Đề tài Enzyme cố định và các ứng dụng

Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Khoa Sinh Học BÀI BÁO CÁO Đề tài : Enzyme cố định và các ứng dụng Giảng viên hướng dẫn : Ngô Đại Nghiệp MỤC LỤC Trang GIỚI THIỆU VỀ ENZYME 2 CÁC VẤN ĐỀ VỀ ENZYME CỐ ĐỊNH 3 Khái niệm 3 Một số phương pháp chủ yếu chế tạo E cố định 3 Phương pháp hấp phụ vật lý 3 Phương pháp đưa E vào khuôn gel 5 Phương pháp liên kết ion giữa E và chất mang 8 Phương pháp gói E trong bao cực nhỏ 8 Phương pháp tạo các liên kết 9 chéo giữa các phân tử E Phương pháp gắn E vào chất mang rắn 10 bằng liên kết cộng hóa trị Phân tích chế phẩm E không tan 16 Xác định protein 16 Xác định hoạt độ của E không tan 17 Ưu và nhược điểm của E không tan 17 Ưu điểm 17 Nhược điểm 18 ỨNG DỤNG CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH 18 1. Trong công nghiệp 19 Sản xuất sirop giàu fructose 19 Sản xuất sữa phi lactose 22 1.3. Dùng E cố định trong việc biến đổi aminoacid 24 2. Ứng dụng trong y học 26 Ứng dụng trong phân tích chất 26 E cố định trong công nghiệp kháng sinh 27 Thành phần của thận nhân tạo 29 3. Xử lý chất thải 30 E thuộc lớp Oxidoreductase 31 E Cyanide hydratase xử lý chất thải xyanua 31 Cố định E urease 32 4. Một số ứng dụng tiềm năng 32 Ứng dụng trong hóa học 32 Ứng dụng trong nông nghiệp 33 KẾT LUẬN 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 GIỚI THIỆU VỀ ENZYME Enzyme (E) là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein, E có trong mọi tế bào sinh vật. E có thể xúc tác đặc hiệu cho mọi phản ứng sinh hóa bên trong và bên ngoài cơ thể sinh vật. E có hiệu suất xúc tác lớn hơn tất cả các chất xúc tác hóa học hữu cơ và vô cơ khác. Các chất tham gia trong phản ứng do E xúc tác gọi là cơ chất. E có tính đặc hiệu cao vì mỗi E chỉ xúc tác cho một kiểu phản ưng nhất định tạo thành một hay một số sản phẩm nhất định. Cơ thể thiếu E thì mọi quá trình chuyển hóa sẽ bị đình chỉ, sinh vật không thể sống, sinh sản hay phát triển được. Lược sử E Trước thế kỷ XVII, việc sử dụng E chỉ có tính chất kinh nghiệm thuần túy. Người xưa đã biết dùng vi sinh vật như là nguồn E trong các quá trình lên men như làm rượu vang, làm dấm, sản xuất bánh mì. Thế kỷ XVII đến nửa đầu thế kỷ XVIII, đã đề ra được khái niệm lên men. Vanhemont người Hà Lan lần đầu tiên đã quan sát được chất khí khác không khí trong quá trình lên men. Nửa cuối thế kỷ XVIII, đã có những thí nghiệm đầu tiên về E. Tiểu biểu là công trình nghiên cứu khả năng tiêu hóa thịt trong dạ dày do Reaumur (người Pháp) bắt đầu và sau đó được Spallanzani (người Ý) mở rộng (năm 1729 - 1799) kết luận rằng trong dịch dạ dày có một thành phần hoạt động đặc biệt có khả năng tiêu hóa thịt. Các kết quả nghiên cứu này đã kích thích việc nghiên cứu có hệ thống các E tiêu hóa vào thế kỉ XIX. Nửa đầu thế kỷ XIX, người ta đã tách được một số chế phẩm từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau có tác dụng thủy phân các chất tương ứng và bắt đầu tách được các chất tạo nên quá trình lên men. Nửa cuối thế kỷ XIX, đã tinh sạch được một số E và nghiên cứu một số tính chất cơ bản của E như đặc tính tác dụng thuận nghịch, tính tác dụng đặc hiệu. Nửa đầu thế kỷ XX, đã phát hiện được CoE (Harden và Young, 1906); xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt độ của E (Sorensen, 1909); nghiên cứu động học phản ứng E (Bayliss, 1919); kết tinh