Đề tài Nghiên cứu tách chiết Enzyme Alginate lyase từ sinh vật có trong rong biển và bước đầu ứng dụng nó để thủy phân alginate

1 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................4 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VÀ ĐỒ THỊ ......................................5 MỞ ĐẦU ............................................................................................................5 1. Tính cấp thiết của đề tài .................................................................................7 2. Mục đích, nhiệm vụ và nội dung nghiên cứu của đề tài ................................8 3. Điểm mới và ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài .....................................8 Chương 1. TỔNG QUAN ...................................................................................9 1.1. Tổng quan về rong Nâu [1] .........................................................................9 1.2. Tổng quan về Alginate ..............................................................................11 1.2.1. Alginate[1][11] ....................................................................................... 11 1.2.2. Công thức cấu tạo của axit alginic và muối alginate [1],[11] ................ 12 1.2.2.1. Đặc điểm, cấu tạo của Alginic ............................................................12 1.2.2.2. Đặc điểm, cấu tạo của các keo Alginate. ............................................14 1.2.3. Tính chất của một số loại keo Alginate ................................................. 15 1.3 Một số nghiên cứu về alginate lyase .........................................................18 1.4. Những nghiên cứu về Oligo alginate (OA) ...............................................19 1.4.1. Những nghiên cứu trong nước ................................................................ 19 1.4.2. Những nghiên cứu ngoài nước ................................................................ 21 1.5. Tổng quan sơ lược về các phương pháp nghiên cứu .................................23 1.5.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật[6],[8] ................................................ 23 1.5.2. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật ............................................... 23 1.5.3. Phương pháp nghiên cứu hình thái vi sinh vật.[6] .................................. 24 1.5.4. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật sinh enzyme và thu nhận chế phẩm enzyme[3][4][5][7] ........................................................................................... 25 1.5.4.1. Phương pháp nuôi cấy .........................................................................25 1.5.4.2. Thu hồi chế phẩm enzyme ..................................................................26 Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................28 2.1. Nội dung nghiên cứu. ................................................................................28 2 2.2. Các phương pháp nghiên cứu[3][6][7][8].................................................29 2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm ..................................................................29 2.3.1. Bố trí nghiệm phân lập chủng vi khuẩn trong tự nhiên có khả năng sinh tổng hợp algL ................................................................................................... 29 2.3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp algL cao ..................................................................................................... 30 2.3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra tính thuần khiết của chủng vi sinh vật được lựa chọn ................................................................................................... 32 2.3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu dịch enzyme algL từ môi trường sinh khối . 33 2.3.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thử nghiệm phân cắt các loại Natri alginate khác nhau bằng dung dịch enzyme thu được ............................................................. 34 2.3.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hoạt độ enzyme ................................ 35 2.3.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của vi sinh vật và khả năng phân cắt của algL ............................... 36 2.3.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các hợp chất kim loại đến khả năng phân cắt của algL ...................................................................... 