Đề tài Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CNSH TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ĐẾN NĂM 2020 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi” Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghệ sinh học Chủ nhiệm đề tài: PGS. TS. Quyền Đình Thi TS. Đỗ Thị Tuyên 8727 Hà Nội - 2010 BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHƯƠNG TRÌNH TRỌNG ĐIỂM PHÁT TRIỂN VÀ ỨNG DỤNG CNSH TRONG LĨNH VỰC NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ĐẾN NĂM 2020 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI Đề tài: “Nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chế phẩm đa enzyme có chất lượng từ vi sinh vật tái tổ hợp nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng thức ăn chăn nuôi” Chủ nhiệm đề tài TS. Đỗ Thị Tuyên PGS. TS. Quyền Đình Thi Cơ quan chủ trì đề tài Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Hà Nội - 2010 MỤC LỤC 1 TỔNG QUAN....................................................................................................................1 1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới.............................................................................2 1.1.1 Cải thiện chất lượng và hiệu quả sử dụng enzyme ................................................3 1.1.2 Tìm các nguồn enzyme mới...................................................................................5 1.1.3 Tạo ra các enzyme tái tổ hợp với năng suất cao chất lượng mới...........................6 1.1.4 Chuyển gene mã hóa enzyme vào thực vật............................................................8 1.2 Tình hình sản xuất enzyme bổ sung thức ăn gia súc trên thế giới ...........................10 1.3 Hiệu quả của đa enzyme so với đơn enzyme...........................................................11 1.4 Những khác biệt về trình độ KH&CN trong nước và thế giới.................................12 1.5 Tình hình nghiên cứu trong nước trong thời gian qua .............................................12 1.5.1 Tình hình nghiên cứu các enzyme tái tổ hợp .......................................................15 1.5.2 Tình hình nhập khẩu và liên doanh sản xuất........................................................15 1.5.3 Hiệu quả kinh tế của các enzyme bổ sung và mức độ an toàn.............................16 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...................................................................................16 2.1 Chủng vi sinh vật .....................................................................................................16 2.2 Nguyên liệu..............................................................................................................17 2.3 Môi trường nuôi cấy ................................................................................................17 2.4 Vector biểu hiện.......................................................................................................17 2.5 Hóa chất ...................................................................................................................18 2.6 Các bộ mồi ...............................................................................................................18 2.7 Xác định hoạt tính....................................................................................................19 2.7.1 Xác định hoạt tính glucanase ...............................................................................19 2.7.2 Xác định hoạt tính mannanase .............................................................................20 2.7.3 Xác định hoạt tính subtilisin ................................................................................21 2.7.4 Xác định hoạt tính xylanase.................................................................................21 2.8 Tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng tự nhiên sinh tổng hợp enzyme ...........................21 2.8.1 Sinh tổng hợp glucanase ......................................................................................21 2.8.2 Sinh tổng hợp mannanase và xylanase ................................................................22 2.8.3 Sinh tổng hợp subtilisin .......................................................................................22 2.8.4 Xác định ảnh hưởng của các yếu tố lên hoạt tính enzyme...................................23 2.9 Các phương pháp sinh học phân tử..........................................................................23 2.9.1 Phản ứng PCR......................................................................................................23 2.9.2 Thao tác cắt, gắn dính DNA và biến nạp hóa học ...............................................23 2.9.3 Biến nạp xung điện ..............................................................................................23 2.9.4 Tách chiết RNA ...................................................................................................23 2.9.5 Đọc trình tự DNA ................................................................................................24 2.9.6 Biểu hiện plasmid tái tổ hợp trong E. coli BL21 .................................................24 2.9.7 Biểu hiện plasmid tái tổ hợp trong Aspergillus ...................................................24 2.9.8 Biểu hiện trong Pichia pastoris ............................................................................24 2.9.9 Biểu hiện Xln tái tổ hợp.......................................................................................24 2.9.10 Tách chiết DNA tổng số từ Pichia pastoris......................................................24 2.9.11 Phương pháp tách DNA từ nấm sợi .................................................................25 2.9.12 PCR dung hợp hai đoạn ...................................................................................26 2.9.13 Biến nạp vào Bacillus subtilis WB800 ............................................................26 2.10 Phương pháp tách chiết protein ...............................................................................26 2.10.1 Tinh sạch protein tái tổ hợp .............................................................................26 2.10.2 Điện di SDS-PAGE..........................................................................................26 2.11 Các phương pháp sản xuất enzyme tái tổ hợp .........................................................27 2.11.1 Lên men sản xuất glucanase ............................................................................27 2.11.2 Lên men sản xuất mannanase ..........................................................................27 2.11.3 Lên men sản xuất subtilisin..............................................................................27 2.11.4 Lên men sản xuất xylanase ..............................................................................27 2.11.5 Tạo chế phẩm enzyme thô ...............................................................................27 2.12 Các phương pháp thử nghiệm chế phẩm..................................................................28 2.12.1 Xác định độ an toàn, độ độc cấp tính và bán trường diễn................................28 2.12.2 Đánh giá hiệu quả chế phẩm đơn enzyme .......................................................29 2.12.3 Đánh giá hiệu quả chế phẩm Vietzyme M.......................................................30 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................................................35 3.1 Nội dung 1. Đánh giá các chủng tự nhiên sinh tổng hợp các enzyme .....................35 3.1.1 Glucanase tự nhiên...............................................................................................35 3.1.2 Manananase tự nhiên ...........................................................................................40 3.1.3 Protease tự nhiên..................................................................................................48 3.1.4 Xylanase tự nhiên ................................................................................................50 3.2 Nội dung 2. Tạo các chủng vi sinh vật tái tổ hợp ....................................................62 3.2.1 Glucanase tái tổ hợp.............................................................................................62 3.2.2 Mannanase tái tổ hợp ...........................................................................................69 3.2.3 Subtilisin tái tổ hợp..............................................................................................74 3.2.4 Xylanase tái tổ hợp ..............................................................................................80 3.3 Nội dung 3. Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm enzyme ...............................94 3.3.1 Tạo nguyên liệu đầu vào ......................................................................................95 3.3.2 Quy trình công nghệ sản xuất subtilisin tái tổ hợp ..............................................96 3.3.3 Quy trình công nghệ sản xuất glucanase tái tổ hợp .............................................99 3.3.4 Quy trình công nghệ sản xuất mannanase tái tổ hợp .........................................102 3.3.5 Quy trình công nghệ sản xuất xylanase tái tổ hợp .............................................105 3.3.6 Quy trình sản xuất chế phẩm đa enzyme (Vietzyme M) ...................................109 3.4 Nội dung 4. Đánh giá chế phẩm đơn và đa enzyme ..............................................111 3.4.1 Đánh giá độ an toàn, độc tính cấp và bán trường diễn của chế phẩm................111 3.4.2 Hiệu quả của chế phẩm enzyme đơn trên gà Lương Phượng ............................113 3.4.3 Hiệu quả của chế phẩm đơn enzyme xylanase trên lợn con sau cai sữa............114 