Đề tài Nghiên cứu quan hệ di truyền của một số giống đậu xanh địa phương [Vigna radiata (L.) Wilczek]

Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 1 MỞ ðẦU I. LÝ DO CHỌN ðỀ TÀI ðậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek] là một trong ba cây ñậu ñỗ chính trong nhóm các cây ñậu ăn hạt, ñứng sau ñậu tương và lạc. Ngoài ra, nó còn là một trong những mặt hàng xuất khẩu. ðậu xanh cũng chính là cây trồng có vị trí quan trọng trong nền nông nghiệp của nhiều nước, trong ñó có Việt Nam. Trồng ñậu xanh không những cung cấp nguồn thực phẩm giàu ñạm, ñáp ứng nhu cầu về dinh dưỡng của con người và vật nuôi, mà còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng ñất do rễ của cây ñậu xanh có các nốt sần chứa một số loài vi sinh vật cố ñịnh ñạm sống cộng sinh. Vấn ñề ñặt ra là cần nghiên cứu chọn tạo các giống ñậu xanh có chất lượng tốt, phục vụ nhu cầu trong nước cũng như xuất khẩu. Hiện nay, việc nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng nói chung và ñậu xanh nói riêng nhờ chỉ thị phân tử ñã và ñang ñược áp dụng rộng rãi. Các nhà khoa học ñã sử dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử như RAPD, AFLP, RFLP, SSR…ñể xác ñịnh quan hệ di truyền của cây trồng nhằm tạo cơ sở khoa học cho công tác chọn tạo giống cây trồng. Trên thế giới, kỹ thuật RAPD ñã ñược nhiều tác giả sử dụng ñể nghiên cứu quan hệ di truyền của một số giống ñậu xanh như: Afzal và ñtg (2004), Betal và ñtg (2004), Lakhanpaul và ñtg (2000)... [25], [27], [37]. Ở Việt Nam, kỹ thuật RAPD cũng ñã ñược các tác giả Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, ðiêu Thị Mai Hoa sử dụng ñể xác ñịnh quan hệ di truyền của các giống ñậu xanh ñột biến, các giống ñậu xanh chịu hạn, các giống chín tập trung và không tập trung ở ñậu xanh [4], [16], [21]. Nhằm tạo cơ sở cho việc lựa chọn giống ñậu xanh có chất lượng tốt Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 2 phục vụ công tác lai tạo giống, chúng tôi lựa chọn và tiến hành nghiên cứu ñề tài: “Nghiên cứu quan hệ di truyền của một số giống ñậu xanh ñịa phương [Vigna radiata (L.) Wilczek ]”. 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 14 giống ñậu xanh. 3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Tách chiết DNA tổng số của 14 giống ñậu xanh. - Sử dụng kỹ thuật RAPD ñể xác ñịnh quan hệ di truyền của các giống ñậu xanh nghiên cứu. - Sử dụng phần mềm NTSYSpc version 2.0 ñể xử lý số liệu. Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. CÂY ðẬU XANH 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây ñậu xanh Cây ñậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczeck) thuộc ngành Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ Fabales, họ Fabaceae, chi Vigna. Chi Vigna là một trong những chi lớn trong họ ðậu, bao gồm 7 chi phụ: Vigna, Haydonia, Plactropic, Macrhyncha, Ceratotropic, Lasiospron, Sigmaidotrotopis. ðậu xanh theo quan ñiểm lấy hạt của nhân dân ta bao gồm các loài thuộc hai chi phụ là Ceratotropic, còn ñược gọi là nhóm ñậu châu Á, bao gồm 16 loài hoang dại và 5 loài trồng trọt là V. radiata, V. mungo, V. aconitifolia, V. angularis, V. umbellata [6], [14]. ðậu xanh có bộ NST 2n = 22, là loại cây ăn hạt, thân thảo. Theo Vavilov, ñậu xanh có nguồn gốc từ Ấn ðộ, ñược phân bố rộng rãi ở các nước ðông và Nam Á, khu vực ðông Dương. Dạng dại của V. radiata cũng ñược tìm thấy ở Madagasca, bên bờ Ấn ðộ Dương, ðông Phi [16]. 