Đề tài Nghiên cứu tính đa hình AND của các dòng vải thiều Thanh Hà bằng kỹ thuật sinh học phân tử

MỞ ĐẦU Hải Dương là nơi xuất xứ của giống vải thiều Thanh Hà nổi tiếng. Đây là giống vải quí của nước ta, với những ưu điểm hạt nhỏ, cùi dày, chất lượng quả ngon, có vị thơm đặc trưng… mà các giống vải khác không có. Hiện nay, ở thôn Thuý Lâm, xã Thanh Sơn, huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dương vẫn còn cây vải tổ của giống vải này. Theo Hội những người làm vườn Việt Nam cho biết thì đây là cây vải thiều lâu năm nhất của nước ta. Tuổi của nó vào khoảng 180 năm [14]. Qua tìm hiểu, chúng tôi thấy rằng tất cả các cây vải thiều trồng ở Thuý Lâm từ xưa tới nay đều là các thế hệ con cháu (cành chiết) của cây vải tổ này. Tìm hiểu các xã khác của huyện Thanh Hà, các địa phương khác của tỉnh Hải Dương và các tỉnh khác như Bắc Giang, Bắc Ninh, Hà Tây, Hoà Bình, Quảng Ninh..., chúng tôi được nhân dân cho biết họ đều lấy giống vải thiều ở xã Thanh Sơn, huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dương về trồng. Với nhu cầu về cây giống phục vụ cho việc mở rộng diện tích trồng vải ngày càng cao đã dẫn tới tình trạng cây dùng làm giống bị kiệt sức do chiết cành quá nhiều. Trước đây, ở huyện Thanh Hà các cây vải cổ thụ dùng để chiết cành làm giống thì nay hầu như không dùng được nữa. Thay vào đó là sử dụng thế hệ con cháu của các cây vải này. Mặt khác, vải là giống cây thụ phấn chéo nên hạt phấn lẫn tạp không thuần. Với những lý do đó có thể dẫn đến sự thoái hoá của giống bán ra, có những cây chất lượng quả không tốt bằng giống gốc. Vì vậy, vấn đề đặt ra cho chúng ta là phải nghiên cứu tính đa hình ADN của quần thể vải thiều trồng ở huyện Thanh Hà, tỉnh Hải Dương để đánh giá mức độ lẫn tạp và xác định sự chuẩn xác của giống. Có rất nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để phân tích tính đa hình ADN hệ gen như RFLP, AFLP, SSR... Tuy nhiên, các phương pháp này rất phức tạp, yêu cầu thông tin về trình tự cần nghiên cứu và đòi hỏi một lượng lớn ADN hệ gen nên chỉ có kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - đa hình các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên) là được sử dụng phổ biến. Nói chung, RAPD là kỹ thuật đơn giản, ít tốn kém và có độ nhạy cao, dựa trên nguyên tắc của phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) với các mồi ADN không đặc thù để nhân bản các đoạn ADN một cách ngẫu nhiên. Các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên có thể đa hình bởi các đoạn nhân có thể có trong mẫu ADN của cá thể này nhưng lại không có trong mẫu ADN của cá thể khác [56]. Bằng kỹ thuật này, Sun và cộng sự đã khảo sát tính đa hình ADN của các giống lúa mì xuân kháng bệnh Fusarium, Tongpamnak và cộng sự đã xác định tính đa hình di truyền của các giống vải trồng tại Thái Lan... Các kết quả thu được từ các nghiên cứu này không chỉ giúp các nhà khoa học đánh giá một cách chính xác mối quan hệ di truyền, tiến hoá giữa chúng mà còn tạo cơ sở cho công tác lai tạo giống [1], [66], [67]. Có thể nói rằng, kỹ thuật RAPD là một công cụ hữu hiệu cho phân tích tính đa hình ADN, lập bản đồ gen liên kết, xác định chỉ thị phân tử để phân biệt các giống khác nhau cũng như phân tích con lai F1 của nhiều loài động vật, thực vật và vi sinh vật [15], [20], [26]. Xuất phát từ những cơ sở nêu trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tính đa hình AND của các dòng vải thiều Thanh Hà bằng kỹ thuật sinh học phân tử” Ch­¬ng 1. Tæng quan tµi liÖu 1.1. Giíi thiÖu chung vÒ c©y v¶i 1.1.1. Ph©n lo¹i, nguån gèc vµ ph©n bè 1.1.1.1. Ph©n lo¹i C©y v¶i cã tªn khoa häc lµ Litchi chinensis Sonn., thuéc hä bå hßn Sapindaceae, bé bå hßn Sapindales [2]. Hä bå hßn lµ mét hä lín cã kho¶ng 140 chi, víi 1600 loµi, ph©n bè chñ yÕu ë vïng nhiÖt ®íi vµ ¸ nhiÖt ®íi, ®Æc biÖt ë ch©u ¸ vµ ch©u Mü. ë n­íc ta, hiÖn chØ biÕt 25 chi, 91 loµi mäc kh¾p c¶ n­íc. Trong hä nµy cã nhiÒu c©y ¨n qu¶ nh­ c©y v¶i, c©y nh·n vµ ch«m ch«m [8]. 1.1.1.2. Nguån gèc, ph©n bè Nguån gèc c©y v¶i lµ ë miÒn Nam Trung Quèc. HiÖn nay, ë nói T¹ H¶i S¬n (tØnh Qu¶ng §«ng), nói L«i Hå LÜnh, Kim Cæ LÜnh (®¶o H¶i Nam), ë vïng phÝa nam cña Xi Suang Ba Na (V©n Nam) cßn cã nh÷ng c¸nh rõng cã nhiÒu c©y v¶i d¹i. §Æc biÖt nói Kim Cæ LÜnh ë ®¶o H¶i Nam v¶i d¹i mäc thµnh rõng. L©m tr­êng B¹ch Tinh ®· chÆt 534 ha rõng v¶i giµ ®Ó trång c©y kh¸c, hiÖn cßn 50 ha v¶i rõng xanh tèt. Kim Cæ LÜnh ë ®é cao 600 - 700 m so víi mÆt biÓn, t¹i ®©y cã nh÷ng c©y v¶i giµ cã chu vi th©n 7,5 m [8]. Trung Quèc lµ n¬i thuÇn hãa c©y v¶i tr­íc tiªn c¸ch ®©y h¬n 2000 n¨m. §êi H¸n Vò §Õ Nguyªn §inh n¨m thø 