băng, với methylen clorua và với các loại dầu béo. Khối lượng phân tử: 164.20 g/mol Tỷ trọng: 1.06 g/cm3 Nhiệt độ nóng chảy: -9oC, 264 K, 16oF Nhiệt độ sôi: 256°C, 529 K, 493°F Nhiệt độ bốc cháy: 104°C Chỉ số khúc xạ: 1.540-1.542 [5], [6] Hoá tính: Eugenol là một hợp chất chứa nhân thơm, có nhóm chức phenol và ether. Tham gia phản ứng đặc trưng của một phenol: với FeCl3, với NaOH tạo muối phenolat. Tham gia phản ứng đặc trưng của một ether Tham gia phản ứng cộng.... [4] Định tính Eugenol Dựa vào chỉ số khúc xạ Dựa vào phép đo quang phổ hấp phụ hồng ngoại và so sánh với Eugenol CRS. Bằng phản ứng hoá học Hòa tan 0,05 ml trong 2 ml ethanol 96% và thêm 0,1 ml dung dịch sắt clorua. Một màu xanh đậm, màu xanh sẽ đổi sang màu vàng-xanh trong vòng 10 phút. Dùng sắc kí lớp mỏng Dung dịch thử: hòa tan 50 μl chất thử trong ethanol 96% và pha loãng thành 25ml với dung môi tương tự. Dung dịch mẫu: hòa tan 50 μl Eugenol CRS trong ethanol 96% và pha loãng thành 25ml với dung môi tương tự. Bản mỏng silica gel F254 Dung môi chạy sắc kí là ethyl acetate, toluene (10 : 90 V/V) Lượng mẫu chấm 5μl, khai triển khoảng 15cm, làm khô trong không khí lạnh Phát hiện: Đầu dò UV 254 nm hoặc bằng thuốc thử anisaldehyde R đun nóng lên tại 100-105°C trong 10 phút. Kết quả: Vết thu được với dung dịch thử phải tương tự về vị trí và kích thước với vết thu được từ dung dịch chuẩn. [6] Về tác dụng, công dụng Tính vị: cay và tính ấm. Qui kinh: tỳ, vị và thận. Công năng: làm ấm tỳ và vị và làm ấm thận và bổ dương. Liều dùng: 2-5g. Thận trọng và chống chỉ định: không dùng Đinh hương phối hợp với uất kim. [7] Tác dụng dược lý Đinh hương là một vị thuốc được dùng trong cả Tây y và Đông y. Theo y học cổ truyền: Đinh hương có tác dụng ôn tỳ vị, chủ trị các chứng quản phúc lãnh thống (đau bụng do lạnh), ẩu thổ (nôn mửa), ách nghịch (nấc). Trích đoạn y văn cổ: Sách Dược tính bản thảo: "chủ lãnh khí phúc thống". Sách Cảnh nhạc toàn thư: "tịch ác khử tà, ôn trung khoái khí, trị nấc ở thượng tiêu, hoắc loạn nôn mửa, giải độc rượu, trị âm hàn tâm phúc đầy trướng, lãnh thống, làm ấm hạ tiêu lưng gối lạnh đau, tráng dương đạo, ức chế âm tà, trừ vị hàn tả lî". Sách Bản thảo thông huyền: " Đinh hương ôn trung kiện vị. Trong thuốc hoàn nên dùng cùng với các loại thuốc nhuận. Dùng độc vị, dùng nhiều thuốc đễ xông lên làm tổn thương phế và mắt". Kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại: Nước chiết xuất Đinh hương có tác dụng kích thích dạ dày tăng tiết acid dịch vị và pepsin, kích thích tiêu hóa. Dịch chiết xuất nước, cồn, ete của Đinh hương và tinh dầu Đinh hương đều có tác dụng kháng khuẩn mạnh đối với nấm gây bệnh. Đinh hương có tác dụng ức chế với mức độ khác nhau đối với tụ cầu khuẩn, trực khuẩn lao, liên cầu dung huyết, trực khuẩn bạch hầu, lị, trực khuẩn phó thương