1.1.2. ðặc ñiểm nông sinh học của cây ñậu xanh ðậu xanh là loại cây trồng cạn thu quả và hạt, bao gồm các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt. Rễ ñậu xanh thuộc loại rễ cọc, bao gồm rễ cái và rễ con. Rễ cái sâu khoảng 20 - 30 cm, có khi sâu tới 70 - 100 cm [6]. Rễ phụ thường gồm 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm. Trên rễ phụ có nhiều lông hút do biểu bì rễ biến ñổi thành, có vai trò tăng cường sức hút nước và các chất dinh dưỡng cho cây. ðặc biệt, do rễ ñậu xanh có khả năng sống cộng sinh với vi khuẩn cố ñịnh ñạm Rhizobium nên từ các kẽ nhánh rễ, nhất là ở sát rễ cái hình thành những nốt sần. Các nốt sần có khả năng cố ñịnh nitơ, thường có kích thước Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 4 4 - 5 mm, có màu ñỏ, hồng hay nâu. Nốt sần bé hơn, dạng que, ruột màu xanh hoặc ñen. Tuy nhiên, bộ rễ của cây ñậu xanh yếu hơn nhiều so với các cây ñậu ñỗ khác nên khi gặp úng dễ bị thối [14], [16], [22]. Thân ñậu xanh thuộc loại thân thảo, mọc thẳng ñứng hoặc hơi nghiêng, thân yếu có lớp lông mịn màu nâu sáng, chiều cao trung bình từ 40 - 70 cm, ñường kính trung bình từ 8 - 12 mm. Thân cây gồm 7 - 8 ñốt. Thân phân cành muộn và trung bình có từ 2 - 5 cành, một số giống có tới 9, 10 cành tùy giống và ñiều kiện chăm sóc [14]. Lá thuộc lá kép, mọc cách, lá chét có 3 thùy với các hình dạng như hình ôvan, thuôn dài, lưỡi mác, chẻ thùy. Trên thân chính của cây có 7 - 8 lá, cả 2 mặt trên và dưới của lá ñều có lông bao phủ. Số lượng lá, kích thước và hình dạng lá có thể thay ñổi tùy giống, ñất trồng và thời vụ. Diện tích của các lá tăng từ các lá phía dưới lên các lá giữa thân rồi giảm dần lên các lá phía ngọn. Chỉ số diện tích lá (m2 lá/m2 ñất) có ảnh hưởng lớn ñến hiệu suất quang hợp và năng suất thu hoạch [10], [22]. Hoa ñậu xanh ñược hình thành trên các trục hoa. Mỗi trục hoa có thể phát triển thành 2 hàng hoa mọc ñối nhau, các hoa trên hàng xếp liên tục với nhau tạo cho trục hoa có hình dạng co rút. Hoa ñậu xanh là hoa lưỡng tính, mọc thành chùm trên trục hoa. ðậu xanh là loại cây sinh trưởng vô hạn, hoa có màu tím hoặc vàng nhạt với công thức hoa là K5C5A10G1. ðậu xanh là loài thực vật tự thụ phấn cao, tỷ lệ hoa thành quả chỉ từ 10 - 25 %. Thụ tinh xong, tràng hoa rụng, quả hình thành và phát triển [14]. Quả ñậu xanh thuộc loại quả giáp, hình trụ, dạng tròn, hơi dẹt, dài từ 8 - 10 cm, ñường kính từ 4 - 6 mm, có 2 gân nổi rõ dọc theo 2 bên cạnh quả. Quả chín có màu vàng, nâu hoặc màu ñen. Cũng như các bộ phận khác ở cây ñậu xanh, trên vỏ quả ñậu xanh thường bao phủ một lớp lông dài khoảng 0,3 - 0,4 mm. Những giống thuộc nhóm kháng virus gây bệnh khảm vàng và Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 5 sâu ñục quả thì mật ñộ lông khá dày, màu trắng. Mỗi cây có từ 8 - 35 quả, mỗi quả có từ 8 - 15 hạt [16], [22]. Hạt ñậu xanh có hình trụ, thuôn, tròn ñều, có màu xanh bóng, xanh xám, vàng, xanh mốc, hoặc ñen xám… nằm ngăn cách nhau bằng những vách xốp của quả. Khối lượng hạt ñược biểu thị bằng g/1000 hạt và khối lượng nghìn hạt có thể dao ñộng từ 25 - 70 g. Số hạt trên quả và khối lượng hạt có tương quan thuận với năng suất. ðậu xanh là cây trồng ngắn ngày, trồng vào mùa ấm áp, nhiệt ñộ tối ưu cho cây sinh trưởng và phát triển từ 20 - 300C [11], [16]. 