38 Sơ đồ 2.3.8: Ảnh hưởng của các hợp chất kim loại đến khả năng phân cắt của algL ... 38 2.3.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân cắt của algL ....................................................................................39 2.3.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tác nhân kết tủa thích hợp để thu hồi algL từ dịch enzyme ................................................................................................. 40 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...............................41 3.1. Kết quả nghiên cứu phân lập chủng vi sinh vật trong tự nhiên có khả năng sinh tổng hợp enzyme algL ..............................................................................41 3.2. Kết quả thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh algL cao 42 3.3. Kết quả thí nghiệm kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật đã chọn .....44 3.4. Kết quả thí nghiệm phân cắt các loại natri alginate bằng dung dịch enzyme thu được...............................................................................................45 3 3.5 Kết quả định danh vi sinh vật .....................................................................47 3.5.2. Kết quả nhuộm Gram và sinh hóa định danh bằng hệ thống IDS14GNR .... 48 3.5.3. Kết quả giải trình tự gene 16S trên máy CEQ 8000 và tra cứu trên BLAST SEARCH ............................................................................................. 49 3.6. Kết quả thí nghiệm xác định hoạt độ enzyme ..........................................51 3.7. Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của vi sinh vật và khả năng phân cắt của algL do vi sinh vật sinh ra ..............53 3.8. Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả năng phân cắt của algL ....................................................................................54 3.9. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân cắt của algL ...................................................................................................................56 3.10. Kết quả thí nghiệm chọn tác nhân kết tủa thích hợp để tách chiết algL từ dịch enzyme ......................................................................................................58 3.11. Đề xuất quy trình thu hồi chế phẩm enzyme algL từ vi khuẩn Klebsiella sp ......................................................................................................................60 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN .............................................63 4.1. Kết luận .....................................................................................................63 4.2. Đề xuất ý kiến ...........................................................................................64 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 66 PHỤ LỤC 1. CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ............................................................ 70 PHỤ LỤC 2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN ............ 75 4 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT E: Enzyme S: Cơ chất Na-alginate dd: dung dịch OA: Oligo Alginate vsv: vi sinh vật algL: Alginate lyase Na-alg: Natri alginate EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid 5 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VÀ ĐỒ THỊ STT TÊN BẢNG Trang 1 Bảng 1.2.3. Nhiệt độ phân hủy của các loại Alginte khác nhau 16 2 Bảng 1.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ oligo alginate đến khả năng nảy mầm của hạt thóc giống 19 3 Bảng 3.4. Mức độ hao tổn độ nhớt của các dung dịch Na- alginate khác nhau 44 4 Bảng 3.5.2. Kết quả thử nghiệm sinh hóa định danh 47 5 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của alginate lyase 55 TÊN HÌNH 1 Hình 1.2.2.1a :Công thức cổ điển của hai đơn vị monomeric trong axit Alginic 12 2 Hình 1.2.2.1b: Hình thể dạng ghế của axit Uronic 13 3 Hình 1.2.2.1c: Cấu tạo của axit Alginic 13 4 Hình 1.2.2.1d: Cấu tạo axit alginic theo mô hình các công thức cổ điển (công thức phối cảnh) 13 5 Hình 1.2.2.2a: Công thức cấu tạo Na-alginate 14 6 Hình 1.2.2.2b: Công thức cấu tạo Ca-alginate 15 7 Hình 1.4.2a: Aûnh hưởng của hỗn hợp Oligomanuronate (Oligo- M) chưa bảo hoà và hỗn hợp Oligoguluronate (Oligo-G) chưa bảo hoà lên sự dài ra của rể cây cà rốt và cây lúa 20 8 Hình 1.4.2b: Ảnh hưởng của nồng độ hổn hợp oligo-G đến sự dài ra của rể cây càrốt và lúa . Hình 1.4.2c: Ảnh hưởng của mức độ đồng trùng hợp oligo-G