Đề tài Nghiên cứu chiết tách hợp chất polyphenol trong lá chè xanh trồng tại tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu và nghiên cứu ứng dụng trong dược mỹ phẩm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÀ RỊA - VŨNG TÀU BÁO CÁO ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH HỢP CHẤT POLYPHENOL TRONG LÁ CHÈ XANH TRỒNG TẠI TỈNH BÀ RỊA VŨNG TÀU VÀ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC MỸ PHẨM Chủ nhiệm đề tài: Sinh viên: Tống Thị Ngọc Bé, lớp DH15HC GVHD: TS. Tống Thị Minh Thu đồng hướng dẫn TS. Nguyễn Thị Tuyết BÀ RỊA - VŨNG TÀU, tháng 07, năm 2019 1. Tên đề tài: Nghiên cứu chiết tách hợp chất polyphenol trong lá chè xanh trồng tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu và nghiên cứu ứng dụng trong Dược Mỹ Phẩm. Mã số: 1459/HD-BVU 2. Chủ nhiệm đề tài: Tống Thị Ngọc Bé, sinh viên lớp DH15HC, Viện: Kỹ thuật – Kinh Tế biển, Trường: Đại học Bà Rịa – Vũng Tàu. 3. Nội dung chính: - Chiết tách polyphenol trong lá chè xanh bằng dung môi, Enzym và kỹ thuật khác. - Định tính thành phần hóa học trong polyphenol bằng Thuốc thử, sắc ký lớp mỏng (TLC), UV-VIS. - Định lượng bằng phương pháp Folin-Denis và Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). - Hoạt tính chống oxi hóa được xác định dựa theo mô hình phospho molybdenum. - Xác định hoạt tính kháng khuẩn của polyphenol theo phương pháp xác định đường kính vòng vô khuẩn. 4. Kết quả đạt được: - Đã tìm được điều kiện tối ưu cho quá trình chiết polyphenol từ lá chè xanh là: Nồng độ dung môi ethanol 70%, tỉ lệ Nguyên liệu/Dung môi là 1/25, nhiệt độ chiết 65 OC, thời gian: 35 phút. - Hàm lượng polyphenol tổng cao nhất trong lá chè (Loại lá thứ 2, 3, 4) là 20,79%, có hỗ trợ enzym Cenlulozo 2,5% v/w thì hàm lượng polyphenol tổng là 22,07% với hiệu suất chiết tăng 1,1 lần; pectinase 3% thì hàm lượng polyphenol tổng là 20,79% và hiệu suất tăng 1,04 lần. Hàm lượng polyphenol cao nhất ở nụ lá 21,94% và thấp nhất ở lá chè già 17%. Khi sấy cao chiết lá chè ở nhiệt độ 120 oC thì hàm lượng polyphenol còn rất thấp 1,41% - Sử dụng phương pháp sấy thăng hoa nhằm hạn chế sự ảnh hưởng của nhiệt độ cao tới hàm lượng polyphenol tổng và đồng thời giữ được mà và mùi vị ban đầu của lá chè. - Hoạt tính oxy hóa của dịch chiết polyphenol lá chè cao hơn rất nhiều so với các loại lá khác (Lá neem, lá lô hội, lá xoài) và tăng dần theo nồng độ. - Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè kháng được cả 5 chủng vi khuẩn Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và Salmonella typhi dù ở nồng độ rất thấp (100 – 800 mg/ml). - Sau khi mẫu chiết được đo bằng HPLC ta nhận thấy dịch chiết lẫn tạp chất không đáng kể, vì vậy chúng ta nên tách Polyphenol trong chế phẩm ở dạng tinh khiết để ứng dụng nó trong một số lĩnh vực nhằm đạt được giá trị cao về mặt kinh tế. - Xây dựng được quy trình điều chế Kem dưỡng da từ Cao polyphenol (quy mô phòng thí nghiệm). 5. Thời gian nghiên cứu: Từ 12/03/2018 đến 12/06/2019. 6. Chữ ký của CNĐT:. MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT .................................................................................................... i DANH MỤC BẢNG ........................................................................................................... ii DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................... iii DANH MỤC SƠ ĐỒ ......................................................................................................... iv MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................. 5 1.1. Giới thiệu chung về cây chè ..................................................................................... 5 1.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố của cây chè ................................................................ 5 1.1.2. Phân loại ............................................................................................................. 5 1.1.3. Tình hình sản xuất chè ở Việt Nam .................................................................... 6 1.1.4. Thành phần hóa học cơ bản của lá chè ............................................................... 6 1.1.5. Dược tính của chè ............................................................................................... 8 1.2. Polyphenol trong chè................................................................................................ 9 1.2.1. Nguồn gốc chuyển hóa và phân loại các hợp chất phenolic thực vật. ................ 9 1.2.2. Các hợp chất Polyphenol có trong chè ............................................................. 10 1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol/catechin trong lá chè ......... 16 1.2.4. Phương pháp định tính, định lượng polyphenol trong lá chè ........................... 17 1.2.5. Hoạt tính sinh học của polyphenol chè ............................................................. 22 1.3. Một số khái niệm về trích ly và các phương pháp trích ly polyphenol trong chè ................................................................................................................................... 