1.1.3. Tầm quan trọng của cây ñậu xanh Cây ñậu xanh là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao. Hạt ñậu xanh là nguồn thực phẩm giàu ñạm (khoảng 24 - 28%), ngoài ra, còn có lipid khoảng 1,3%, glucid 60,2% và các chất khoáng như Ca, Fe, Na, K, P… cùng nhiều loại vitamin hoà tan trong nước như vitamin B1, B2, C,… Protein ñậu xanh chứa ñầy ñủ các amino acid không thay thế như leucine, isoleucine, lysine, methyonine, valine…. Hạt ñậu xanh không chỉ phù hợp với nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn là mặt hàng xuất khẩu có giá trị. Hạt ñậu xanh ñược dùng ñể chế biến ra nhiều loại thực phẩm ngon, bổ, hấp dẫn như các loại bột dinh dưỡng, các loại bánh, chè, xôi ñỗ và một số ñồ uống…. Lá non và ngọn của cây ñậu xanh có thể ñược dùng ñể làm rau, muối dưa. Thân, lá xanh có thể dùng làm thức ăn cho vật nuôi [14], [22]. Ngoài ra, ñậu xanh còn có giá trị trong y học. Theo sách “Nam dược thần hiệu” của danh y Tuệ Tĩnh và “Bản thảo cương mục” của Lý Thờ Trân thì vỏ hạt ñậu xanh có vị ngọt, tính mát, không ñộc nên có tác dụng giải nhiệt, giải bách ñộc [15]. Cây ñậu xanh có thời gian sinh trưởng ngắn, khả năng sinh trưởng mạnh, mỗi chu kỳ sinh trưởng kéo dài từ 60 - 90 ngày. Mặt khác, yêu cầu kỹ thuật canh tác ñơn giản, vốn ñầu tư ít, thu hồi nhanh, có thể trồng nhiều vụ trong Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 6 một năm. Do ñó, cây ñậu xanh có thể ñược trồng xen, trồng gối, luân canh trên nhiều loại ñất canh tác khác nhau [22]. Trồng cây ñậu xanh còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng ñất. Nhờ hệ rễ ñậu xanh có các nốt sần chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi Rhizobium có khả năng cố ñịnh nitơ từ khí trời, cung cấp một phần ñạm cho cây và ñể lại lượng ñạm ñáng kể trong ñất sau khi thu hoạch. Vì vậy, ñất sau khi trồng ñậu xanh sẽ trở nên tơi xốp và giàu dinh dưỡng hơn [22]. 1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT ðẬU XANH 1.2.1. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống ñậu xanh Ngay từ khi con người biết trồng trọt thì các phương pháp chọn lọc khác nhau ñã ñược ứng dụng nhằm tạo ra những cây trồng theo ý muốn. Ngày nay, với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ñặc biệt trong lĩnh vực công nghệ sinh học, chọn giống cây trồng bằng phương pháp sinh học phân tử ñã ñem lại những kết quả ñáng tin cậy và thay thế dần cho phương pháp chọn giống cổ truyền. Phương pháp chọn tạo giống cây trồng nhờ chỉ thị phân tử ñã ñược áp dụng bởi nó có ưu ñiểm là nhanh chóng ñánh giá ñược bộ gen của các giống cây trồng với ñộ chính xác cao. Một hướng nghiên cứu ứng dụng sinh học phân tử trong chọn tạo giống ñậu xanh là việc xây dựng bản ñồ di truyền phân tử. Gần ñây, nhiều bản ñồ di truyền phân tử ñã ñược công bố bao gồm các chỉ thị phân tử RFLP, RAPD và một số chỉ thị khác [16]. Hiện nay, công tác chọn tạo giống ñậu xanh trên thế giới ñược tiến hành theo một số hướng chính: tạo giống cho năng suất cao, tạo giống nâng cao chất lượng [6], tạo giống có khả năng chống chịu tốt, tạo giống có khả năng kháng sâu, bệnh hại [28], [34]. Cùng với việc áp dụng sinh học phân tử vào nghiên cứu ñậu xanh của các nước trên thế giới, ở Việt Nam bước ñầu cũng có nhiều ứng dụng và ñã thu ñược những kết quả khá quan trọng. Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 7 Từ sau cách mạng tháng 8 - 1945, chúng ta ñã xây dựng ñược nhiều trạm nghiên cứu thí nghiệm về ñậu ñỗ nói chung và về ñậu xanh nói riêng ở nhiều nơi khác nhau như ở ðịnh Tường (Thanh Hoá), Mai Nham (Vĩnh Phúc), Pú Nhung (Lai Châu), Thất Khê (Cao Bằng) và ñã tiến hành thu thập, chọn tạo ra nhiều giống mới với các ñặc tính ưu việt hơn trước. Từ những năm 1980 ñến nay, nước ta có thêm nhiều cơ sở nghiên cứu về ñậu xanh như: Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Viện cây lương thực thực phẩm, các trường ðại học Nông nghiệp, ðại học Khoa học Tự nhiên cùng nhiều cơ sở nghiên cứu khoa học khác. Các trung tâm này ñã tập trung và ñi sâu vào hai hướng nghiên cứu cơ bản trong sản xuất ñậu ñỗ nói chung và ñậu xanh nói riêng là: - Chọn tạo giống thích hợp cho từng vùng sinh thái, từng mùa vụ khác nhau, giống có năng suất cao, phẩm chất tốt, có khả năng chống chịu ñiều kiện ngoại cảnh bất lợi, ñặc biệt là các giống có giá trị thương mại cao [17]. - ðưa cây ñậu xanh vào hệ thống trồng trọt nhằm cải tiến hệ thống trồng ñộc canh hoá ở các vùng và cải tạo các vùng ñất bị thoái hoá [17]. Trong tương lai, với sự phát triển ngày càng mạnh của khoa học kỹ thuật, các loại cây trồng nói chung và cây ñậu xanh nói riêng sẽ còn ñược nghiên cứu kỹ hơn, sâu hơn ñể có thể ñáp ứng ñược nhu cầu sử dụng ñậu xanh ngày càng lớn của con người. 1.2.2. Tình hình sản xuất ñậu xanh Trên thế giới, tình hình sản xuất ñậu xanh ngày một tăng. ðặc biệt, trong những năm gần ñây, do nhu cầu của con người về dinh dưỡng protein thực vật tăng nhanh ñã làm thúc ñẩy việc sản xuất ñậu xanh trên thế giới phát triển mạnh. Bangladesh, Ấn ðộ, Pakistan, Philipin, Srilanca, ðài Loan, Thái Lan ñược coi là các trọng ñiểm về diện tích, năng suất và sản lượng, là những cường quốc về ñậu xanh trên thế giới [14]. Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 8 Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau quả châu Á ñã có một bộ sưu tập giống ñậu xanh với khoảng 6000 mẫu giống, trong ñó có những giống cho năng suất cao từ 18 - 25 tạ/ha. Gần ñây, một số nước láng giềng của Việt Nam như Thái Lan, Philipin, Trung Quốc,… ñã chọn ra ñược những giống ñậu xanh cho năng suất từ 10 - 12 tạ/ha trở lên, hạt to, màu hạt ñẹp, thời gian sinh trưởng ngắn, chín tập trung, có sức chống chịu tốt với các ñiều kiện cực ñoan của môi trường [14], [24]. Tính ñến năm 2001, Ấn ðộ là nước ñứng ñầu thế giới trong việc sản xuất ñậu xanh với diện tích gần 2887000 ha (chiếm trên 70% diện tích ñậu xanh toàn cầu), sản lượng ñạt trên 1 triệu tấn, tiếp theo là Trung Quốc (diện tích 772000 ha, sản lượng 0,891 triệu tấn). Trung Quốc là nước có năng suất sản xuất ñậu xanh cao nhất, ñạt 1,15 tấn/ha. Thái Lan là nước ñứng ñầu thế giới về xuất khẩu ñậu xanh, chiếm khoảng 40% sản lượng ñậu xanh xuất khẩu trên thế giới. Những nước nhập nhiều ñậu xanh là Nhật Bản (80 tấn/năm), Hoa Kỳ (50 tấn/năm) (Nguồn : FAOSTAT 2002) [24]. Ở Việt Nam, cây ñậu xanh cũng ñược trồng từ lâu ñời ở các vùng ñồng bằng, trung du và miền núi trên khắp cả nước. Tuy nhiên, nó vẫn chỉ ñược xem như một loại cây trồng phụ nhằm tận dụng ñất ñai, lao ñộng dư thừa,… Vì thế, năng suất sản xuất ñậu xanh còn chưa cao. Từ năm 1991 - 1995 năng suất sản xuất ñậu xanh ñạt từ 5,5 tạ/ha ñến 12 tạ/ha. Từ năm 1996 - 2000 năng suất dao ñộng trong khoảng 15 - 20 tạ/ha. ðến năm 2000, Việt Nam có diện tích và sản lượng ñậu xanh ñứng thứ 6 trên thế giới [7], [8], [9], [10], [11]. 