6 (111 n¨m tr­íc C«ng nguyªn) ®· cho lËp v­ên v¶i trong cung vua, lÊy c©y tõ LÜnh Nam lªn. §êi nhµ Tèng, vµo n¨m 1059, Th¸i T­¬ng viÕt quyÓn “LÖ Chi Phæ” m« t¶ lÞch sö vïng trång, ®Æc ®iÓm gièng, kü thuËt trång trät, ch¨m sãc vµ chÕ biÕn. §©y ®­îc coi lµ c«ng tr×nh xuÊt b¶n ®Çu tiªn trªn thÕ giíi vÒ c©y v¶i [14], [37]. C©y v¶i cã mÆt ë Myanma, Ên §é vµo cuèi thÕ kû 17, c¸c n­íc ë §«ng Ên vµo thÕ kû 18, ¤xtr©ylia, Nam Phi, Hawaii vµo cuèi thÕ kû 19... Ngµy nay, v¶i ®­îc trång ë c¸c n­íc n»m trong ph¹m vi 20 - 30 vÜ ®é B¾c vµ Nam ®­êng xÝch ®¹o gåm cã c¸c vïng sau [37]: Ch©u ¸: Trung Quèc, Ên §é, Th¸i Lan, ViÖt Nam, Myanma, Lµo, Campuchia, Malaixia, Philipine, In®onexia, Srilanka, NhËt B¶n, Ixarael. Ch©u Phi: Nam Phi, M«rithiuyt, Madagatca, Gab«ng, C«ngg«. Ch©u Mü: Hoa Kú, Hoduras, Panama, Cuba, Pooctorico, Braxin. Ch©u óc: ¤xtr©ylia, Niuzil©n. 1.1.2. T×nh h×nh s¶n xuÊt vµ tiªu thô v¶i trªn thÕ giíi Trªn thÕ giíi hiÖn nay cã trªn 20 n­íc trång v¶i, trong ®ã c¸c n­íc ch©u ¸ cã diÖn tÝch vµ s¶n l­îng lín nhÊt. S¶n xuÊt v¶i cã tÝnh th­¬ng m¹i gåm c¸c n­íc: Trung Quèc, Ên §é, Th¸i Lan, «xtr©ylia, Reunion, Nam Phi, Ma®agatxca, ixrael, ViÖt Nam… DiÖn tÝch v¶i trªn thÕ giíi n¨m 1990 lµ 183.700 ha víi s¶n l­îng 251.000 tÊn, n¨m 1999 s¶n l­îng v¶i cña thÕ giíi kho¶ng 1,6 - 1,8 triÖu tÊn [14]. Trung Quèc lµ n­íc ®øng ®Çu vÒ diÖn tÝch vµ s¶n l­îng v¶i, trong ®ã tØnh Qu¶ng §«ng lµ tØnh ®øng ®Çu vÒ c¶ diÖn tÝch vµ s¶n l­îng. N¨m 1999, tØnh Qu¶ng §«ng cã 530.000 ha v¶i, diÖn tÝch c©y cho qu¶ míi chØ 55,5% mµ s¶n l­îng ®· lªn ®Õn 950.000 tÊn, chiÕm gÇn 50% s¶n l­îng v¶i cña thÕ giíi. N¨ng suÊt b×nh qu©n ®¹t 42,75 t¹/ha. Dù b¸o 10 n¨m ®Çu cña thÕ kû 21, s¶n l­îng v¶i cña tØnh nµy sÏ ®¹t 0,8 - 1 triÖu tÊn [37]. Ên §é lµ n­íc ®øng thø hai vÒ diÖn tÝch vµ s¶n l­îng v¶i. Theo Menzel vµ Simpson, n¨m 1986 diÖn tÝch v¶i ë Ên §é lµ 10.333 ha nh­ng ®Õn n¨m 1998 diÖn tÝch v¶i ®· lªn tíi 56.000 ha víi s¶n l­îng lµ 310.000 tÊn [36]. Ên §é chØ trång v¶i ®­îc ë vïng §«ng B¾c, 95% diÖn tÝch v¶i lµ ë vïng ®ång b»ng réng lín bang Bihar. Trªn lo¹i ®Êt c¸t pha cã nhiÒu canxi, pH = 8, tÇng dµy, t­íi tiªu thuËn lîi nªn c©y v¶i sinh tr­ëng vµ cho qu¶ tèt. S¶n l­îng v¶i cña Ên §é ch­a cao, d©n sè l¹i ®«ng nªn chØ cung cÊp cho thÞ tr­êng trong n­íc [36]. Theo Subhadrabandhu (1993), n¨m 1991, diÖn tÝch v¶i ë Th¸i Lan lµ 15.045 ha, s¶n l­îng 24.000 tÊn trång ë 9 tØnh phÝa B¾c. Trong ®ã, 90% diÖn tÝch v¶i toµn quèc tËp trung ë ChiÒng Mai vµ ChiÒng Rai. ë Th¸i Lan, v¶i lµ mét trong nh÷ng c©y ¨n qu¶ cã hiÖu qu¶ kinh tÕ, chñ yÕu cho néi tiªu, xuÊt khÈu kho¶ng 10%. N¨m 1993, xuÊt khÈu 1.477 tÊn v¶i thu ®­îc 2,368 triÖu ®«la Mü, ®øng thø 4 (sau nh·n 11,908 triÖu USD, sÇu riªng 10,964 triÖu USD, b­ëi 2,876 triÖu USD) trong 9 lo¹i hoa qu¶ nhiÖt ®íi xuÊt khÈu. N¨m 2002, diÖn tÝch v¶i cña Th¸i Lan lªn tíi 23.000 ha víi s¶n l­îng v¶i thu ho¹ch lµ 80.000 tÊn [36]. Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, diÖn tÝch vµ s¶n l­îng v¶i cña ViÖt Nam ngµy cµng t¨ng. TÝnh ®Õn n¨m 1998, toµn bé diÖn tÝch v¶i ®· lªn tíi 25.000 ha vµ s¶n l­îng ®¹t 25.000 tÊn (trong ®ã cã 10.000 ha v¶i ch­a cho qu¶) [68]. B¶ng 1. DiÖn tÝch trång vµ s¶n l­îng v¶i cña mét sè n­íc trªn thÕ giíi (Th«ng tin khoa häc kü thuËt trång v¶i, Qu¶ng §«ng, Trung Quèc 1990) Tªn n­íc  DiÖn tÝch trång (ha)  S¶n l­îng (tÊn)   Trung Quèc Th¸i Lan Ên §é §µi Loan ¤xtr©ylia Ma®agatca Nam Phi Mauritius Reunion Mü  161.681 13.550 11.410 8.386 1.400 800 180 200 200 100  223.680 8.410 91.860 111.981 450 2.000 1.800 200 180 40   1.1.3. C©y v¶i ë ViÖt Nam 1.1.3.1. Nguån gèc, ph©n bè, t×nh h×nh s¶n xuÊt vµ triÓn väng. ë ViÖt Nam, theo c¸c tµi liÖu vµ th­ tÞch cò, c©y v¶i ®· ®­îc trång c¸ch ®©y gÇn 2000 n¨m. D­íi thêi B¾c thuéc, v¶i lµ mét trong nh÷ng cèng vËt hµng n¨m ViÖt Nam ph¶i nép cho c¸c vua Trung Quèc. N¨m 722, Mai Thóc Loan hiÖu triÖu nh÷ng ng­êi d©n phu ph¶i ®i g¸nh v¶i nép cho chÝnh quyÒn nhµ §­êng næi dËy khëi nghÜa [14]. §iÒu ®ã cho thÊy, c©y v¶i cã ë n­íc ta vµ lµ mét s¶n vËt quý. VËy ViÖt Nam cã ph¶i lµ quª h­¬ng cña c©y v¶i kh«ng? Theo tµi liÖu cña Ph¸p ®Ó l¹i th× cã nh÷ng c©y v¶i d¹i mäc ë s­ên nói Ba V×, tØnh Hµ T©y. Vµo n¨m 1982, Gi¸o s­ Vò C«ng HËu ®· gÆp ë ch©n nói Tam §¶o, tØnh VÜnh Phóc mét sè c©y v¶i d¹i cã cïi máng ¨n chua vµ cho r»ng “ViÖt Nam còng lµ mét trong nh÷ng n¬i ®· thuÇn hãa vµ trång v¶i sím, cã ®iÒu kiÖn tù nhiªn thÝch hîp ®Ó ph¸t triÓn c©y v¶i” [37]. Vïng ph©n bè tù nhiªn c©y v¶i cña n­íc ta tõ 18 - 190 vÜ B¾c trë ra. ë miÒn Nam khÝ hËu ®Æc tr­ng nhiÖt ®íi, mïa ®«ng nhiÖt ®é qu¸ cao, v¶i kh«ng ph©n hãa mÇm hoa ®­îc nªn kh«ng cã