3.4.4 Hiệu quả của chế phẩm Vietzyme M trên gà Lương Phượng............................115 3.4.5 Thử nghiệm hiệu lực của chế phẩm đa enzyme lên sự sinh trưởng của lợn ở các lứa tuổi 8-50kg ...............................................................................................................117 KẾT LUẬN............................................................................................................................120 LỜI CÁM ƠN........................................................................................................................121 KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................................121 TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................................121 1 BÁO CÁO TỔNG HỢP 1 TỔNG QUAN Chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020 với mục tiêu xây dựng nền chăn nuôi an toàn sinh học, bền vững được đề ra trong bối cảnh ngành còn đối mặt với nhiều khó khăn. Nhiều ý kiến cho rằng, quy mô nhỏ lẻ, bất cập trong khâu giống, phát triển vùng nguyên liệu cho chế biến thức ăn... là “rào cản” khiến mục tiêu trên khó thành hiện thực. Những năm qua, ngành chăn nuôi luôn giữ mức tăng trưởng cao, bình quân giai đoạn 2001-2006 tăng 8,5%/năm. Giá trị sản xuất chăn nuôi năm 2006 tăng trưởng 7,3% so với năm 2005. Tuy nhiên, năm 2007 chỉ đạt 4,6%, tỷ trọng của ngành tăng 24,1% (giảm 1,4% so với năm 2006). Việt Nam là nước nông nghiệp nên các nguồn nguyên liệu từ phụ phế liệu của ngành công nghiệp chế biến nông sản rất lớn, nếu sử dụng được nguồn nguyên liệu này để sản xuất thức ăn chăn nuôi sẽ mang lại hiệu quả kinh tế và lợi thế hơn nhiều so với các nguyên liệu khác. Một trong những hạn chế lớn nhất của sử dụng nguyên liệu từ phụ phế liệu nông nghiệp để sản xuất thức ăn chăn nuôi là những nguyên liệu này có tỷ lệ xơ cao, chính vì nhiều xơ nên chúng có tỷ lệ tiêu hóa và giá trị năng lượng thấp. Thú có dạ dày đơn khó tiêu hóa chất này do không sản xuất đủ lượng enzyme nội sinh cần thiết. Không những thế, chất xơ còn bao bọc các chất dinh dưỡng, hạn chế khả năng tiêu hóa, hấp thu dưỡng chất. Trong môi trường ruột, chất xơ hòa tan gây tăng độ nhớt và giữ nước bao phủ các nhung mao ruột, làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thu dưỡng chất của ruột. Ở Việt Nam nhiều tác giả đã nghiên cứu về các enzyme bổ sung thức ăn gia súc, đặc biệt là enzyme từ các chủng vi sinh vật nhưng các kết quả nghiên cứu này vẫn còn nhiều hạn chế, cho nên việc áp dụng các sản phẩm enzyme trong nước trong ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi vẫn chưa được cơ sở sản xuất thức ăn quan tâm. Nguyên nhân chủ yếu là do năng suất sinh tổng hợp của các enzyme tự nhiên còn thấp, chất lượng các enzyme tự nhiên không được cải biến bằng các kỹ thuật công nghệ sinh học hiện đại và hầu hết các chế phẩm enzyme bổ sung cho thức ăn chăn nuôi đã được các nhóm nghiên cứu đều ở dạng đơn enzyme. Chính vì vậy, mục tiêu của đề tài này là tạo ra các chủng tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp các enzyme trên với năng suất, hoạt lực cao; và cuối cùng là xây dựng được các quy trình sản xuất các enzyme tái tổ hợp và nguyên thủy năng suất cao và cuối cùng là lên men tạo chế phẩm đa enzyme bổ sung thức ăn cho gia súc. Enzyme thức ăn thường được gọi là enzyme ngoại sinh để phân biệt với enzyme nội sinh là những enzyme sinh ra trong cơ thể. Enzyme thức ăn làm tăng tỷ lệ tiêu hóa thức ăn và năng suất động vật theo hai cơ chế: 1. Kết hợp với enzyme nội sinh, phân giải các hợp chất thành những chất có kích thước đủ nhỏ để động vật dễ hấp thu. Như vậy, việc lựa chọn enzyme thức ăn sao cho có tác dụng hỗ trợ enzyme nội sinh trong việc phân giải chất dinh dưỡng của thức ăn là rất cần thiết; 2. Enzyme thức ăn phải giảm được độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hóa thức ăn, vì chính độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hóa cản trở sự hấp thu thức ăn. Một vài hợp chất khi giải phóng khỏi vách tế bào đã hình thành các gel làm tăng độ nhớt trong ruột. Thường các khẩu phần chứa nhiều polysaccharide không phải tinh bột (non- starch polysaccharide, NSP) gây ra hiện tượng này. Động vật non, đặc biệt là gia cầm rất nhạy cảm với sự biến đổi độ nhớt sinh ra trong quá trình tiêu hóa. Để tăng cường hai cơ chế trên, enzyme thức ăn thường được sản xuất dưới dạng những chế phẩm đa enzyme để phân giải đồng thời nhiều hợp chất. Ví dụ: nếu dùng β-glucanase thì chỉ phá vỡ được vách nội nhũ của hạt đại mạch mà không phân giải được protein chứa trong tế bào chất, để phân giải được protein trong lớp tế bào chất này phải cần thêm cả cellulase và pentosanase. Ngoài ra, phải đặc biệt quan tâm tới mối quan hệ tương tác giữa enzyme với các nguyên liệu khác nhau trong khẩu phần. 2 Trong dinh dưỡng động vật dạ dày đơn, việc bổ sung các chế phẩm enzyme trong khẩu phần được ứng dụng khá rộng rãi. Tác dụng chính của chúng là cải thiện