hàn, phẩy khuẩn tả, trực khuẩn Bruce, trực khuẩn viêm phổi và virut cúm. In vitro thuốc có tác dụng làm tê liệt và giết chết lãi đũa ở heo. Đinh hương có loại thành phần hòa tan trong nước chưa được rõ có tác dụng kích thích cơ trơn của tử cung. Tinh dầu Đinh hương nhỏ vào hốc răng có tác dụng khử khuẩn và làm giảm đau răng. Công dụng Trị chàm lở  Dùng Đinh hương gia vào 100ml cồn 75% ngâm 48 giờ, bỏ xác, mỗi ngày bôi vào vùng chàm lở 3 lần. Tác giả đã trị 31 ca mắc bệnh chàm ở người và bàn chân trên 2 năm. Phần lớn bôi sau 1 ngày giảm, sau 2 ngày tróc vẩy, và 3-5 ngày khỏi. Có 20% vẫn tái phát (Báo cáo của Trần Bỉnh Đồng, Tạp chí bệnh ngoài da Trung hoa 1963,1:17). Trị lở đầu vú Lý Hoài Tân dùng Công Đinh hương 10-20 cái (nụ) tán bột mịn. Nếu lở khô trộn dầu (mè hoặc dầu mù u) bôi vào, nếu lở ướt rắc bột vào 2-3 lần mỗi ngày. Theo dõi 10 ca kết quả tốt (Tạp chí Trung y 1966,6:29). Trị nôn, nấc cụt, trẻ em ợ sữa Đinh hương thị đế thang: Đinh hương 3g, Tai hồng 10g, Đảng sâm 10g, Sinh khương 10g, sắc nước uống. Đinh hương tán: Đinh hương 3g, Sa nhân 5g, Bạch truật 10g, tán bột mịn mỗi lần uống 2-4g, ngày 2-3 lần với 2-3 lần với nước ấm. Trị chứng nôn, tiêu chảy do tỳ vị hư hàn. Trị đau do lóet dạ dày tá tràng thể hư hàn Đinh hương chỉ thống tán: Diên hồ sách 10g, Ngũ linh chi 6g, Đương qui 10g, Quất hồng 6g, Đinh hương 4g, tán bột mịn trộn đều. Mỗi lần uống 3-6g, ngày 2-3lần với nước sôi ấm. Trường hợp chảy máu không dùng. Đinh hương 30g, bột Long cốt 300g, Mẫu lệ 300g, bột mì 120g, tất cả tán bột mịn trộn đều gói thành bao 6g mỗi bao. Mỗi lần uống 1 bao, ngày uống 2-3 lần với nước sôi ấm. Trường hợp loét bao tử ợ chua nhiều uống tốt. [8] Theo tài liệu nước ngoài Ở Trung Quốc, để chữa đau dạ dày, ăn không tiêu, người ta dùng hoa Đinh hương 4g, quả mùi 8g, vỏ quýt 4g, hoàng liên 4g tán nhỏ, sắc uống. Hoặc chữa nôn mửa, lạnh bụng bằng cách nấu đường phèn hoặc đường kính 50g cho tan, rồi thêm bột hoa Đinh hương 5g và gừng tươi giã nhỏ 30g, cô nhỏ lửa đến khi được cao đặc, uống làm 2-3 lần trong ngày. Ở Malaysia, hoa Đinh hương được dùng làm thuốc bổ cho phụ nữ sau đẻ. Ở  Ấn Độ, tinh dầu hoa Đinh hương là chất phụ gia cho vào nước tắm có tác dụng chống mệt mỏi, lao lực, trầm cảm theo phương pháp chữa bệnh độc đáo của y học truyền thống nước này gọi là Ayurveda. Người Indonesia dùng tinh dầu hoa Đinh hương pha trong dầu béo để xoa bóp chữa tê thấp. [9] THỰC NGHIỆM Chiết xuất tinh dầu Phương pháp 1: Chưng cất lôi cuốn theo hơi nước Lắp ráp một bộ chưng cất hơi nước. Cho khoảng 5.0 gam nụ Đinh hương vào trong bình cầu 100 ml. Thêm 50 ml nước và 1 ít đá sôi. Đánh dấu mực nước để có thể bổ sung thêm lượng nước đã mất trong suốt quá trình chưng cất và ngăn mẫu không bị khô đi. Đun hỗn hợp cho đến khi sự chưng cất bắt đầu ổn định. Thỉnh thoảng kiểm