24 1.3.1. Bản chất của quá trình trích ly .......................................................................... 24 1.3.2. Các phương pháp trích ly .................................................................................. 24 1.4. Ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất trích ly và chất lượng của sản phẩm ................................................................................................................. 28 1.4.1. Ảnh hưởng của dung môi và nồng độ dung môi ............................................. 28 1.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly ....................................................................... 30 1.4.3. Ảnh hưởng của thời gian trích ly ...................................................................... 30 1.4.4. Ảnh hưởng của pH ............................................................................................ 31 1.4.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu ..................................................... 31 1.4.6. Quy trình trích ly polyphenol từ chè xanh ........................................................ 32 1.5. Giới thiệu một số loài vi khuẩn và các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn .................................................................................................................. 33 1.5.1.Giới thiệu một số loài vi khuẩn ......................................................................... 33 1.5.2. Các phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn ........................................... 42 1.5. Phương pháp Sấy thăng hoa ................................................................................. 44 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM ............................................................................ 46 2.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu ................................................................................... 46 2.1.1. Nguyên liệu chè ................................................................................................ 46 2.1.2. Chủng vi sinh vật .............................................................................................. 46 2.1.3. Hóa chất, thiết bị ............................................................................................... 46 2.2. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin-Denis ........................ 47 2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol tổng số .................................... 47 2.2.2. Phương pháp xây dựng đường chuẩn axit gallic .............................................. 48 2.3. Khảo sát quy trình chiết tách polyphenol từ lá chè ............................................ 49 2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của các thông số công nghệ ............................................. 49 2.3.2. Một số quy trình khảo sát khác ......................................................................... 52 2.3.3. Khảo sát quy trình chiết tách polyphenol lá chè bằng dung môi có hỗ trợ enzym .......................................................................................................................... 52 2.3.4. Ảnh hưởng của độ ẩm và độ già của lá............................................................. 53 2.3.5. Quy trình tinh chế polyphenol từ cao chiết lá chè ............................................ 53 2.4. Định tính, định lượng polyphenol trong cao chiết lá chè ................................... 54 2.4.1. Định tính một số hợp chất hữu cơ có trong dịch chiết lá chè bằng thuốc thử .. 54 2.4.2. Định tính polyphenol bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) .................. 56 2.4.3. Định tính bằng UV-VIS .................................................................................... 56 2.4.4. Định tính và định lượng polyphenol bằng HPLC ............................................. 57 2.5. Xác định hoạt tính sinh học của dịch chiết chè ................................................... 57 2.5.1. Xác định hoạt tính kháng oxi hóa của dịch chiết chè ....................................... 57 2.5.2. Xác định hoạt tính kháng khuẩn ....................................................................... 58 2.6. Khảo sát các quy trình quy trình sấy ................................................................... 61 2.6.1. Sấy nhiệt độ cao ................................................................................................ 61 2.6.2. Sấy thăng hoa .................................................................................................... 61 2.7. Nghiên cứu ứng dụng cao lá chè trong sản phẩm kem dưỡng da ..................... 62 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................ 64 3.1. Kết quả tối ưu hóa điều kiện chiết tách polyphenol của lá chè ......................... 64 3.1.1. Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát các yếu tố công nghệ .... 64 3.1.2. Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát ảnh hưởng của enzym .. 65 3.1.3. Xây dựng phương trình đường chuẩn gallic khảo sát hoạt tính oxy hóa .......... 65 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất thu hồi polyphenol ...................................................................................................................... 66 3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng ............... 66 3.2.2. Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol tổng .............................. 67 3.2.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng . 68 3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng ............................... 69 3.2.5. Ảnh hưởng của PH đến hàm lượng polyphenol tổng ....................................... 70 3.3. Ảnh hưởng của độ ẩm và độ non già của lá tới hàm lượng polyphenol tổng trong cao chiết lá chè..................................................................................................... 71 3.4. Ảnh hưởng của một số quy trình chiết khác ....................................................... 72 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của enzym đối với hiệu quả chiết tách polyphenol ...................................................................................................................... 73 3.5.1. Ảnh hưởng của enzym cenlulozo đối với quá trình chiết tách polyphenol ...... 73 3.5.2. Ảnh hưởng của enzym pectinase đối với quá trình chiết tách polyphenol ....... 74 3.6. Ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol đến hàm lượng polyphenol tổng ................................................................................................................................. 75 3.7. Kết quả định tính, định lượng polyphenol trong lá chè ..................................... 76 3.7.1. Định tính các hợp chất trong lá chè bằng thuốc thử ......................................... 76 3.7.2. Định tính bằng TLC .......................................................................................... 77 3.7.3. Định tính bằng UV – VIS ................................................................................. 78 3.7.4. Định lượng polyphenol lá chè bằng HPLC ...................................................... 79 3.8. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của lá chè .................................................. 80 3.8.1. Kết quả hoạt tính oxy hóa ................................................................................. 80 3.8.2. Hoạt tính kháng khuẩn ...................................................................................... 82 3.9. Kết quả khảo sát quy trình lưu mẫu và sấy cao chiết lá chè .............................. 85 3.9.2. Ảnh hưởng của sấy ở nhiệt độ cao tới hàm lượng polyphenol tổng trong cao chiết lá chè .................................................................................................................. 86 3.9.3. Sấy thăng hoa cao chiết lá chè ...................................................................... 87 3.10. Ứng dụng sản phẩm kem dưỡng da ................................................................... 89 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................ 92 4.1. Kết luận ................................................................................................................... 92 4.2. Kiến nghị ................................................................................................................. 93 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 94 i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT C Catechin CG Catechingallate CK Chất Khô DPPH 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl EC Epicatechin ECG Epicatechingallate EGC Epigallocatechin EGCG Epigallocatechingallate GC Gallocatechin GCG Gallocatechingallate HPLC Sắc ký lỏng hiệu năng cao MIC Minimum inhibitory concentration TLC Sắc ký lớp mỏng UV Vùng tử ngoại VIS Khả kiến ii DANH MỤC BẢNG Bảng 1. 1: Sự hấp thụ của dung dịch theo màu ............................................................. 21 Bảng 3. 1: Phương trình đường chuẩn axit gallic .......................................................... 64 Bảng 3. 2: Phương trình đường chuẩn axit gallic .......................................................... 65 Bảng 3. 3: Phương trình đường chuẩn axit gallic .......................................................... 65 Bảng 3. 4: Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng .......... 66 Bảng 3. 5: Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol tổng ......................... 67 Bảng 3. 6: Ảnh hưởng của tỷ lệ Nguyên liệu/Dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng ................................................................................................................................ 68 Bảng 3. 7: Ảnh hưởng của tỷ lệ nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol tổng .................. 