Đề tài Liệu pháp gen

GIỚI THIỆU CHUNG Vào ngày 14-9-1990, nhóm nghiên cứu tại học viện sức khỏe quốc gia Mỹ (U.S.National Instituse of Helth) đã tiến hành chuỗi thử nghiệm liệu pháp gen đầu tiên cho bé Ashanti Desilva 4 tuổi. Sinh ra với căn bệnh di truyền hiểm nghèo có tên là severe combined immune deficiency SCDI, cô bé thiếu hệ thống miễn dịch và có thể bị tổn thương khi mắc phải bất kỳ mầm bệnh nào. Trẻ em mắc bệnh này thường không chống lại được sự lây nhiễm của bệnh tật và rất khó sống đến tuổi trưởng thành, tuổi thơ của chúng luôn mắc bệnh tật. Ashanti được lập một hành lang bảo vệ xung quanh, không tiếp xúc với những người ngoài gia đình, trong môi trường vô trùng tại nhà và được điều trị thường xuyên với kháng sinh liều cao. Trong thủ tục liệu pháp gen của Ashanti, bác sĩ đã tách các tế bào máu trắng ra khỏi cơ thể cô ta, cho chúng phát triển trong phòng thí nghiệm, gắn gen thiếu vào các tế bào này và sau đó chuyển các tế bào đã được biến đổi di truyền trở lại máu của bệnh nhân. Những kiểm tra trong phòng thí nghiệm đã cho thấy liệu pháp này đã làm tăng hệ thống miễn dịch của Ashanti, cô ta không bị cảm lạnh trở lại, có thể đến trường và đã miễn dịch với chứng ho. Thủ tục này không phải là một phương thuốc, những tế bào máu trắng được xử lý về mặt di truyền chỉ làm việc trong một vài tháng và quá trình này phải lặp lại. Mặc dù sự giải thích đơn giản về liệu pháp gen này dường như có kết quả khả quan, nhưng nó mở đầu cho một cuộc tranh luận kéo dài; con đường để liệu pháp gen được chấp nhận chứa đầy những cuộc tranh luận. Liệu pháp gen sinh học ở người là rất phức tạp, một số công nghệ cần được phát triển và những căn bệnh cần được hiểu biết cặn kẽ hơn trước khi liệu pháp gen có thể được sử đụng một cách thích đáng. Tuy nhiên, không thể phủ nhận rằng, ngày nay liệu pháp gen là một lĩnh vực khổng lồ với cơ hội sinh lời lớn cho các nhà đầu tư có hiểu biết. Bằng chứng là sự phát triển của các nghiên cứu về liệu pháp gen trong hơn một thập kỷ qua. Lĩnh vực này có tiềm năng vô cùng to lớn, một số người đã so sánh tiềm năng đầu tư trong công nghệ sinh học đặc biệt là liệu pháp gen với kinh nghiệm về công nghệ những năm 1980. LIỆU PHÁP GEN LÀ GÌ? Định nghĩa liệu pháp gen. Trong các ứng dụng của sinh học phân tử vào y học, liệu pháp gen đối với các rối loạn di truyền mở ra nhiều triển vọng nhất, đồng thời cũng là hướng ứng dụng khó thực hiện nhất. Các định nghĩa về liệu pháp gen được thay đổi theo thời gian, ngày nay không có định nghĩa chung nào được chấp nhận cho khái niệm này. Song định nghĩa sau đây được sử dụng rộng rãi nhất trong các diễn đàn Quốc tế. Định nghĩa: liệu pháp gen là kỹ thuật đưa gen lành vào cơ thể thay thế cho gen bệnh hay đưa gen cần thiết nào đó thay vào vị trí gen bị sai hỏng để đạt được mục tiêu của liệu pháp. - Biện pháp thứ nhất là cách giải quyết triệt để, vì gen lành sẽ được đưa vào đúng vị trí của nó trên bộ gen và chịu tác động bình thường của các trình tự biểu hiện gen đó. Cho đến nay, chưa có thành tựu đáng kể nào trong lĩnh vực này vì người ta chưa biết cách sửa chữa gen một cách đặc hiệu. Tuy vậy, kỹ thuật tái tổ hợp đồng dạng cũng đem dến những hy vọng rất lớn và khả năng thành công là điều hoàn toàn có thể hy vọng trong tương lai. - Biện pháp thứ hai dễ thực hiện hơn nhưng khi đưa thêm một gen cần thiết vào bộ gen, người ta không làm chủ được vị trí gắn xen của đoạn mới đưa vào. Điều này dẫn đến một số kết quả không lường trước được:       Gen mới đưa vào không nằm trong phức hợp điều hoà nên có thể được biểu hịên một cách tuỳ tiện, không đúng nơi (đúng với loại tế bào, mô đặc hiệu) và không đúng lúc (đúng với chu trình phát triển cá thể), hoặc thậm chí không được biểu hiện.       