được E và xác định được bản chất hóa học của E là protein; xác định được một số hệ thống E xúc tác cho quá trình đường phân (Embden, Meyerhoff và Parnas, 1933) Nửa cuối thế kỷ XX, nghiên cứu E có nhiều thành tựu lớn do việc áp dụng thành công các phương pháp hiện đại trong việc nghiên cứu. Lần đầu tiên công bố bảng phân loại và danh pháp E một cách hệ thống. Phát hiện các restrictase. Tổng hợp hóa học E… Đã hình thành ngành “công nghệ sản xuất E”, sản xuất chế phẩm E không tan và ứng dụng nhiều trong thực tế. Tạo được E tái tổ hợp và thiết kế các E có tính năng mới. Một thành tựu lớn khác là tạo được mô hình của một hệ thống E gắn với màng, đây là bước mở đầu để mô hình hóa hệ thống sống. E cố định (immobilization E) Nhờ có hiệu suất xúc tác lớn và có tính đặc hiệu cao, tạo ra sản phẩm chính, ít tạp chất và sản phẩm phụ. Nên từ lâu, E đã được sử dụng nhiều trong công nghiệp chế biến nhưng chỉ ở mức độ kinh nghiệm thuần túy. Đa số các E ở dạng hòa tan, chúng dễ bị biến đổi cấu hình không gian hoặc bị hòa tan sau khi thực hiện phản ứng xúc tác cho cơ chất. Vì vậy quá trình thực hiện chuỗi phản ứng liên tục bị gián đoạn, E không thể tái sử dụng được nhiều lần, cần một lượng E lớn để tạo thành sản phẩm vì thế giá thành chế phẩm E rất cao. Vì vậy trong những năm cuối thế kỷ 20 bắt đầu phổ biến kỹ thuật cố định E. Khác với E ở dạng hòa tan, E cố định (E không tan) có đặc tính không bị hòa tan mà vẫn giữ được hoạt độ xúc tác, bền với các yếu tố hóa lý… Ví dụ như các E gắn với màng của tế bào, hoặc các bào quan: ATPase, một số E xúc tác cho quá trình oxy hóa khử… lợi dụng tính chất ưu việt này của E cố định, cùng với sự phát triển của công nghệ E người ta đã tìm ra nhiều phương pháp khác nhau để cố định E, đưa các E từ dạng hòa tan trở thành dạng không hòa tan. Như vậy có thể dễ dàng thực hiện một quá trình phản ứng liên tục, sử dụng lặp lại nhiều lần một lượng E xác định. Do đó làm giảm đảng kể giá thành chế phẩm E. Việc sử dụng E nói chung và E cố định nói riêng trong sản xuất sẽ nâng cao chất lượng, hạ giá thành sản phẩm, cải thiện lao động, giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Cùng với sự phát triển của khoa học, việc ứng dụng E ngày càng được mở rộng, phát triển ở tầm cao hơn, không những ở trong các lĩnh vực truyền thống mà cả những lĩnh vực mới tạo ra các sản phẩm mới. CÁC VẤN ĐỀ VỀ ENZYME CỐ ĐỊNH Khái niệm E cố định (immobilization E) hay còn gọi là E không tan là những E được gắn cố định vào 1 vùng, một khoang nhất định, không bị hòa tan trong các điều kiện bình thường, vẫn giữ được hoạt động xúc tác. E cố định có đầy đủ tính chất của một E và có ưu điểm là sử dụng được liên tục và lặp lại nhiều lần. Các chất dùng để gắn hoặc giữ E thường được gọi là chất mang hay giá thể. Như vậy nếu gắn E xúc tác theo một dãy phản ứng theo đúng trật tự (hệ thống nhiều E, multiE) sẽ nhận được hệ thống E không tan xúc tác cho một dãy phản ứng chuyển hoá từ cơ chất đến sản phẩm cuối cùng. [1] Ngoài tạo ra các E cố định, người ta cũng tạo các tế bào, cơ quan tử của tế bào, tế bào vi sinh vật ở dạng không tan để sử dụng trong quá trình sinh học. Trong tế bào sống, có nhiều E gắn với màng tế bào, hoặc cơ quan tử của nhiều tế bào (các E gắn với màng hoặc các matrix của ty thể): một số E xúc tác cho quá trình oxy hóa khử, ATPase..., đó cũng là dạng E cố định. Có ba phương