đến sự dài ra của rể cây càrốt à lúa . Độ dài của rể xác định sau 8 và 15 ngày. (nồng độ 0,75mg/ml) 21 9 Hình 3.1a: VSV có khuẩn lạc màu trắng sữa (C1) 40 10 Hình 3.1b: VSV có khuẩn lạc màu mỡ gà (C2) 40 6 11 Hình 3.3a. Khuẩn lạc vi sinh vật màu trắng sữa trên môi trường thạch I 43 12 Hình 3.3b. Khuẩn lạc vi sinh vật màu trắng sữa trên môi trường thạch chỉ có Na-alginate 1,5% và soi dưới kính hiển vi vật kính 100x 43 13 Hình 3.5.1. Khuẩn lạc vi sinh vật phân lập trên các môi trường khác nhau 46 14 Hình 3.5.2. Hình ảnh tế bào vi sinh vật phân lập được 47 15 Hình 3.5.3. Sơ đồ giải trình tự gene 16S của chủng vi sinh vật phân lập 49 TÊN ĐỒ THỊ 1 Đồ thị 3.2. Mức độ hao tổn độ nhớt của dung dịch Na-alginate 1% theo thời gian phân cắt 41 2 Đồ thị 3.4. Mức độ hao tổn độ nhớt của các dd Na-alginate 1% khác nhau theo thời gian phân cắt 44 3 Đồ thị 3.6a. Mức độ hao hụt độ nhớt của dung dịch Na-alginate 1% theo nồng độ Enzyme 50 4 Đồ thị 3.6b. Mức độ hao hụt độ nhớt của dung dịch Na- alginate 1% theo nồng độ Enzyme 51 5 Đồ thị 3.7. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của Klebsiella sp và hoạt độ enzyme algL 52 6 Đồ thị 3.8. Ảnh hưởng các ion kim loại đến hoạt lực của enzyme algL 53 7 Đồ thị 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân cắt của enzyme algL 55 7 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Rong biển là nguồn lợi biển cung cấp các chất keo quan trọng như Agar, Alginate, Carrageenan dùng trong công nghệ thực phẩm và các ngành công nghiệp khác. Trên thế giới từ những năm 1980 rong biển đã được quan tâm nghiên cứu. Năm 1930 công nghệ chế biến các chất Alginate, Manitol, Agar phát triển mạnh và ngày càng ứng dụng nhiều trong thực tế, đặc biệt là ở các nước Nhật Bản, Mỹ và Trung Quốc. Theo Luning (1990) tổng sản lượng của Alginate là 35.000 tấn.[1] Trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng của Alginate trong các ngành công nghiệp như: Thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công nghệ dệt, nông nghiệp, công nghệ sinh học, nghiên cứu khoa học Kết quả của các công trình nghiên cứu ứng dụng alginate trong nông nghiệp cho thấy rằng, mạch alginate sau khi cắt mạch có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển đối với cây trồng [9][10][12][13][14]. Với ứng dụng này, thiết nghĩ việc nghiên cứu các phương pháp cắt mạch alginate để sản xuất chế phẩm kích thích tăng trưởng thực vật là rất cần thiết nhằm tăng năng suất cây trồng và tạo ra các sản phẩm có giá trị tốt từ đó nâng cao giá trị kinh tế là một hướng quan trọng đang được các nhà khoa hoc Việt Nam quan tâm. Chính vì lẽ đó, đề tài “ Nghiên cứu tách chiết Enzyme Alginate lyase từ vi sinh vật có trong rong biển và bước đầu ứng dụng nó để thuỷ phân alginate” là rất cần thiết, góp phần ứng dụng công nghệ sinh học vào nông nghiệp và đời sống sản xuất ở nước ta. 8 2. Mục đích, nhiệm vụ và nội dung nghiên cứu của đề tài
Mục đích, nhiệm vụ Đề tài nhằm phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật trong tự nhiên có khả năng sinh tổng hợp alginate lyase cao. Tiến hành nuôi cấy chủng vi sinh vật đã tuyển chọn trong môi trường thích hợp sau đó lựa chọn phương pháp thích hợp để thu nhận chế phẩm alginate lyase từ môi trường nuôi cấy và bước đầu nghiên cứu ứng dụng cắt mạch alginate. Xác định hoạt độ của enzyme alginate lyase theo phương pháp đo độ nhớt dung dịch alginate 1% trước và sau khi phân cắt. 3. Điểm mới và ý nghĩa khoa học, thực tiễn của đề tài
Điểm mới của đề tài Đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên về phân cắt alginate bằng phương pháp sinh học. Enzyme alginate lyase có thể ứng dụng được vào nông nghiệp để sản xuất ra chế phẩm tăng trưởng thực vật ít độc hại cho con người và góp phần giảm làm giảm ô nhiễm môi trường.
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Kết quả của đề tài góp phần làm phong phú thêm những hiểu biết về công nghệ sinh học và ứng dụng của nó vào các lĩnh vực của đời sống xã hội đặc biệt là trong công nghệ sản xuất enzyme, nông nghiệp và một số ngành công nghiệp khác. Kết quả của đề tài cũng mở rộng đầu ra cho ngành công nghiệp alginate của Việt Nam. Bên cạnh đó các công ty sản xuất thuốc tăng trưởng thực vật cũng có thể ứng dụng để sản xuất ra một chế phẩm tăng trưởng thực vật ít gây độc hại cho con người và môi trường. 