Đề tài Khảo sát hàm lượng fucoidan từ một số loài rong nâu phổ biến ở Khánh Hòa

LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, trước tiên tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, lãnh đạo phòng Đào tạo Đại học và Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ Thực phẩm lời cảm ơn sâu sắc, niềm tự hào vì đã được học tập tại Trường trong những năm qua. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Duy Nhứt – Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang và ThS. Nguyễn Thị Mỹ Trang – Bộ môn Đảm bảo chất lượng và An toàn thực phẩm đã tận tâm, tận lực giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn KS. Nguyễn Đăng Khoa - cán bộ thu nhận rong của Viện nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang đã giúp tôi phân loại năm loại rong nâu. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn làm công tác nghiên cứu tại Viện nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang đã giúp đỡ tôi nhiệt tình trong suốt quá trình làm đề tài tại Viện. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với gia đình, người thân và các bạn bè tôi, đã quan tâm sâu sắc, chia sẻ khó khăn và động viên để tôi hoàn thành đồ án này. Sinh viên Đỗ Thị Hồng Thắm ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỞ ĐẦU CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ..................................................................................3 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ RONG BIỂN ......................................................3 1.1.1. Phân loại rong biển.......................................................................................3 1.1.2. Phân bố của 3 ngành rong biển trên thế giới................................................5 1.1.3. Sản lượng rong biển trên thế giới.................................................................7 1.1.4. Ứng dụng của rong biển...............................................................................7 1.2. TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU ....................................................................9 1.2.1. Tình hình phân bố rong Nâu tại Việt Nam...........................................9 1.2.2. Thành phần hóa học của rong Nâu.....................................................10 1.2.3. Đặc điểm rong Mơ .............................................................................12 1.2.3.1. S. mcclurei ...............................................................................................13 1.2.3.2. S. binderi .................................................................................................14 1.2.3.3. S. microcystum (Rong Mơ phao nhỏ) .....................................................15 1.2.3.4. S. polycystum (Rong Mơ nhiều phao) .....................................................17 1.2.3.5. S. serratum (Rong Mơ gai)......................................................................18 1.3. CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH RONG BIỂN ......................................19 1.3.1. Giới thiệu công nghệ sau thu hoạch rong biển...................................19 1.3.2. Một số hiện tượng hư hỏng của rong .................................................21 1.3.3. Các biện pháp bảo quản rong khô ......................................................21 1.4. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ FUCOIDAN .....................................................22 1.4.1. Khái quát về fucoidan ........................................................................22 1.4.2. Tác dụng sinh học của fucoidan.........................................................23 1.4.2.1. Một số tác dụng chữa bệnh của fucoidan ..........................................23 1.4.2.2. Các nghiên cứu về hoạt tính của fucoidan.........................................24 1.4.3. Một số nghiên cứu về fucoidan ở Việt Nam ......................................33 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................37 