Gen mới đưa vào gây những hiệu quả không mong muốn.       Gen gắn vào một vị trí có khả năng hoạt hoá một gen tiền ung thư dẫn dến sự biểu hiện quá độ của gen này gây ra ung thư. Hiện nay, mọi cố gắng đều nhằm giải quyết những vấn đề này. Đặc biệt, liệu pháp gen trong trường hợp này được giới hạn chặt chẽ trên tế bào sinh dưỡng. Việc tác động vào gen của tế bào sinh dục bị nghiêm cấm vì lý do đạo đức, con người từ chối việc thay đổi gia sản di truyền có thể lưu lại cho con thế hệ sau. Liệu pháp gen có thể được tiến hành thông qua một số cách sau:       Chuyển trực tiếp gen vào mô người bệnh.       Tạo véctơ virus để chuyển gen một cách hiệu quả tới tế bào (in vivo). Virus xâm nhiễm trực tiếp vào tế bào bằng cách gắn với chúng và “bơm” thông tin di truyền của chúng vào tế bào. Vì các virus tự nhiên tự sinh sản bên trong tế bào chủ nên gây hại với vật chủ mang chúng. Tuy nhiên, có thể xoá hay làm mất các phần có hại của virus, ngăn không cho chúng tái bản trong tế bào chủ. Ngày nay các virus không có khả năng tái bản này được sử dụng chung cho các nghiên cứu liệu pháp gen trên người và động vật.       Sử dụng các kỹ thuật khác nhau để chuyển gen vào tế bào bên ngoài người bệnh, sau đó chuyển các tế bào đã được biến đổi này vào người bệnh (ex vivo). Phương pháp này được sử dụng chung để phân phối các nhân tố phát triển và các phân tử khác tới các vùng đặc hiệu của cơ thể. Chúng cũng được sử dụng để tạo ra các dòng tế bào đã bị biến đổi hoàn toàn cho cấy ghép. Giống như trong liệu pháp gen in vivo, các tế bào được chuyển có thể gây biểu hiện các protein lạ gây sưng tấy hay đáp ứng miễn dịch.       Các nhóm chuyên gia đã chia liệu pháp gen thành các mức khác nhau:       Chuyển gen với sự hoà nhập (gen được kết hợp chặt chẽ với DNA của vật chủ)       Chuyển gen không hoà nhập (gen không kết hợp chặt chẽ với DNA của vật chủ)       Sử dụng các oligonucleotide tổng hợp nhân tạo gọi là các phân tử ribozyme/antisense không có các thành phần điều hoà (sự biểu hiện gen đã bị biến đổi). Các bước cơ bản trong liệu pháp gen Trong thực nghiệm, người ta dùng các vector virus để chuyển các gen vào tế bào động vật theo 2 bước: Bước 1: Tạo vector tái tổ hợp mang gen cần chuyển. Trước đó, các virus đã được biến đổi để không còn khả năng sao chép, đồng thời lại có khả năng biểu hiện mạnh gen cần đưa vào cơ thể. Các biến đổi này bao gồm việc loại bỏ các trình tự cần cho sự sao chép của virus và gắn vào trước gen các trình tự promotor mạnh. Sau đó, vector tái tổ hợp được đưa vào tế bào nuôi cấy. Loại tế bào được sử dụng nhiều nhất là tế bào tuỷ xương vì dễ nuôi cấy lại bao gồm nhiều tế bào nguồn đa thế (pluri potential) Bước 2: Vector virus mang gen lành được đưa vào cơ thể mà từ đó người ta đã tách các tế bào tuỷ xương. Như vậy, có thể xem đây là kỹ thuật ghép tự thân dù gen ghép vào là gen lạ đối với cơ thể. Trở ngại lớn là protein do gen lạ tạo ra có thể kích thích sản sinh kháng thể