69 Bảng 3. 8: Ảnh hưởng của PH đến hàm lượng polyphenol tổng .................................. 70 Bảng 3. 9: Khảo sát Ảnh hưởng của độ ẩm và độ non già của lá .................................. 71 Bảng 3. 10: Khảo sát một số quy trình chiết khác ......................................................... 72 Bảng 3. 11: Khảo sát Ảnh hưởng của enzym cenlulozo đối với quá trình chiết tách polyphenol ..................................................................................................................... 73 Bảng 3. 12: Khảo sát Ảnh hưởng của enzym pectinase đối với quá trình chiết tách polyphenol ..................................................................................................................... 74 Bảng 3. 13: Khảo sát Ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol ........................... 76 Bảng 3. 14: Kết quả khảo sát định tính các nhóm chất ................................................. 77 Bảng 3. 15: Biểu đồ ảnh hưởng của quá trình tinh chế polyphenol .............................. 78 Bảng 3. 16: Kết quả đo bước sóng của dịch chè sau khi tinh chế ................................. 78 Bảng 3. 17: Hàm lượng các chất trong polyphenol ....................................................... 79 Bảng 3. 18: Kết quả sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ................................................. 80 Bảng 3. 19: Độ hấp thụ quang của cao các loại lá ở cùng nồng độ ............................... 81 Bảng 3. 20: Kết quả lực kháng oxy hoá theo nồng độ .................................................. 81 Bảng 3. 21: Hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết lá chè ............................................... 83 Bảng 3. 22: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol ................................. 86 Bảng 3. 23: Chỉ tiêu đánh giá cảm quan kem dưỡng da ................................................ 90 iii DANH MỤC HÌNH Hình 1. 1: Lá chè tại Xã Suối Nghệ, Tân Thành, tỉnh BR-VT ........................................ 5 Hình 1. 2: Công thức cấu tạo của catechin .................................................................... 11 Hình 1. 3: Công thức cấu tạo của (-)-EGCG ................................................................. 11 Hình 1. 4: Công thức cấu tạo của ECG ......................................................................... 13 Hình 1. 5: Công thức cấu tạo của C(A) và EC(B) ......................................................... 13 Hình 1. 6: Công thức cấu tạo của Anthoxanthin ........................................................... 14 Hình 1. 7: Công thức cấu tạo hợp chất Leucoanthocyanin ........................................... 16 Hình 1. 9: Vi khuẩn Escherichia coli dưới kính hiển vi ............................................... 34 Hình 1. 10: Vi khuẩn Bacillus cereus dưới kính hiển vi ............................................... 35 Hình 1. 11: Vi khuẩn Salmonella dưới kính hiển vi ...................................................... 37 Hình 1. 12: Vi khuẩn Staphylococcus aureus dưới kính hiển vi ................................... 38 Hình 1. 13: Vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa dưới kính hiển vi .............................. 41 Hình 2. 1: Lá chè sau khi xử lý ..................................................................................... 50 Hình 2. 2: Thiết bị chiết tách ......................................................................................... 51 Hình 2. 3: Mẫu đo UV - VIS ......................................................................................... 51 Hình 2. 4: Hệ thống cô quay chân không ...................................................................... 51 Hình 2. 5: Mẫu chè được ủ với enzyme ........................................................................ 53 Hình 2. 6: Thiết bị phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao ............................................... 57 Hình 2. 7: Mẫu chè thử hoạt tính oxy hoá ..................................................................... 58 Hình 2. 8: Cao chè thử hoạt tính kháng khuẩn .............................................................. 59 Hình 2. 9: Tủ sấy nhiệt độ cao ....................................................................................... 61 Hình 2. 10: Thiết bị sấy thăng hoa ................................................................................ 62 Hình 3. 1: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic ............................................. 64 Hình 3. 2: Đường chuẩn axit gallic ............................................................................... 64 Hình 3. 3: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic ............................................. 65 Hình 3. 4: Biểu đồ phương trình đường chuẩn axit gallic ............................................. 66 Hình 3. 5: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ tới hàm lượng polyphenol tổng .............