tra mực nước và thêm nước khi cần thiết. Trong lúc đầu chưng cất, sản phẩm chưng cất sẽ trông đen đi. Điều này là do sự hiện diện của tinh dầu trong sản phẩm chưng cất, hòa lẫn với nước. Khi chưng cất gần hoàn tất, các chất lỏng được chưng cất sẽ trong suốt hơn. [10] Phương pháp 2: Chiết bằng SFE Hoá chấtCarbon dioxide (99,9%) Các nụ hoa khô E. caryophyllata Thunb. Ethanol Tối ưu hóa điều kiện SFE Hệ thống SFE SpeedTM ở chế độ SFE được sử dụng để tối ưu hóa điều kiện chiết xuất. Dùng 50 ml extraction cell để tối ưu hóa quá trình chiết. Để quyết định quá điều kiện chiết phù hợp trong một khoảng rộng với số lần thử ít nhất, một thiết kế test trực giao L9 (3)3 có nhiệt độ, áp suất, kích thước tiểu phân của mẫu là ba yếu tố chính để chiết xuất có hiệu quả. Kết hợp của ba cấp độ khác nhau của mỗi yếu tố được liệt kê trong bảng 1. Trong mỗi thử nghiệm, 5g nụ hoa E.caryophyllata được làm mịn và rây được cho vào extraction cell. CO2 tinh khiết 99.9% được dùng như dung môi. Sau 10 phút chiết xuất tĩnh ( không có dòng chất lỏng), mẫu được chiết với dòng khí CO2 với tốc độ 1,5 l/phút trong 20 phút. Dịch chiết được đưa vào bình hứng chứa khoảng 100 ml ethanol, sau đó mẫu được phân tích bởi HPLC. SFE cải tiến Sau khi các điều kiện chiết xuất được tối ưu hóa, quá trình chiết xuất được gia tăng lên 60 lần với hệ thống SFE điều chế. Nụ hoa (300g, 40-60 mesh) được chứa vào một bình chiết, được chiết tĩnh trong 20 phút tiếp theo được chiết động trong 6 giờ trong điều kiện tối ưu ở 50 0C và 30 Mpa. Tốc độ dòng của chất lỏng CO2 siêu tới hạn là 2,5 l/phút, và dịch chiết trong chất lỏng siêu tới hạn được nén xuống bình riêng biệt. Kết quả Các sản phẩm thu được từ mỗi test L9 (3)3 trong phân tích SFE đã được phân tích định lượng, và kết quả đã được biểu thị trong bảng 2. Sản lượng chiết tối đa của dịch chiết thô là 19.6% và nồng độ tối đa của Eugenol trong chiết thô là 593 mg/g. Hiệu quả chiết xuất tại mỗi nhiệt độ, kích cỡ tiểu phân mẫu và áp suất khác nhau đã được khảo sát dưới thiết kế test L9 (3)3. Kết quả được biểu thị trong bảng 2 đã chỉ ra rằng có khác nhau rõ rệt về hiệu suất giữa những điều kiện SFE. Nếu hiệu suất Eugenol được trình bày như một kết quả chủ đạo, các kết quả trong bảng 2 được chuyển thành bảng 3 sau phân tích trực giao. Kích thước các tiểu phân là yếu tố quan trọng nhất quyết định hiệu suất. Hiệu suất Eugenol tăng lên đáng kể khi giảm kích thước tiểu phân. Áp suất và nhiệt độ không ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất Eugenol, áp suất 30 MPa và nhiệt độ 500C, nhưng có tác động thuận lợi cho chiết xuất Eugenol. Những kết quả này chỉ ra rằng các điều kiện khách quan để chiết xuất Eugenol bằng SFE là áp suất 30Mpa, nhiệt độ 500C và kích thước tiểu phân là 40-60 mesh. Tóm lại, dưới các điều kiện chiết SFE như trên,ta