chống lại chính nó, hơn nữa, nếu việc chuyển gen vào tế bào nuôi cấy thường thành công thì việc đưa tế bào chuyển gen trở lại cơ thể lại ít khi có hiệu quả do nhiều nguyên nhân. Gần đây nhất, một quy trình liệu pháp gen vừa được thông qua nhằm làm chậm sự phát triển của bệnh AIDS. Người ta chuyển các oligonucleotit đối (antisens) bổ sung cho một số trình tự của virus HIV (trình tự TAR, REV) vào các tế bào của một người lành là anh em sinh đôi của người bệnh. Sau đó các tế bào này được tiêm vào bệnh nhân. Các Oligonicliotit đối TAR sẽ ức chế sự sao chép của virus khi bắt cặp và vô hiệu hóa trình tự TAR đóng vai trò trong sự sao chép. Còn các Oligonucleotit đối REV, khi bắt cặp với trình tự REV sẽ ngăn sự vận chuyển mRNA từ nhân ra tế bào chất. Ứng dụng của liệu pháp gen trong điều trị bệnh Đến nay có 533 thử nghiệm liệu pháp gen diễn ra trên thế giới. Với 407 thử nghiệm diễn ra ở Mỹ, đây là nước dẫn đầu trong các thử nghệm của liệu pháp gen. Trong số 533 thử nghiệm, có 322 thử nghiệm trong điều trị bệnh ung thư, chiếm 62,28%, 37 thử nghiệm trong điều trị HIV chiếm 6,94%, ngoài ra là các thử nghiệm với các bệnh tim mạch, u xơ, SCID (severe combined immune deficiency), chứng máu khó đông... CÁC YẾU TỐ KỸ THUẬT TRONG CHUYỂN GEN “Không hệ thống véctơ nào là tối ưu cho tất cả các kỹ thuật của liệu pháp gen’ Kay, M., Glorioso, J., Naldini, L. Nature Medicine 7 (1) 2001 Các cơ sở của sinh học phân tử: Thông tin di truyền dưới dạng DNA tồn tại trong mỗi tế bào của cơ thể (trừ các tế bào máu). Mỗi tế bào chứa đựng các thông tin để xây dựng bất cứ dạng tế bào hay mô đặc hiệu nào của sinh vật. Vì các tế bào và mô khác nhau quy định sự sản xuất của các khối cấu trúc (building block) khác nhau nên DNA chứa đựng thông tin liên quan đến khối các cấu trúc để sản xuất các mô đặc hiệu. Sự tiến hoá đã cung cấp một giải pháp tuyệt vời cho vấn đề này. DNA được tạo nên từ một chuỗi bốn phân tử khác nhau: adenine, guanine, cytosine và thymine. Sự kết hợp của các phân tử này tạo nên “ngôn ngữ” của DNA. Gen, được tạo nên từ DNA mã hoá tất cả các protein, là khối cấu trúc của tế bào. Các promoter cho phép hoạt hoá của các gen và qua đó các protein đặc hiệu được biểu hiện. Các vùng khác của DNA không mang mã và là phần quan trọng để bảo tồn cấu trúc nhiễm sắc thể. Thành phần này của của DNA vô cùng quan trọng trong các dự án về bộ gen, tính tuần hoàn đoạn của DNA trong các vùng không mang mã có thể được kết hợp với các gen đã biểu hiện, cho chúng ta phương pháp tìm kiếm các gen chưa biết.       Tự nhiên đã phát triển một cách thức rất thông minh mà qua đó các protein đặc hiệu chỉ được biểu hiện trong các mô dặc hiệu. DNA sắp thành các sợi dài gọi là nhiễm sắc thể. Có hai bản sao của mỗi gen tồn tại trong tế bào. Tuy nhiên có một số trường hợp ngoại lệ, các gen tồn tại trong các nhiễm sắc thể X và Y (nhân tố quyết định giới tính) có thể chỉ có duy nhất một bản sao.       