1.3. NGHIÊN CỨU QUAN HỆ DI TRUYỀN Ở ðẬU XANH 1.3.1. Một số phương pháp sinh học phân tử trong phân tích quan hệ di truyền ở thực vật 1.3.1.1. Kỹ thuật RAPD Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - ña hình các ñoạn DNA ñược khuếch ñại ngẫu nhiên) do William phát minh năm 1990, Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 9 Welsh và cộng sự hoàn thiện năm 1991. Kỹ thuật này cho phép phát hiện tính ña hình các ñoạn DNA ñược nhân bản ngẫu nhiên bằng việc sử dụng mồi ñơn chứa trật tự nucleotide ngẫu nhiên [19]. ðến nay, kỹ thuật này ñã và ñang ñược ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của sinh học phân tử. Người ta ñã sử dụng kỹ thuật này ñể thiết lập bản ñồ di truyền, ñánh giá hệ gen của giống và sự ña dạng di truyền của tập ñoàn giống [27], [53]. * Nguyên lý Kỹ thuật RAPD có cơ sở là kỹ thuật PCR, nhưng sử dụng mồi ngẫu nhiên ñể nhân bản những ñoạn DNA hoàn toàn ngẫu nhiên trong hệ gen. * Thành phần phản ứng Cũng tương tự phản ứng PCR, các yếu tố cần thiết ñể tiến hành phản ứng RAPD bao gồm: - DNA khuôn (DNA template) với nồng ñộ 5 - 50 ng trong 20 - 25 µl. DNA khuôn là vật liệu khởi ñầu cho phản ứng RAPD, ñược tách từ các mẫu: virus, vi khuẩn, tế bào thực vật, ñộng vật…. DNA có ñộ tinh sạch, có thể là sợi ñơn, sợi ñôi, mạch vòng hoặc mạch thẳng. DNA khuôn ñược khuếch ñại dưới dạng thẳng có hiệu quả hơn dạng vòng. Kích thước DNA khuôn nhỏ hơn 3 kb cho kết quả tốt nhất [5]. - ðoạn mồi (primer): chỉ sử dụng một mồi ñó là một oligonucleotide có trật tự nucleotide ngẫu nhiên và có chiều dài 8 - 10 nucleotide (thường sử dụng mồi dài 10 nucleotide). Nhiệt ñộ gắn mồi trong phản ứng RAPD thấp (320 - 400C). Nồng ñộ mồi phải thích hợp ñể ñảm bảo kết quả phản ứng (phù hợp với lượng DNA cần tổng hợp) tạo nên lượng sản phẩm cần thiết. Nếu nồng ñộ mồi quá cao có thể làm cho hiệu quả phản ứng kém chính xác, do mồi bám vào các vị trí không ñặc hiệu. Nếu nồng ñộ mồi quá thấp sẽ không ñảm bảo ñủ lượng sản phẩm RAPD. Nồng ñộ mồi thích hợp ñể Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 10 tiến hành phản ứng thường là 0,1- 0,5 µM. Mồi ñược thiết kế ñảm bảo các yêu cầu sau: + Trình tự mồi phải có tính ñặc hiệu cao, bắt cặp tuyệt ñối với ñầu mạch khuôn, không có cấu trúc “kẹp tóc”, giàu G và C (chiếm 60%). + Nhiệt ñộ gắn mồi thấp hơn nhiệt ñộ nóng chảy (Tm) của mồi từ 10 - 20C [1], [2], [19]. - Taq-polymerase: là một enzyme quan trọng, có vai trò quyết ñịnh ñến phản ứng PCR. ðây là loại enzyme chịu ñược nhiệt ñộ cao trong các loại enzyme. ðặc ñiểm của chúng là có khả năng kéo dài mồi ñể tạo một sản phẩm có chiều dài 8 - 13 kb. Taq-polymerase ñược tách chiết từ chủng vi khuẩn ở suối nước nóng Thermus aquaticus, không bị mất hoạt tính ở nhiệt ñộ biến tính DNA (92o - 950C). Taq - polymerase có hoạt tính ở dải nhiệt ñộ cao, tồn tại ở nhiệt ñộ ủ 950C kéo dài. Enzyme này có hoạt tính cao ở 720 - 800C làm cho phản ứng xảy ra nhanh, hiệu quả và chính xác [1], [19]. - dNTP: là các nucleotide tự do ñược sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng RAPD, gồm bốn loại: dATP, dTTP, dGTP, dCTP. Nồng ñộ dNTP mỗi loại thường dùng trong các phản ứng RAPD khoảng 50 - 200 µM. Nếu nồng ñộ các loại dNTP quá ít thì tạo sản phẩm ít không ñủ ñể phát hiện, ngược lại, nồng ñộ dNTP quá cao thì phản ứng khó thực hiện [1], [19]. - Dung dịch ñệm: là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng ñến chất lượng và hiệu quả của phản ứng. Dung dịch ñệm của phản ứng phải ñảm bảo thành phần các chất cần thiết cho hoạt ñộng của enzyme như: MgCl2, KCl, Tris HCl... Thành phần của dung dịch ñệm của phản ứng bao gồm: Tris HCl 10mM (pH = 8.3 ở nhiệt ñộ phòng) KCl 50mM MgCl2 1,5mM khi ủ ở nhiệt ñộ phòng. Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 11 Nồng ñộ MgCl2 có thể dao ñộng từ 0,5 - 5mM. Thành phần này ñóng vai trò quan trọng ñến khả năng bắt cặp và gắn các mồi với mạch khuôn [1], [5], [19]. * Chu kỳ phản ứng Phản ứng RAPD ñược tiến hành qua các giai ñoạn sau: - Giai ñoạn biến tính DNA: Ở nhiệt ñộ 950C trong 30 - 60 giây làm cho các liên kết hydro giữa 2 mạch bị ñứt. Khi ñó DNA sợi ñôi tách thành 2 sợi ñơn tạo ñiều kiện cho sự bắt cặp mồi. - Giai ñoạn tiếp hợp mồi: Nhiệt ñộ hạ xuống 320 - 400C, mồi bám vào ñầu 3’OH của mạch khuôn DNA và bắt ñầu quá trình tổng hợp sợi mới. - Giai ñoạn tổng hợp: Nhiệt ñộ ñược nâng lên 720C thì các ñoạn mồi ñã bắt cặp với các mạch ñơn sẽ ñược kéo dài với sự tham gia của Taq - polymerase. Một chu kỳ trên xảy ra, 1 ñoạn DNA ñược nhân lên thành 2, các ñoạn DNA ñược nhân tiếp tục ñược coi là mạch khuôn ñể tổng hợp cho chu kì sau. Vậy, sau n chu kỳ thì sẽ tạo ra 2n các ñoạn DNA giống hệt ñoạn DNA khuôn ban ñầu. Phản ứng RAPD có thể thực hiện 40 - 45 chu kỳ. 1.3.1.2. Kỹ thuật RFLP RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism - ña hình ñộ dài các ñoạn cắt giới hạn) là kỹ thuật sử dụng các endonuclease giới hạn cắt DNA hệ gen ở trình tự nhận biết ñặc trưng tạo ra hàng loạt ñoạn DNA có ñộ dài xác ñịnh, số lượng các ñoạn phụ thuộc vào số ñiểm nhận biết trong hệ gen. Sử dụng kỹ thuật RFLP có thể xác ñịnh một tính trạng ở trạng thái ñồng hợp hoặc dị hợp trong một cá thể. Vì vậy, RFLP là một chỉ thị tin cậy trong phân tích liên kết và chọn giống. Tuy nhiên, kỹ thuật này có nhược ñiểm là tốn kém và mất thời gian. Kỹ thuật này ñòi hỏi phải có một lượng DNA lớn (50 - 200 ng từ mỗi cá thể) [13]. Bằng kỹ thuật RFLP, Young và ñtg (1992) ñã thành công Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn Tài liệu chia sẻ tại: wWw.SinhHoc.edu.vn 12 trong việc lập bản ñồ kháng mọt ở ñậu xanh [54]. Với kỹ thuật RFLP và RAPD, Lambrides C. J. và ñtg ñã lập ñược bản ñồ gen của ñậu xanh [38]. 1.3.1.3. Kỹ thuật AFLP AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - ña hình ñộ dài các ñoạn ñược nhân bản chọn lọc) là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR. Kỹ thuật này cho phép phát hiện một cách có chọn lọc các ñoạn DNA hệ gen ñã ñược cắt bởi enzyme giới hạn và gắn với ñoạn tiếp hợp. Về nguyên tắc, kỹ thuật AFLP tương tự như kỹ thuật RAPD, chỉ có ñiểm khác biệt là mồi trong phản ứng AFLP gồm hai phần: phần cố ñịnh dài khoảng 15 bp chứa vị trí nhận biết của enzyme giới hạn, phần thay ñổi dài khoảng 2 - 4 bp. Sản phẩm