có 51.3g dịch chiết thô được thu từ 300g mẫu. Phân tích HPLC cho thấy dịch chiết SFE chứa 54.8% Eugenol. Kích thước các tiểu phân là yếu tố quan trọng nhất quyết định hiệu suất. Hiệu suất Eugenol tăng lên đáng kể khi giảm kích thước tiểu phân. Áp suất và nhiệt độ không ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất Eugenol, áp suất 30 MPa và nhiệt độ 500C, nhưng có tác động thuận lợi cho chiết xuất Eugenol. Những kết quả này chỉ ra rằng các điều kiện khách quan để chiết xuất Eugenol bằng SFE là áp suất 30Mpa, nhiệt độ 500C và kích thước tiểu phân là 40-60 mesh. Tóm lại, dưới các điều kiện chiết SFE như trên,ta có 51.3g dịch chiết thô được thu từ 300g mẫu. Phân tích HPLC cho thấy dịch chiết SFE chứa 54.8% Eugenol. Tóm lại, dưới các điều kiện chiết SFE như trên,ta có 51.3g dịch chiết thô được thu từ 300g mẫu. Phân tích HPLC cho thấy dịch chiết SFE chứa 54.8% Eugenol. [2] Xác định điều kiện tối ưu của việc chiết xuất Eugenol từ Đinh hương bằng cồn Nhựa dầu (Oleoresin) của đinh hương (dịch chiết toàn phần) có chứa Eugenol là một hợp chất chống oxi hóa. Nghiên cứu này dùng ethanol 95% để chiết xuất Eugenol từ đinh hương. Thực nghiệm được thực hiện với thay đổi các điều kiện về kích cỡ bột đinh hương, nhiệt độ chiết xuất, thời gian chiết xuất, tỉ lệ dung môi và lượng bột đinh hương, để ước lượng các giá trị tối ưu. Chỉ số khúc xạ được dùng theo dõi quá trình chiết xuất. Khảo sát cỡ bột đinh hương trong những phân đoạn chiết xuất là 500m, 355m, 250m, và ít hơn 250m với tỉ lệ dung môi và bột là 4:1 ở nhiệt độ phòng. Dùng máy lắc chuyển động qua lại để lắc trong quá trình chiết xuất. Kích thước tối ưu cho quá trình chiết xuất ở nhiệt độ phòng là 250 m. Khảo sát sự thay đổi của nhiệt độ chiết xuất từ 30°C đến 70°C trong điều kiện cùng tỉ lệ dung môi và bột ở kích cỡ là 250m và 355 m. Nhiệt độ tối ưu cho quá trình chiết với kích cỡ là 250m là 50°C và 355 m là 60°C. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nụ đinh hương tươi thu từ Kampong Batu Laut, Banting, Selangor, Malaysia. Ethanol 95% được sử dụng ở cấp độ phân tích. Sấy nụ đinh hương Nụ đinh hương tươi bỏ cuống được trải thành lớp mỏng và đem sấy ở nhiệt độ 60°C trong 16 giờ đền khối lượng không đổi, sau đó nâng nhiệt độ tủ sấy lên 100°C. Nụ đinh hương khô bảo quản nguyên trạng. Cuống được sấy khô riêng và bảo quản dung cho những phân tích khác. Điều chế nhựa dầu đinh hương Chiết xuất bột đinh hương cỡ bột 355 m với ethanol 95% trong 2 h với tỉ lệ dung môi và bột là 4:1 và nhiệt độ là 70°C (điểm sôi của ethanol là 78°C). Hỗn hợp được lọc qua giấy lọc (Whatman No. 10), bã được chiết lại với điều kiện như ban đầu đến khi chỉ số khúc xạ của dịch chiết gần với của dung môi. Quá trình chiết khoảng 8h, tổng tỉ lệ dung môi và bột khoảng 15:1. Những dịch lọc từng phần được