Thông tin được truyền từ DNA đến các cơ quan phức tạp hơn. Quá trình phiên mã được bắt đầu bởi các phân tử nhận biết đặc hiệu có tên là các nhân tố phiên mã (nhân tố gắn với các chuỗi điều hoà của gen và cho phép sự sao chép được tiến hành). Bản sao được tạo thành từ phân tử ban đầu gọi là RNA trong nhân tế bào. Bản sao sau đó ra khỏi nhân tế bào, chuyển đến lưới nội chất, nơi mà nó sẽ được dịch mã tổng hợp thành protein. Cơ sở của liệu pháp gen Để chuyển gen, cần hội đủ một số điều kiện sau đây:       Đầu tiên, phải có bản sao đầy đủ của gen thích hợp với những trình tự điều hoà thích hợp (trình tự khởi động), trình tự khởi động có thể là duy nhất đối với gen đặc hiệu, bằng cách này cho phép gen chỉ biều hiện trong các mô mà thông thường chúng được biểu hiện. Lần lượt, các gen có thể được kết nối với các trình tự khởi động, hoạt hoá trong tất cả các mô (phương pháp chung nhất được sử dụng ngày nay) hoặc có thể kết nối với các trình tự có thể hoạt hoá hay bất hoạt như một công tắc. Những thao tác như vậy có thể đạt được bằng công nghệ DNA tái tổ hợp.       Thứ hai, phải lựa chọn kỹ thuật đích. DNA cần kỹ thuật này để có thể tiếp cận với tế bào. Ba kỹ thuật cơ bản được sử dụng để làm điều này:         DNA có thể được gắn trực tiếp với các tế bào hoặc cấy vào mô. Gọi là chuyển DNA trần (nacked DNA transfer)         DNA có thể được sử dụng dể tạo nên con thoi dịch chuyển virus (viral transfer shuttle). Đây là phương pháp chuyển DNA hầu như chắc chắn nhất. DNA xâm nhập không hiệu quả vào tế bào vì nó khó có thể xuyên qua lớp màng lipit kép, nhưng vector virus dễ dàng làm việc này.         DNA cũng có thể phối hợp với các phức hệ hoá học khác nhau để khuếch đại khả năng chuyển dịch qua màng tế bào của nó.       Thứ ba, có hai phương pháp ứng dụng liệu pháp gen: liệu pháp gen có thể ứng dụng trực tiếp với bệnh nhân hoặc trên các tế bào đã tách ra khỏi người bệnh (như tế bào tuỷ xương) sau đó cấy trở lại người bệnh. Trong tương lai, các thao tác liệu pháp gen của tế bào gốc phát triển trên môi trường mô tế bào và sau đó cấy lên người bệnh sẽ là tiến triển tột cùng. Mỗi kỹ thuật trên đều có những thuận lợi và khó khăn riêng. Khi chọn phương pháp phân phối gen, một số nhân tố cần được cân nhắc:         Hiệu quả của liệu pháp phải được đặt lên hàng đầu.         Sau đó, gen chuyển đổi phải được điều hoà đúng đắn. Nó phải được hoạt hoá đúng lúc, với độ dài thời gian chính xác và đúng số lượng. Những vấn đề này là rào cản to lớn cho sự phát triển và phổ biến của liệu pháp gen. Hiện nay đích ứng dụng quan trọng nhất của liệu pháp gen là các bệnh hiểm nghèo, ở đó mô bệnh dễ dàng bị ảnh hưởng và những bệnh mà sự điều hoà chính xác của gen được chuyển là không cần thiết. Đúng như mong muốn, hiệu quả của liệu pháp trong các trường hợp này dễ dàng quản lý. Sự tinh vi của chúng ta trong thiết kế vector và promotor ngày càng tăng, mở ra nhiều triển vọng mới cho những ứng dụng điều trị các bệnh hiểm nghèo (như bệnh đái đường) thông qua sự tập hợp thông tin của các dự án về bộ gen người mà ở đó sự điều hoà gen là phức tạp hơn. Để chuyển gen, trong các nghiên cứu sử dụng các vector có hoặc không có bản chất virus nhằm đưa gen mục tiêu đến các tế bào. Hiện nay, các nghiên cứu phân phối gen nhờ retrovirus diễn ra nhiều nhất sau đó đến adenovirus. Vector chuyển gen có bản chất virus Các bước quan trọng để hoạt hóa thành công virus và chức năng của nó Sự sử dụng virus trong liệu pháp gen dựa trên các chức năng cơ bản của nó:       Chuyển đặc hiệu vật chất di truyền đến tế bào. Virus chứa vật chất di truyền được bao quanh bởi lớp màng protein. Đầu tiên, virus gắn tới các tế bào riêng biệt bằng sự tương tác với thụ thể (hay một chuỗi các điểm thụ thể) trên bề mặt tế bào. Tiếp đó, virus vào tế bào bởi sự tương tác với các phân tử bề mặt đặc hiệu trên tế bào, bằng cách này nó dễ dàng đi xuyên qua lớp rào chắn màng tế bào.       