9 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về rong Nâu [1]  Ngành rong Nâu là một trong những ngành có giá trị kinh tế cao. Rong Nâu có trên 190 chi, hơn 900 loài, phần lớn sống ở biển, số loài và số chi tìm thấy trong nước ngọt không nhiều lắm. Rong có cấu tạo nhiều tế bào dạng màng giả, dạng phiến, dạng sợi đơn giản, một hàng tế bào chia nhánh, dạng ống hoặc phân nhánh phức tạp hơn dạng cây có gốc, rễ, thân, lá. Rong sinh trưởng ở đỉnh, ở giữa, ở gốc các lóng. Ngoài ra, do các tế bào rong dạng phiến chia cắt sinh trưởng khuếch tán gọi là sinh trưởng bề mặt.  Thành phần hoá học của rong Nâu + Sắc tố Sắc tố rong Nâu là diệp lục tố (Chlorophyl), diệp hoàng tố (Xanthophyl), sắc tố màu nâu (Fucoxanthin), sắc tố đỏ (Caroten). Tuỳ theo tỷ lệ các loại sắc tố mà rong có màu từ nâu – vàng nâu – nâu đậm – vàng lục. Nhìn chung sắc tố của rong Nâu khá bền. + Gluxit − Monosachride Monosacharide quan trọng trong rong Nâu là đường Manitol được Stenhouds phát hiện năm 1884 và được Kylin (1913) chứng minh thêm. Manitol có công thức tổng quát là : HOCH2 – (CHOH)4 – CH2OH Manitol tan được trong ancol, dễ tan trong nước có vị ngọt. Hàm lượng từ 14 ÷ 25% trọng lượng khô tuỳ thuộc vào điều kiện sống. − Polysacharide 10  Alginic: là một polysacharide tập trung giữa ở vách tế bào, là thành phần chủ yếu tạo thành tầng bên ngoài của màng tế bào rong Nâu Alginic và muối của nó có nhiều công dụng trong ngành công nghiệp, nông học, y học và thực phẩm. Hàm lượng Alginic trong các loại rong Nâu khoảng 2 ÷ 4% so với rong tươi và 13 ÷ 15% so với rong khô. Hàm lượng phụ thuộc vào loại rong, điều kiện địa lý môi trường mà rong sinh sống. Theo tài liệu tổng kết của Miyake (1995) cho thấy hàm lượng Alginic trong các loại rong Nâu ở các vùng biển Liên Xô cũ là 13 ÷ 40% Theo tài liệu phân tích của các chuyên gia Bộ Thuỷ sản cho thấy hàm lượng Alginic trong các loại rong Nâu ở Hải Phòng là 22 ÷ 40%, trong khi đó, rong Nâu ở vùng biển Phú Yên và Khánh Hoà cao hơn hẳn. Hàm lượng Alginic có trong các loài rong ở Miền Trung Việt Nam là khá cao, dao động từ 12,3 ÷ 39,4% so với trọng lượng khô tuyệt đối, tuỳ thuộc vào loài và vùng địa lý. Trong đó, loài rong S. mcclurei và Turbinaria ornata có hàm lượng Alginic cao nhất khoảng 35,9 ÷ 39,4% rong khô tuyệt đối. Nếu so sánh tất các vùng biển thì rong ở vùng biển Khánh Hoà có hàm lượng Alginic cao hơn cả (từ 26,2 ÷ 39,4% rong khô tuyệt đối). − Axit Fucxinic: có tính chất giống với axit Alginic. Axit Fucxinic tác dụng với axit Sunfuric tạo thành hợp chất có màu tuỳ thuộc vào nồng độ axit Sunfuric. − Fuccoidin: là loại muối giữa axit Fuccoidin với các kim loại hoá trị khác nhau như Ca, Cu, Zn. Fuccoidin có tính chất gần giống với axit Alginic, nhưng hàm lượng thấp hơn Alginic. − Laminarin: Laminarin là tinh bột của rong Nâu, thường gặp ở dạng bột không màu, không mùi và có hai loại hoà tan và không hoà tan trong nước. 11 Laminarin có hàm lượng từ 10 ÷ 15% trọng lượng rong khô tuỳ thuộc vào loại rong, vị trí địa lý và môi trường sinh sống của rong Nâu. − Cellulose: là thành phần cấu tạo nên vỏ cây rong. Hàm lượng Cellulose trong rong Nâu nhiều hơn rong Đỏ. + Prôtêin: Prôtêin trong rong Nâu không cao lắm nhưng khá hoàn hảo. Do vậy rong Nâu có thể làm thực phẩm. Prôtêin trong rong Nâu thường ở dạng liên kết với Iod tạo Iod hữu cơ có giá trị cao như: MonoIodInzodizin, DiIodInzodizin. Hàm lượng prôtêin rong Nâu ở vùng biển Nha Trang dao động 8,05 ÷ 21,11% so với trọng lượng khô. Hàm lượng axit amin cũng đáng kể và có giá trị cao trong prôtêin của rong biển. + Chất khoáng Hàm lượng các nguyên tố khoáng trong rong Nâu thường lớn hơn nước biển. Chẳng hạn: Iod của rong biển lớn hơn trong nước biển từ 80 ÷90 lần. Hàm lượng Ba lớn hơn trong nước biển là 1.800 lần. Hàm lượng khoáng ở vùng biển Nha Trang dao động trong từ 15,51 ÷ 46,30% phụ thuộc vào mùa vụ và thời kỳ sinh trưởng 1.2. Tổng quan về Alginate 1.2.1. Alginate[1][11] Alginate là thuật ngữ thường dùng cho các loại muối của axit alginic, nhưng cũng có thể xem là tất cả các dẫn xuất của axit alginic hay chính bản thân axit alginic. Ở một số nơi thì thuật ngữ “algin” được dùng thay cho alginate. Alginate tồn tại trong các thành tế bào của rong Nâu dưới dạng muối canxi, Magiê, natri của axit alginic. Alginate được hình thành nhờ phản ứng đồng trùng hợp không phân nhánh của axit α – L – guluronic và axit β – D – manuronic. Sự khác nhau giữa các block là về kích thước và sự thay đổi các 12 đoạn manuronic (M) và guluronic (G) cũng như sự tồn tại của các block ngẫu nhiên. Cấu trúc của alginate chịu ảnh hưởng của nguồn rong biển cũng như điều kiện phát triển của rong. Người ta rất quan tâm đến tỷ lệ M/G vì nó quyết định đến tính chất của gel được tạo thành. Nếu tỷ lệ này càng nhỏ thì khả năng