góp lại đem cô quay chân không và điều chỉnh nồng độ cuối cùng bằng nhiệt ở 90°C. Nhựa dầu có thể chịu được nhiệt độ lên đến 90°C mà không bị giảm chất lượng, bị ảnh hưởng khi nhiệt độ trên 100°C (Sabel and Warren 1972). Quá trình nhiệt, làm lạnh và cân được lặp lại đến khi tổng khối lượng mất trong bay hơi và làm khô của dịch chiết khoảng 97%. Dịch chiết này dùng xây dựng đường cong định cỡ. Xác định dịch chiết cồn Dịch chiết cồn được xác định theo tiêu chuẩn Malaysia về chất gia vị (SIM 1973). Đường cong định cỡ Quá trình chiết xuất nhựa dầu dùng bột với kích cỡ tối ưu, nhiệt độ sử dụng thấp hơn nhiệt độ sôi của dung môi. Sự chiết xuất được lặp lại và loại bỏ dung môi bằng cô chân không. Dòng nhiệt thấp được sử dụng để tránh sự phá hủy của nhiệt trong quá trình trộn lẫn (Langenau 1959). Vì vậy xác định thường xuyên số lượng nhựa dầu trong quá trình chiết tốn nhiều thời gian và khó khăn, đặc biệt khi dự đoán sự thay đổi nồng độ dịch chiết trong thời gian ngắn. Những nhựa dầu cay không tan hoàn toàn trong ethanol 95% nhưng tan trong tinh dầu đinh hương (Furia 1972). Nhựa dầu đinh hương hòa tan trong ethanol 95% được lấy làm chuẩn để tính cho tổng các chất có thể hòa tan được. Đường cong xét mối tương quan này xác định bằng cách hòa tan khối lượng đã biết của nhựa dầu (1 g, 2 g, 3 g, 4 g và 5 g) trong 50 ml ethanol 95%. Dùng máy Atago 3T để đo chỉ số khúc xạ của mỗi dung dịch ở nhiệt độ môi trường xung quanh. Đồ thị kết quả trong Fig. 1, được dùng để giám sát điểm kết thúc chiết xuất. Thử nghiệm chiết xuất Đinh hương dùng trong thử nghiệm chiết xuất trước khi tiến hành thực nghiệm ở dạng bột và dùng ngay sau khi xay. Heath and Reineccius (1986) đề nghị bột đinh hương lưu giữ không quá 3 tháng sau khi sản xuất. Trong thực nghiệm này, 1 kg đinh hương khô được xay trong máy xay (Moulinex, France). Dùng rây (Endecotts Ltd, London, England)để lựa chọn những kích cỡ khác nhau (500 m, 355 m, 250m). Để nghiên cứu ảnh hưởng của kích cỡ bột, dùng 5 g mẫu mỗi kích cỡ trộn với 25ml ethanol 95% trong bình nón 50ml và lắc trong 1 h ở nhiệt độ phòng. Lọc để tách riêng phần bã và phần dịch lọc. Đo chỉ số khúc xạ của mỗi dịch chiết. Kết quả thu được biểu thị ở Fig. 2 Thực nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ trong khoảng 30°C đến 70°C đến quá trình chiết được thực hiện với 2 mẫu có kích cỡ là 355 m, 250m. Trộn 5 g mỗi mẫu với 25 ml ethanol 95% trong bình nón 50 ml và lắc trong 1h. Kết quả biểu thị trong Fig 3. Để khảo sát mối tương quan giữa tốc độ chiết với những tỉ lệ khác nhau của dung môi và bột dùng kích cỡ bột 250 m ở nhiệt độ 50°C. Mỗi mẫu 5 g trộn tương ứng với 20 ml, 40 ml và 60 ml ethanol 95% trong một bình nón 100 ml và lắc trong 1h ở nhiệt độ phòng, thời gian chiết là 180 phút. Ghi nhận thời gian của mỗi bình, lọc và ghi nhậ