Sự phụ thuộc vào dạng của vector virus được sử dụng, những gen được mang bởi virus hoặc được nhân bản sử dụng nguyên liệu của chính các tế bào hoặc được tiếp hợp tới nhân của tế bào, nơi mà các nhiễm sắc thể và DNA nhân tồn tại. Các gen đặc hiệu được mang và được tiếp hợp bởi virus sẽ phiên mã thổng hợp RNA và dịch mã tạo thành protein để tạo nên chức năng mong muốn hay sản phẩm của liệu pháp.       Các virus khác nhau có mức độ khác nhau trên phương diện chuyển gen của chúng tới các tế bào và tạo ra các sản phẩm gen. Hơn nữa, hiệu quả cuối cùng của chúng đối với các gen chức năng trong tế bào không giống nhau và có thể khác nhau từ tế bào này đến tế bào khác hoặc mô của cơ quan này đên mô cơ quan khác. Những vấn đề này hưởng lớn tới thuận lợi y học và thành công của chiến lược liệu pháp gen dựa trên vector virus.       Tất cả các vector được sản xuất từ các virus tái tổ hợp kiểu hoang dại đã được xác định. Nói chung, các gen có vai trò trong tái bản virus được loại bỏ để ngăn cản sự truyền đi không mong muốn của vector virus và để ngăn cản các vector virus gây bệnh.       Hiện tại, có 4 dạng chính của vector virus đang được sử dụng trong nghiên cứu và ứng dụng: adenovirus, adeno-associate virus (AAV), retrovirus và herpes Simplex. Bảng 2: So sánh đặc điểm của các hệ thống chuyển gen virus
Vector Adenovirus: Một trong những vector liệu pháp gen chung nhất hiện đang sử dụng là vector có cơ sở adenovirus. Adenovirus gây bệnh khó thở ở người (cảm lạnh, nhiễm trùng dạ dày) và có 47 dạng khác nhau (gọi là kiểu huyết thanh) được tìm thấy ở người. Kiểu 2 và 5 được sử dụng chung nhất cho các ứng dụng liệu pháp gen.
Hình 1: Adenovirus có cấu trúc chung chứa capsid hai mươi mặt bao quanh bộ gen dsDNA dài xấp xỉ 36kbp. Vỏ capsid của virus chứa ba protein: hexon, fiber và base penton. Hexon là thành phần cấu trúc quan trọng, tạo thành bề mặt hai mươi mặt, trong khi các penton tạo thành phức hệ với fiber cho kết quả là 12 “chóp” ngoài vỏ virus đóng vai trò quan trọng trong việc gắn với các phối tử. Điểm đầu tiên trong sản xuất vector liệu pháp gen là lấy đi gen điều khiển tái bản (sự phát triển) của virus trong mô. Sự sinh sản và phát triển của một lượng nhỏ virus mới là nguyên nhân chung cho những hiệu ứng độc do nhiễm virus. Bộ gen của adenovirus đã được nghiên cứu khá kỹ, chứa DNA xoắn kép gồm 50 gen, dài 36 kilobase (KB). Gen E1 điều hoà phiên mã trong khi gen E2 và E3 điều hoà quá trình dịch mã của bộ gen. Các vector đã tách gen này cho phép mang gen dài 8kb. Trước đây, sự phát triển của các vector này dựa trên việc sử dụng virus giúp đỡ (helper virus) để cung cấp các chức năng của gen bị huỷ. Tuy nhiên, ngày nay một dòng tế bào có giá trị thương mại đã được tạo ra để mang các gen bị xoá dạng vector. Sự phát triển của các dòng tế bào này có thể làm adenovirus có giá trị thương mại và an toàn hơn. Khi đó rủi ro của việc sử dụng virus kiểu hoang dại được giảm bớt. Trên hết, sản phẩm vector này có hiệu quả, với nồng độ 1x1012 đoạn virus/ml đang được sản xuất. Phép đo hoạt tính vector thực tế rất quan trọng trong liệu pháp gen. Việc đo các phần tử vector đơn độc không bao hàm rằng tất cả các đoạn