pháp chính điều chế E cố định : Phương pháp vật lý Phương pháp hóa học Phương pháp bao E trong khuôn gel Một số phương pháp chủ yếu chế tạo E cố định Phương pháp hấp phụ vật lý Là phương pháp hấp phụ lên bề mặt chất mang. Chất mang như cám, than hoạt tính, bột thủy tinh... Chất hấp phụ và E được trộn lẫn với nhau trong một khoảng thời gian nhất định để sự hấp phụ xảy ra nhờ tương tác bề mặt như: liên kết ion, liên kết ưa béo (kị nước), liên kết hidro, lực Wandewalls. Phương pháp này được sử dụng rất sớm, từ năm 1916, người ta đã cho invertase (sacchrase, 3.1.2.26) của nấm men hấp phụ trên than mà vẫn giữ được hoạt tính thủy phân đường (sucrose) [2] Ưu điểm : Phương pháp này dễ thực hiện nhất và thường ít ảnh hưởng đến hoạt độ của E, phương pháp này tương đối đơn giản. Nhược điểm : E dễ hòa tan trở lại trong quá trình sử dụng lặp lại nhiều lần, độ liên kết lỏng lẻo, mức độ giữ E trên chất mang, phụ thuộc nhiều vào pH và lực ion nên khi muốn tách E khỏi chất mang có thể sử dụng dung dịch có lực ion lớn. Các chất mang dùng để hấp phụ E Các chất mang cố định E rất đa dạng và phong phú chủng loại Yêu cầu của chất mang Gắn kết mọi enym bền chắc, hiệu suất trên 50%, chất mang rẻ, dễ kiếm Trơ với mọi cơ chất của E Tính chất đặc hiệu không đổi Chất mang hữu cơ: do phương pháp tổng hợp hóa học tạo ra và hầu hết các polymer hóa học, poly-styren, poly-acrylamid. Chất mang hữu cơ có nguồn gốc sinh học (dễ gắn cellulose và dẫn xuất) Những protid hình sợi: collagen, keratin Chitin và chitocan (vỏ tôm) Agar (thạch) Tinh bột Dextran (aligianat) BC (bacteria-cellulase) Chất mang vô cơ: Dẫn xuất silicat (sợi, sành, sứ, thủy tinh...) Oxit kim loại: Mg. Mn, Al... C hoạt tính Kaolin Diatomic Chất mang vô cơ bền hơn các chất mang khác nhưng khó gắn hơn Trong thực tế, để hạ giá thành, cũng có thể dùng các nguyên liệu thô hơn như đất sét, alumina, bentonite, than, mạt cưa, hoặc bột giấy... Các nguyên liệu này đã xử lý để loại các tạp chất có thể kìm hãm E. 2.2. Phương pháp đưa E vào khuôn gel E dễ định vị trong gel, mạng lưới chất trùng hợp càng nhỏ E sẽ được giữ chặt hơn. Đây là cách được dùng khá phổ biến. Từ năm 1963, Bernfeld và Wan đã mô tả phương pháp nhốt các E (trypsin, papain, amylase và ribonuclease) trong gel polyacrylamide. Hình 1: Nhốt E trong các lỗ gel Ưu điểm : Không kết hợp trực tiếp E vào giá thể hay chất mang, mà có thể hình dung E như là E bị bẫy trong các mắt lưới của lưới, nên cấu trúc của E không bị biến đổi nhiều. Hạn chế : Các phân tử cơ chất lớn không thể đi qua màng được, đối với các E khi sử dụng cơ chất phân tử lớn không sử dụng phương pháp này. Trong một số trường hợp, kích thước của các mắt lưới cũng khó điều chỉnh thật đồng nhất, nên E có thể thoát ra ngoài một phần. Một số gốc tự do được tạo thành trong quá trình trùng hợp có thể kìm hãm E. Vì vậy cần phải lựa chọn về điều kiện pH, nhiệt độ và các điều kiện khác của quá trình trùng hợp sao cho ít ảnh hưởng đến hoạt động của E, kích thước của các mắt lưới đủ bé để E khó bị thoát ra ngoài khi sử dụng, nhưng cũng phải đủ lớn để để cơ chất có thể khuếch tán vào đến E và sản phẩm được tạo thành có thể khuếch tán ra khỏi mắt lưới. Để chuẩn bị chế phẩm theo phương pháp này, có thể thực hiện các cách sau: Đưa E vào gel bằng cách trùng hợp gel trong dung dịch có E ở nồng độ cao, việc trùng hợp nhờ tác dụng của các hóa