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU......................................................................37 2.2. HÓA CHẤT VÀ MÁY MÓC THIẾT BỊ.....................................................37 2.2.1. Các hóa chất sử dụng .................................................................................37 2.2.2. Máy móc thiết bị ........................................................................................38 iii 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................38 2.3.1. Khảo sát các phương pháp định lượng hàm lượng fucoidan .....................38 2.3.1.1. Bản quyền US6573250B2 .......................................................................38 2.3.1.2. Bản quyền EP0645143A1 .......................................................................41 2.3.1.3. Định lượng fucoidan theo quy trình tách chiết của Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự .................................................................................................................43 2.3.2. Xác định thành phần đường của fucoidan .................................................45 2.3.3. Bố trí thí nghiệm .......................................................................................51 2.3.3.1. Bố trí thí nghiệm khảo sát các phương pháp định lượng hàm lượng fucoidan ................................................................................................................51 2.3.3.2. Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng fucoidan trong năm loài rong Nâu tại tỉnh Khánh Hòa...............................................................................................52 2.3.3.3. Bố trí thí nghiệm xác định thành phần đường trung tính trong fucoidan ..............................................................................................................................55 2.3.3.4. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện chiết rút fucoidan ra khỏi nguyên liệu rong S. polycystum ........................................................................................59 2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ............................................................60 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................61 3.1. ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG FUCOIDAN THU TỪ LOÀI RONG S. SERRATUM BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP KHÁC NHAU.............................61 3.2. KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG FUCOIDAN TRONG NĂM LOÀI RONG NÂU THU MẪU TẠI TỈNH KHÁNH HÒA .....................................................64 3.3. SƠ BỘ ĐÁNH GIÁ THÀNH PHẦN ĐƯỜNG TRUNG TÍNH TRONG HAI LOÀI RONG S. MCCLUREI VÀ S. POLYCYSTUM.................................66 3.4. SƠ BỘ XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT TINH SẠCH FUCOIDAN TỪ LOÀI RONG S. POLYCYSTUM ............................................70 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................78 1. KẾT LUẬN......................................................................................................78 2. KIẾN NGHỊ .....................................................................................................79 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 1.1 PHỤ LỤC 1.2 iv DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AIDS : Acquired immune deficiency syndrome. C2 : Vị trí cacbon số 2 Da : Dalton DNA : Acid Deoxyribo Nucleic F. : Fucus FDA : Food and Drug Administration F-GX : FUCOIDAN-GLYCALYX Fuc : L-Fucose Gal : D-Galactose GC : Gas chromatography Glc : D-Glucose Gr : Gram HGF : Hepatocyte growth factor HIV : Human immunodeficiency virus HPLC : High Performance Liquid Chromatography IT-IGF : Insulin – Like Growth Factor I Treament Man : D-Mannose MWCO : Molecular weight cut off NK : Natural killer PLC : Performance Liquid Chromatography Rha : D-Rhamnose S. : Sargassum Tế bào B : Lympho bào B Tế bào T : Lympho bào T TFA : Trifluoroacetic UV-VIS : Utralviolet- Visible WHO : World Health Organization Xyl : D-Xylose