khả năng tiêu hóa, ngăn cản các tác hại của các chất kháng dinh dưỡng có trong khẩu phần, đồng thời giảm thiểu các chất dinh dưỡng dư thừa bài thải ra môi trường. Từ đó sẽ góp phần cải thiện năng xuất vật nuôi, nâng cao hiệu qủa kinh tế và giảm ô nhiễm môi trường (Wen, 1992; Thacker, 1993; Thacker and Baas, 1996). Trong các khẩu phần cho động vật dạ dày đơn, ngũ cốc thường chiếm tỷ lệ khá lớn, từ 50-65% mà trong thành phần của chúng chứa các nhóm non-starch polysaccharide (NSP) (ß-glucan; arabino-xylans; pentosans; triticale) là những hợp chất cơ thể động vật không tiêu hóa được. Ngoài ra chúng còn làm giảm khả năng tiêu hóa, hấp thu các chất dinh dưỡng khác do làm tăng độ nhớt của đường tiêu hóa (Campbell and Bedford, 1992; Friesen et al., 1992; Boros et al., 1995). Nhiều nghiên cứu đã chứng minh là bổ sung hỗn hợp các enzyme xylanase; cellulose; alpha-amilase; protease vào trong khẩu phần ngũ cốc có tác dụng đáng kể trong việc cải thiện tăng trọng, giảm chi phí thức ăn, nâng cao tỷ lệ tiêu hóa năng lượng, protein và acid amin trong khẩu phần so với không bổ sung (Gdala et al., 1997; Yin et al., 2000; Barrera et al., 2003). 1.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Nghiên cứu trên thế giới về các enzyme sử dụng bổ sung thức ăn chăn nuôi đã tiến được bước dài. Những enzyme sử dụng bổ sung thức ăn chăn nuôi đã được nhiều công ty hàng đầu trên thế giới sản xuất từ hai chục năm nay, đã được ứng dụng thường quy ở những nước công nghiệp phát triển như Mỹ, Tây/Đông Âu, Nhật Bản và Trung Quốc. Tuy nhiên những nghiên cứu về các enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi vẫn được tiếp tục theo một số hướng chính sau đây như Marquardt (Dept. of Animal Science, University of Manitoba, Winnpeg, Manitoba R3T 2N2, Canada) và Brufau (IRTA, Department of Animal Nutrition, Centre de Mas Bove, Apartat 41 5 Reus, Spain) nhận định trong bài tổng quan “Future of feed enzymes: Orientation and perspectives” đăng trên “CIHEAM - Options Mediterraneennes”. Sử dụng enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi đã có một tác động mạnh mẽ tới việc sử dụng các nguyên liệu thức ăn trong ngành chăn nuôi động vật, đặc biệt trong gia cầm và đặc biệt với thức ăn ngũ cốc như lúa mạch và lúa mỳ. Nghiên cứu và phát triển trong tương lai sẽ tiếp tục được ngành công nghiệp ủng hộ ở mức độ ngày càng tăng trong một lĩnh vực mở rộng. Theo Marquardt và Brufau, một số lĩnh vực tương lai cần tiếp tục nghiên cứu sẽ là: 1. Cải thiện chất lượng và hiệu quả của các enzyme hiện có trên thị trường theo hướng quan tâm tới giá thành, độ bền nhiệt, chống chịu thủy phân và nâng cao hoạt tính trong các bộ phận đích của bộ máy tiêu hóa ruột – dạ dày. 2. Mở rộng sử dụng enzyme trong thức ăn cho gia cầm, thú nuôi bản địa bao gồm các loại gia cầm khác gà, lợn, cá và thú ngoại như cá sấu, rùa, baba, ếch. 3. Mở rộng ra các loại enzyme khác như lipase, protease, amylase, cũng như được sử dụng bằng công nghiệp công nghệ sinh học. 4. Chọn lọc và thiết kế các nguồn lựa chọn khác về enzyme cải biến di truyền cho cơ chất và động vật đặc thù. Bao gồm các enzyme được sản xuất trong vi sinh vật, hạt thực vật và ngay bản thân trong động vật bằng công nghệ DNA tái tổ hợp. 5. Mở rộng phổ nguyên liệu làm thức ăn có thể được xử lý bằng enzyme. 6. Phát triển và chuẩn hóa các qui trình để đánh giá các chế phẩm enzyme khác nhau. 7. Tiếp tục nghiên cứu cách thức sao cho enzyme tạo ra được những tác dụng có lợi. 8. Phát triển các mô hình để tiên đoán đáp ứng đối với các enzyme trong mọi lớp động vật chăn nuôi và với mọi nguyên liệu làm thức ăn để tạo điều kiện dễ dàng cho các nghiên cứu về giá thành – lợi nhuận. 3 9. Nghiên cứu tác động của enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi làm giảm ô nhiễm môi trường, phân chia dinh dưỡng và thay đổi đáp ứng nội tiết tố và tình trạng sức khỏe của động vật. Rõ ràng nghiên cứu và sản xuất enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi sẽ không ngừng phát đạt, tăng tốc và thu được nhiều lợi nhuận. Lĩnh vực hấp dẫn của nghiên cứu sẽ tập trung vào nghiên cứu và phát triển dinh dưỡng động vật trong tương lai. Các hướng nghiên cứu (1-3) là những hướng nghiên cứu tương đối cổ điển: đánh giá tác dụng của các loại enzyme bổ sung thức ăn chăn nuôi thương mại hoặc các enzyme đang nghiên cứu trong phòng thí nghiệm lên năng suất chăn nuôi lợn, bò sữa, gà vịt, ngan ngỗng, gà tây hoặc lên năng suất thu trứng và vắt sữa và mở rộng sang tất cả các động vật chăn nuôi còn lại như cừu, dê, ngựa, cá, rùa và tất cả các loại động vật chăn nuôi khác. Các nghiên cứu này nhằm đánh giá từng enzyme đơn lẻ một hoặc đánh giá hiệu quả chăn nuôi khi bổ sung cùng một lúc nhiều enzyme khác nhau. Các nguồn lựa chọn khác về enzyme (4) bao gồm: (4.1): Tìm kiếm những các nguồn vi sinh vật mới tổng hợp ra các enzyme này, tối ưu nuôi cấy, lên men, sản xuất, tinh sạch và đánh giá tính chất hóa lý. Hai hướng nghiên cứu tuy có vẻ cổ