là nhiễm và do đó, có hoạt tính. Hiện nay, có những cố gắng tiêu chuẩn hóa liều lượng và hoạt tính của các vector virus. Thật không may, hệ thống vector adenovirus đã xuất hiện một vài bất cập. Sự sản xuất của liệu pháp gen là giới hạn cho một chu kỳ thời gian ngắn và DNA đã được chuyển không trở thành một phần của DNA trên tế bào chủ. Các tác động trở lại của vector adenovirus cũng có thể gây ra đáp ứng miễn dịch mạnh trên vật chủ, có nguy cơ dẫn tới các biến chứng nghiêm trọng. Trọng tâm nghiên cứu hiện nay nhằm cải tiến vector adenovirus đích và giảm các phản ứng miễn dịch do virus gây ra, mang tới thành công đầy hứa hẹn trong việc sự sử dụng các vector phá huỷ bên trong (gutted vector) chỉ sử dụng vỏ ngoài của adenovirus. Sự phát triển thú vị khác là khả năng điều khiển vector adenovirus đích tới các nhóm tế bào đặc hiệu. Công nghệ “retargeting” bao gồm việc sản xuất kháng thể cho protein thụ thể có vỏ adenovirus, nhân tố được sử dụng để gắn kết và gia nhập tế bào. Kháng thể này được hợp nhất với kháng thể đơn dòng (monoclonal) chống lại protein đặc hiệu tồn tại trên bề mặt của tế bào. Vector sau đó hoà trộn với kháng thể dung hợp. Khi được sử dụng, chỉ những tế bào biểu hiện protein đặc hiệu được chữa trị bằng vector này. Một số công ty (ví dụ: GenVec) sản xuất vector adenovirus đã biến đổi bề mặt điểm thụ cảm, điểm sẽ kết hợp với các tế bào khác nhau. Việc phân loại của các vector khác nhau này cho phép adenovirus đích tới những mô khác nhau khi sử dụng các kháng thể.
Hình 2: Sơ đồ cấu trúc của vector adenovirus hiệu năng cao (high-capacity adenoviral) HC-Ad. Tất cả các gen của virus HC-Ad bị xoá, chỉ còn đầu bên trái và phải của Ad5 và DNA thêm vào (stuffer DNA) thu được từ gen C346 và HPRT. AdSTK109 chứa bộ gen hAAT bao gồm liver và promoter macrophage đặc hiệu, trong AdGS85, hAAT cDNA được biểu hiện từ promoter cytomegalovirus của người ((hCMV promoter). AdSTK129 chỉ chứa DNA thêm vào và không biểu hiện bất cứ gen chuyển nào. Vector Adeno-associated Virus (AAV): AAV là một parvovirus không xuất hiện trong các bệnh do vi sinh vật ở người. Virus này có thể chuyển DNA tới các tế bào không phân chia và hoà nhập với DNA của tế bào chủ. Điều này mở ra khả năng ứng dụng của một vector chống lại các bệnh kinh niên. Trong dài hạn, sự biểu hiện của liệu pháp gen đã được chứng minh. Virus này nhỏ do đó chỉ có thể mang những gen có kích thước giới hạn. Nó cũng khó sản xuất hơn các vector khác nên tính thương mại hiện nay bị hạn chế. Có 6 kiểu huyết thanh (serotype) của AAV, kiểu 2 thường được sử dụng trong các ứng dụng của liệu pháp gen. Do kích thước nhỏ, vector này chỉ mang được gen có kích thước lớn nhất là 5 kB. Như vậy, không thể chuyển được các gen phức tạp với kích thước lớn. Một số phương thức được đề ra để giải quyết vấn đề này. Một trong số đó là kỹ thuật liên kết bộ gen vector để phân cắt một số gen hợp nhất (cooperating gene) và phân phối chúng tới đích, sử dụng hai vector phân cắt. Một cách trung gian là sự nhân bản của các vector dung hợp sử dụng lớp vỏ của adenovirus kết hợp với bộ gen của vector AAV. Điều không thuận lợi của phương pháp là vector này đòi hỏi sự giứp đỡ của adenovirus để được tổng hợp. Điều này có thể dẫn đến sự hợp tác mạo hiểm với vector adenovirus (phản ứng miễn dịch). Gần đây, 3 plasmid, hệ thống virus giúp đỡ