chất (gel polyacrylamide, polymer tự nhiên), nhờ bức xạ (gel polyvinyl alcohol, pyrrolidone) hoặc nhờ ánh sáng (polyethylen glycol dimetacrylate). Đưa E vào các sợi: cho hỗn hợp có chứa các thành phần để trùng hợp và E đi qua mắt lưới, sẽ tạo các sợi có gắn E hoặc có thể cho dung dịch E đi qua sợi rỗng, sợi có lỗ tạo điều kiện thuận lợi để gắn E vào. Để thực hiện phương pháp này có hiệu quả, cần nắm vững các điều kiện trùng hợp để có thể đạt được gel đúng như theo yêu cầu. Các chất dùng để tạo gel theo phương pháp này là các chất có cấu tạo mắt lưới như gelatin, alginate, agarose, polyacrylamide hoặc các prepolymer tổng hợp. Tùy mục đích sử dụng, có thể cắt gel (đã được trùng hợp có chứa E) thành từng lớp mỏng, từng mẫu nhỏ hay từng hạt để làm tăng bề mặt tiếp xúc của E trong gel với cơ chất trong dung dịch. Ví dụ một số chất sử dụng trong phương pháp này. Aginate để tạo chế phẩm calcium - algianate - E cố định Alginate là acid polyuronic tách từ rong biển, bao gồm các đơn vị cấu tạo của các acid D - mannuronic và L - guluronic kết hợp với nhau bằng liên kết α-1,4 Muối natri của alginate là chất hòa tan trong nước, do đó có thể trộn với E trong dung dịch, sau đó thêm từng giọt trong dung dịch calcium chloride sẽ tạo thành gel calcium alginat không tan có chứa E. Phương pháp này thường được dùng rộng rãi vì khá đơn giản và dễ tìm. K-carrageenan, tạo gel K-carrageenan- E cố định K-carrageenan là hỗn hợp polysaccharide tương tự agar-agar, tách từ tảo đỏ hòa tan trong nước hoặc trong dung dịch muối, có khoảng 4-5% carragenin, là polysaccharide có chứa galactose và galactose sulfate. Nguyên tắc: thêm từ từ dung dịch chất tạo gel vào dung dịch muối k-carrageenan có chứa E sẽ nhẫn được chế phẩm E kông tan, k- carrageenan là nguyên liệu tốt để cố định tế bào vi sinh vật làm trong công việc sản xuất nhiều chất khác nhau. Polyarylamide, tạo gel polyarylamide - e cố định Tiến hành trùng hợp các monomer acrylamide và N, N’- methylenebisacrylamide trong dung dịch có chứa E, và một số yếu tố cần thiết cho quá trình trùng hợp (TEMED, potassium persulfate) Trong một số trường hợp, các monomer cũng làm giảm hoạt độ E Các tiền polymer tổng hợp để tạo các polymer tổng hợp - Ecố định Quá trình trùng hợp được thực hiện nhờ ánh sáng: chuẩn bị dung dịch có prepolymer, E và chất làm tăng độ nhạy thích hợp như benzoylethylether, chiếu tia UV bước sóng dài trong vài phút, sẽ tạo thành liên kết chéo giữa các prepolymer, gel được hình thành nhốt E trong các lỗ gel. Phương pháp này đã được sử dụng để cố định tế bào nấm men ethanol ở qui mô pilot. Các prepolyme được dùng có chứa các đoạn có tính chất ưa nước hay kị nước của chúng đơn giản hơn. 2.3. Phương pháp liên kết ion giữa E và chất mang Từ năm 1956, Mitz đã tiến hành gắn catalase vào DEAE cellulose qua liên kết ion. Do phương pháp khá đơn giản nên đã được sử dụng để tạo các chế phẩm không tan của nhiều E khác. Các chất trao đổi ion khác như CM - cellulose và các dẫn xuất khác của cellulose. Độ bền liên kết của E và chất mang phụ thuộc vào pH, loại dung dịch đệm và lực ion. Vì vậy nếu thay đổi các yếu tố này có thể thu lại E, chất mang mà không làm thay đổi tính chất và cấu trúc của nó. Phương pháp gói E trong bao cực nhỏ Phương pháp này lần đầu tiên đã được Chang công bố vào năm 1964, tác giả đã dùng carbonic anhydrase vào trong các capsule. Sau