v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Chỉ tiêu chất lượng của muối canxi clorua .............................................38 Bảng 3.1. Hàm lượng fucoidan chiết tách bằng các phương pháp khác nhau (% so với khối lượng rong khô) ..............................................................................................61 Bảng 3.2. Hàm lượng fucoidan trong năm loài rong Nâu tại tỉnh Khánh Hòa (% so với trọng lượng rong khô)......................................................................................64 Bảng 3.3. Thành phần đường trung tính của fucoidan ............................................68 Bảng 3.4. Kết quả đánh giá quá trình chiết fucoidan từ rong nâu S. polycystum .....71 Bảng 3.5. Kết quả đánh giá quá trình tách laminaral ..............................................74 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Hình thái về rong Lục ..................................................................... 4 Hình 1.2. Hình thái về rong Nâu..................................................................... 4 Hình 1.3. Hình thái về rong Đỏ ...................................................................... 5 Hình 1.4. Hình dạng rong S. mcclurei........................................................... 14 Hình 1.5. Hình dạng rong S. binderi ............................................................. 15 Hình 1.6. Hình dạng rong S. microcystum .................................................... 16 Hình 1.7. Hình dạng rong S. polycystum....................................................... 17 Hình 1.8. Hình dạng rong S. serratum .......................................................... 18 Hình 1.9. Sơ đồ công nghệ sau thu hoạch rong biển của Việt Nam............... 19 Hình 1.10. Sơ đồ sơ chế rong biển lần hai .................................................... 20 Hình 1.11. Đơn vị cấu trúc của fucoidan; liên kết 1,3 [9] ............................. 23 Hình 2.1. Quy trình chiết tách fucoidan theo bản quyền US6573250B2 ....... 39 Hình 2.2. Quy trình chiết fucoidan theo bản quyền EP0645143A1.............. 41 Hình 2.3. Quy trình chiết tách fucoidan của Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự...... 44 Hình 2.4. Quy trình xác định thành phần đường trung tính trong fucoidan của rong Nâu ...................................................................................................... 47 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát các phương pháp xác định hàm lượng fucoidan ............................................................................................. 51 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng Fucoidan trong năm loài rong Nâu tại tỉnh Khánh Hòa................................................................. 53 Hình 2.7. Sơ dồ bố trí thí nghiệm xác định thành phần đường trung tính trong fucoidan của hai loài rong S. polycystum và S. mcclurei............................... 56 Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện chiết rút fucoidan ra khỏi rong S. polycystum ....................................................................................... 59 Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn hàm lượng fucoidan tách chiết được từ các phương pháp khác nhau so với cực đại. ..................................................................... 62 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn hàm lượng fucoidan trong năm loài rong Nâu tại tỉnh Khánh Hòa so với cực đại. .................................................................... 65 Hình 3.3. Sắc ký đồ GC của hexaacetat glucitol ........................................... 67 Hình 3.4. Sắc ký đồ GC của các đường chuẩn .............................................. 67 Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn thành phần đường trung tính trong hai mẫu fucoidan của hai loài rong S. polycystum và S. mcclurei............................... 68 Hình 3.6. Sơ đồ quy trình chiết xuất fucoidan cho hiệu suất chiết cao từ loài rong S. polycystum ....................................................................................... 75 1 MỞ ĐẦU Trong khoảng mười năm gần đây, số lượng các công trình nghiên cứu fucoidan trên thế giới tăng đột ngột gần như dựng đứng trên đồ thị biểu diễn số lượng công trình công bố theo thời gian. Năm 2012, cuốn sách “Sức mạnh kỳ diệu của fucoidan” đã được xuất bản thành tiếng Việt từ nguyên bản tiến Nhật và được nhập vào bán ở Việt Nam. Đồng thời tại Việt Nam, nhiều đề tài nghiên cứu khoa học và dự án sản xuất fucoidan thô, fucoidan sử dụng cho hỗ trợ điều trị chữa bệnh nan y cũng đã được nhà nước đầu tư hàng chục tỉ đồng. Tuy nhiên, chưa có phương pháp xác định hàm lượng fucoidan nào được đưa ra để sử dụng làm phương pháp kiểm chung cho khu vực hoặc cả nước. Việt Nam, là một trong 3 nước (Ấn Độ, Phillipin, Việt Nam) có phân bố số loài rong nâu lớn nhất thế giới và Khánh Hòa là một trong những tỉnh có sản lượng nâu Nâu lớn nhất Việt Nam. Trong bối cảnh đó, việc xác định hàm lượng fucoidan có trong một số loài rong phổ biến tại Khánh Hòa và vấn đề thời sự, nhằm định hướng cho việc khai thác chế biến ứng dụng fucoidan trong nghiên cứu cũng như trong sản xuất, định hướng vật liệu để có sự chọn lựa trong việc sử dụng rong nâu làm dược liệu hay làm keo rong. Cùng với việc thực hiện các đề tài nghiên cứu dược liệu từ fucoidan của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, tôi được Khoa Công nghệ Thực phẩm Trường Đại Học Nha Trang phân công tiến hành thực hiện đồ án: “Khảo sát hàm lượng fucoidan từ một số loài rong nâu phổ biến ở Khánh Hòa” Nhiệm vụ đặt ra của luận văn là: 1) Đánh giá hàm lượng fucoidan thu nhận bằng ba phương pháp ( bản quyền US6573250B2, Bản quyền EP0645143A1 và phương pháp của Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự). 2 2) Xác định hàm lượng fucoidan trong năm loài rong nâu thu mẫu tại Khánh Hòa. 3) Sơ bộ đánh giá quá trình tách chiết thu nhận fucoidan từ loài rong có hàm lượng fucoidan cao. Do thời gian nghiên cứu có hạn nên đồ án này không tránh khỏi những hạn chế, tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của quý thầy cô và bạn bè để đồ án được hoàn thiện hơn. Xin chân thành cảm ơn! 3 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ RONG BIỂN 1.1.1. Phân loại rong biển Rong biển hay tảo biển có tên khoa học là marine – algae, marine plant hay seaweed. Rong biển là thực vật thủy sinh có đời sống gắn liền với nước. Chúng có thể là đơn bào, đa bào sống thành quần thể. Hình dạng của chúng có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay hình thù rất đặc biệt. Rong biển thường phân bố ở các vùng nước mặn, nước lợ, cửa sông, vùng triền sâu, vùng biển cạn Rong Đỏ và rong Nâu là hai đối tượng được nghiên cứu với sản lượng lớn và được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp và đời sống. Tùy thuộc vào thành phần cấu tạo, thành phần sắc tố, đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh sản mà rong biển được chia thành 9 ngành sau: 1, Ngành rong Lục (Chlorophyta) 2, Ngành rong Trần (Englenophyta) 3, Ngành rong Giáp (Pyrophyta) 4, Ngành rong Khuê (Bacillareonphyta) 5, Ngành rong Kim (Chrysophyta) 6, Ngành rong Vàng (Xantophyta) 7, Ngành rong Nâu (Phaecophyta) 8, Ngành rong Đỏ (Rhodophyta) 9, Ngành rong Lam (Cyanophyta) Trong đó, ba ngành có giá trị kinh tế cao là rong Lục, rong Nâu, rong Đỏ. 4 Ngành rong Lục: có trên dưới 360 chi và hơn 5700 loài, phần lớn sống trong nước ngọt, nét đặc trưng của loài rong này là có màu lục Hình 1.1. Hình thái về rong Lục Ngành rong Nâu: có trên 190 chi, hơn 900 loài, phần lớn sống ở biển, số chi, loài tìm thấy trong nước ngọt không nhiều lắm. Hình 1.2. Hình thái về rong Nâu 5 Ngành rong Đỏ: rong Đỏ là những loại rong biển khi tươi có màu hồng lục, hồng tím, hồng nâu. Khi khô tùy theo phương pháp chế biến chuyển sang màu nâu hay nâu vàng đến vàng. Rong Đỏ có 2500 loài, gồm 400 chi, thuộc nhiều họ, phần lớn sống ở biển. [4] Hình 1.3. Hình thái về rong Đỏ 1.1.2. Phân bố của 3 ngành rong biển trên thế giới Xét về số lượng các loài rong, thì rong Lục (Chlorophyta) trên thế giới chủ yếu phân bố tập trung tại Philippin, tiếp theo là Hàn Quốc, kế