đó, năm 1971, Gregoriadis đã tạo được các liposome chứa amyloglucosidae. Cả hai chế phẩm đã được sử dụng trong điều trị. Hình 2: Bọc E trong các nang E có thể được bọc bằng các loại màng khác nhau, tạo thành các dạng khác nhau. Các chất thương dùng để bọc E là polyamide hoặc nitrocellulose. Có thể phân biệt các kiểu sau: Microcapsule : Màng dùng bọc E là màng bán thấm (có các lỗ nhỏ để các chất phân tử thấp đi qua nhưng E không đi qua được) tổng hợp Liposome : Màng lỏng, được tạo thành từ các phospholipid, các liposome được dùng trong y tế hoặc mỹ phẩm. Các sợi có các lỗ rỗng Ngoài ra người ta cũng có thể điều chế các chế phẩm E không tan ở dạng liposome. Tiến hành như sau: hòa tan các amphipatidyl lipid, như phosphatidyl choline và cholesterol trong chloroform, tráng thành một bình quay, thêm dung dịch E trong nước, làm sao có thể nhanh chóng phân tán đều E, tạo thành các liposome ở dạng màng lipid bọc các giọt nước. Do đó trong một số E được giữ bên trong liposome, còn một số khác còn lại sẽ kết hợp vào màng liposome. Ưu điểm : Phương pháp này hầu như có thể xem như hầu như không làm ảnh hưởng đến cấu trúc của phân tử E, và có thể đồng thời bọc nhiều E xúc tác như một dãy phản ứng trong cùng một túi (nhưng cần tránh các protease, vì chúng có thể phân giải các E) để thực hiện một quá trình trao đổi chất qua nhiều phản ứng liên tục như một hệ thống sống. Phương pháp tạo các liên kết chéo giữa các phân tử E Năm 1964, Quiocho và Richards đã mô tả phương pháp tạo liên kết chéo giữa các carboxypeptidae A với glutaraldehyde Phương pháp này hoàn toàn không dùng chất mang, mà thường dùng các chất có nhóm chức kép, có hai nhóm chức ở hai đầu hoàn toàn giống nhau, phản ứng với các nhóm chức của phân tử E khác nhau, tạo thành các liên kết chéo giữa chúng, “khâu” các phân tử E lại với nhau thành các phần tử có kích thước lớn hơn, không tan, có thể tách chúng khỏi dung dịch bằng cách li tâm hay lọc. Các chất thường dùng vào mục đích này là glutaraldehyde, và một số chất khác như dimethylsuberimidate … phản ứng với nhóm amine, hoặc một số chất phản ứng với nhóm carboxyl (-COOH) nhóm thiol (-SH), trong đó glutaraldehyde được dùng phổ biến nhất. Hình 3: Tạo liên kết chéo giữa các phân tử E Hạn chế của phương pháp này: trong quá trình tạo liên kết chéo giữa các phân tử E, có thể phá hỏng cấu trúc của E, làm giảm hoạt động của nó. Vì vậy, cần lựa chọn điều kiện phản ứng, chất tham gia tạo liên kết chéo sao cho hoạt độ của E bị giảm ít nhất. Để tăng độ bền của chế phẩm, có thể sử dụng thêm protein không có xúc tác như albumin huyết thanh bò. Nói chung phương pháp tạo liên kết chéo ít được sử dụng vì không đáp ứng được yêu cầu của nhiều quá trình kỹ thuật trong sản xuất. 2.6. Phương pháp gắn E vào chất mang rắn bằng liên kết cộng hóa trị Vào những năm 1953, Grubhofer và Schleith đã tạo được các chế phẩm không tan của một số E như carboxypeptidase, diastase, pepsin, và ribonuclease bằng cách tạo liên kết cộng hóa trị giữa E với polyaminostyrene đã được diazot hóa. Có thể nói, thành công này đã mở đầu cho việc sử dụng E trong thực tế. Hình 4: Gắn E vào chất mang bằng liên kết cộng hóa trị Ưu điểm : Có thể tạo ra các chế phẩm có độ bền cao, có thể sử dụng trong nhiều quá trình sản xuất quy mô lớn, trong hệ thống dòng chảy. Trong một số trường hợp, các monomer cũng làm giảm hoạt độ E Do