tiếp là Indonesia, Nhật Bản và ít hơn là ở Việt Nam với các loài Caulerpa racemosa, Ulva reticulata, Ulva lactuca. Ngoài ra, rong Lục còn phân bố rải rác ở các nước bao gồm: Achentina, Bangladesh, Canada, Chile, Pháp, Hawaii, Israel, Italy, Kenya, Malaysia, Myanmar, Bồ Đào Nha, Thái Lan. Rong Đỏ (Rhodophyta) phân bố nhiều ở Việt Nam. Sau đó cùng với số lượng loài tương đương nhau ở Nhật Bản, Chile, Indonesia, Philippin, Canada, Hàn Quốc tiếp theo sau là Thái Lan, Brazil, Pháp, Bồ Đào Nha, Trung Quốc, Hawaii, Myanmar, Nam Phi, ít hơn nữa là Anh, Bangladesh, Caribbe, Ireland, Peru, Tây Ban Nha, Achentina, Ấn Độ, Italy, Malaysia, Mexico, New Zealand, Mỹ sau hết là rải rác có mặt ở Iceland, Alaska, Kenya, Madagascar, Kiribati, Ai Cập, Israel, Ma rốc, Namibia, Tanzania. 6 Rong Nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, ấn Độ, kế tiếp là Chile, Achentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha. Trong đó bộ Fucales, đối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong Nâu đại diện là họ Sargassaceae với hai giống Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng cận nhiệt đới. [phụ lục 1.1] Hệ thống phân loại Sargassum trtên thế giới rất phức tạp, năm 1753 ba loài thuộc chi Fucus: Fucus natans, F. acinarius và F. lendigerus do Linnaeus mô tả lần đầu tiên nay được thay thế bằng chi Sargassum. Giữa những năm 1808 đến 1819, 36 loài rong thuộc chi Fucus được mô tả ngày nay cũng được chuyển sang chi Sargassum, năm 1820 J.Agardh giới thiệu chi Sargassum với số loài lúc này là 62 loài. Sau thời gian đó rất nhiều tác giả khác tiếp tục giới thiệu về Sargassum như Yendo (1907), Reinbold (1913), Grunow (1915, 1916) and Setchell (1931). Số loài Sargassum lên đến 230. Năm 1954 Womersley công bố hệ thống phân loại Sargassum của mình ở Úc, cùng với các tác giả đương thời ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới như Phạm Hoàng Hộ của Việt Nam, Chou, Chiang của Taiwan và Ang, Trono của Philippin, đến nay tổng số loài của chi Sargassum đã lên đến hơn 500. Sargassum tại Việt Nam hiện nay có khoảng 70 loài (thực vật chí Việt Nam), số lượng loài Sargassum phân bố trên các nước luôn thay đổi theo các nghiên cứu gần đây nên khó có thể kết luận hiện nay Sargassum phân bố nhiều nhất ở nước nào. Riêng tính đến 1998 thì nhiều nhất là ở Ấn Độ, Philippin và Việt Nam. [phụ lục 1.1] Phân bố về số loài rong biển tuy đã được tổng kết sơ bộ, tuy nhiên, tuỳ theo diện tích lãnh hải, điều kiện môi trường phát triển, kỹ thuật nuôi trồng khác nhau của các nước mà sản lượng rong biển trên thế giới khác với phân bố các loài rong. 7 1.1.3. Sản lượng rong biển trên thế giới Rong Lục chủ yếu là của Nhật Bản khoảng 4.000 tấn khô với các chi như Enteromorpha, Monostroma, Ulva, trong đó nuôi trồng khoảng 2.500 tấn, kế tiếp là Hàn Quốc khoảng 1.000 tấn chi Enteromorpha, Philippines khoảng 800 tấn chi Caulerpa, gần như toàn bộ do nuôi trồng. Rong Đỏ chủ yếu là Pháp khoảng 600.000 tấn, chi Maerl, tiếp theo là Anh khoảng 200.000 tấn, chi Maerl (t ww), ít hơn là Chile khoảng 75.000 tấn gồm các chi Gracilaria, Gigatina, Gelidium. Nhật Bản khoảng 65.000 tấn, trong đó khoảng 60.000 tấn là do nuôi trồng, gồm các chi Porphyra và Gelidium. Philippines khoảng 40.000 tấn do nuôi trồng bao gồm chi Euchuema và Kapaphycus. Hàn Quốc cũng có sản lượng tương đương với chi Porphyra, tiếp đến là Trung Quốc với khoảng 31.000 tấn chủ yếu là Porphyra, Indonesia khoảng 26.000 tấn chi Euchuema và GracilariaViệt Nam khoảng 2.000 tấn chi Gracilaria. Sản lượng rong Nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên 667.000 tấn khô, tập trung vào 3 chi Laminaria, Udaria, Ascophyllum . Hàn Quốc khoảng 96.000 tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria. Nhật Bản khoảng 1.000 tấn Laminaria, Udaria, Cladosiphon, Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile khoảng 27.000 tấn[phụ lục 1.2] 1.1.4. Ứng dụng của rong biển Rong biển đã được sử dụng từ rất sớm, khoảng 2700 năm trước công nguyên ở Trung quốc. Sze Teu đã viết rằng 600 năm trước công nguyên, rong biển đã được chế biến thành mộ