E gắn trên bề mặt chất mang nên dễ tiếp xúc với cơ chất. Hạn chế: Cấu trúc của E có thể bị thay đổi một phần trong quá trình gắn với chất mang, làm giảm hoạt độ xúc tác. Do liên kết giữa E với chất mang, có thể làm giảm sự di chuyển tự do của E, và từ đó cũng làm giảm hoạt động của nó. Việc tìm được các điều kiện thích hợp cho quá trình sản xuất chế phẩm không tan theo phương pháp này cũng có nhiều khó khăn. Những đặc tính cần có của các chất mang : Bề mặt của chất mang phải tương thích với E Phải có các nhóm có khả năng phản ứng với các nhóm chức của protein, nhưng không phản ứng với các nhóm chức của trung tâm hoạt động. Có dung tích kết hợp cao Chất mang phải có tính “trơ” đối với các thành phần phản ứng Chất mang phải bền chặt trong điều kiện quá trình phản ứng liên tục kéo dài Độ bền của chế phẩm còn tùy thuộc tính chất hóa lý của chất mang và phương pháp gắn E. Các nguyên liệu thường dùng làm chất mang Chất mang vô cơ: thủy tinh, aluminum oxide, gồm (ceramic) Các polymer tổng hợp Các polymer của saccharide và dẫn xuất của chúng: agarose, dextran, chitin, cellulose; hay một số protein như collagen, gelatin, albumin. Các chất này có bề mặt phân tử ưa nước, lại có nhiều nhóm hydroxyl, có thể tạo thành liên kết cộng hóa trị với E. Cầu nối giữa E và chất mang Do hạn chế của chất mang khi gắn trực tiếp với E có thể làm ảnh hưởng xấu đến hoạt động của E, một phần do chất mang có thể cản trở bề mặt không gian tiếp xúc giữa E và cơ chất. Vì vậy người ta thường dùng spacer có vai trò như là cầu nối giữa E và chất mang, làm cho E có thể hoạt động trong phạm vi môi trường rộng hơn, dễ tiếp xúc với cơ chất hơn. Khoảng cách giữa E và chất mang cũng có vai trò quan trọng, khi có spacer, khoảng cách giữa E và chất mang là khoảng 1nm. Phải chọn được spacer có chiều dài thích hợp, để vừa đảm bảo độ linh động của E và cũng không quá dài. Ngoài chiều dài, để thực hiện có kết quả phương pháp này còn cần lưu ý đến kiểu liên kết giữa E và chất mang, trình tự kết hợp (spacer kết hợp với E trước rồi mới kết hợp với chất mang hay ngược lại) Phương pháp gắn E vào chất mang bằng liên kết cộng hóa trị: trong nhiều trường hợp thường tiến hành qua 2 giai đoạn chính: Xử lý, hoạt hóa chất mang trước khi gắn E Gắn E vào chất mang đã được hoạt hóa Một số phương pháp dùng để hoạt hóa chất mang như: dùng cyanogens bromide, diazot hóa, azide acid, các chất ngưng tụ… Các ví dụ Cyanogens bromide (BrCN) được sử dụng phổ biến để hoạt hóa các chất mang Có nhiều nhóm hydroxyl như các polysaccharide, các hạt thủy tinh, gồm…sơ đồ phản ứng được trình bày trên hình Phương pháp alkyl hóa các nhóm trên chất mang Làm cho nó dễ dàng phản ứng với các nhóm amino, nhóm hydroxyl phenolic, nhóm sulfhydryl của phân tử E. Các dẫn xuất halogen của acetyl cellulose, dẫn xuất triazinyl của cellulose hay các chất trao đổi ion khác được dùng trong phương pháp này. Tạo cầu disulphide giữa E và chất mang Đối với các E có nhóm sulfydryl không có vai trò quan trọng đối với hoạt động xúc tác của E, có thể dùng chất mang có nhóm sulfydryl để tạo cầu disulphide với E. Phản ứng này có tính thuận nghịch, có thể dễ dàng tách E khỏi chất mang (nếu hoạt động của nó bị giảm), để tái tạo chế phẩm, chỉ cần thêm chất khử vào. Dùng các hóa chất ngưng tụ Ví dụ, sử dụng carbodiimide làm yếu tố ngưng tụ để tạo thành liên kết peptid giữa các nh