qu¶. Vïng trång v¶i chñ yÕu cña ViÖt Nam lµ vïng ®ång b»ng s«ng Hång, trung du, miÒn nói B¾c Bé vµ mét phÇn khu 4 cò. Nh÷ng vïng trång v¶i lín, næi tiÕng trong n­íc nh­ Lôc Ng¹n (B¾c Giang), Thanh Hµ, ChÝ Linh (H¶i D­¬ng), §«ng TriÒu (Qu¶ng Ninh) cã diÖn tÝch v¶i tõ 3.000 - 7.000 ha. Ngoµi ra, cßn cã v­ên v¶i gièng chÝn sím däc s«ng §¸y, thuéc c¸c huyÖn §an Ph­îng, Hoµi §øc, Ch­¬ng Mü, Thanh Oai, Quèc Oai (tØnh Hµ T©y) [8]. V¶i lµ c©y ¨n qu¶ ®Æc s¶n cña miÒn B¾c, cã gi¸ trÞ dinh d­ìng cao. NÕu lµ gièng tèt, phÇn ¨n ®­îc (cïi) chiÕm 70 - 80%, vá tõ 8 - 15%, h¹t tõ 4 - 18% khèi l­îng qu¶. Trong 100 g phÇn ¨n ®­îc cã: n­íc - 77,69 g, n¨ng l­îng - 335 kJ, protein - 0,94 g, lipit - 0,29 g, hydratcacbon - 20,77 g, x¬ - 0,16 g, tro - 0,37 g, c¸c chÊt kho¸ng (Ca - 4 mg, Fe - 0,37 mg, Mg - 16 mg, P - 35 mg, K - 255 mg, Na - 7 mg) vµ c¸c vitamin (vitamin C - 40,2 mg, B - 0,035 mg, B2 - 0,084 mg, PP - 1,91 mg). N­íc Ðp tõ cïi ra cã ®é Brix cao 19 - 21 (®u ®ñ, cam, quÝt, b­ëi chØ cã 9 - 12). §é chua tõ 0,2 - 0,5. Tû lÖ ®­êng vµo lo¹i tèt, thÝch hîp cho khÈu vÞ c¶ ng­êi ch©u ¸ lÉn ng­êi ch©u ¢u, cã mïi th¬m thanh khiÕt, do ®ã tõ l©u v¶i ®· ®­îc coi lµ mét trong nh÷ng lo¹i qu¶ nhiÖt ®íi ngon nhÊt. S¸ch Trung Quèc viÕt “V¶i bæ n·o, khoÎ ng­êi, khai vÞ, cã thÓ ch÷a bÖnh ®­êng ruét, lµ mét thùc phÈm quÝ ®èi víi phô n÷ vµ ng­êi giµ” [14] Qu¶ v¶i ngoµi ¨n t­¬i cßn ®­îc chÕ biÕn thµnh c¸c s¶n phÈm cã gi¸ trÞ: n­íc v¶i, v¶i hép, v¶i kh«... Vá qu¶, th©n c©y vµ rÔ cã nhiÒu tanin cã thÓ dïng lµm nguyªn liÖu trong chÕ biÕn c¸c lo¹i thuèc vµ mét sè ngµnh c«ng nghiÖp kh¸c. Trång v¶i kh«ng ph¶i chØ ®Ó lÊy qu¶ mµ cßn ®Ó phôc vô cho viÖc nu«i ong lÊy mËt. Hoa v¶i lµ nguån mËt nu«i ong cã chÊt l­îng cao, trong mét vô hoa v¶i nÕu ®Æt mét thïng ong cã thÓ thu ®­îc 20 - 30 kg mËt. H¹t v¶i cßn ®­îc dïng lµm thuèc ch÷a mét sè bÖnh ®­êng ruét, môn nhät... H¹t v¶i chøa nhiÒu tinh bét (37%) nªn cßn cã thÓ dïng ®Ó lªn men r­îu, lµm giÊm [6]. Gç v¶i lµ mét lo¹i gç quÝ, bÒn, kh«ng bÞ mät ®ôc, cã thÓ dïng x©y dùng nhµ cöa, ®Ó ®ãng ®å gç. C©y v¶i trång lµm c©y c¶nh rÊt ®Ñp. T¸n trßn, tù t¹o lÊy, kh«ng ph¶i ®èn tØa phøc t¹p, mµu l¸ xanh thÉm, mÆt trªn bãng, bèn mïa t­¬i tèt gãp phÇn c¶i thiÖn ®iÒu kiÖn m«i tr­êng. ¦u thÕ lín cña c©y v¶i lµ tÝnh thÝch øng m¹nh, dÔ trång. V¶i l¹i chÞu ®Êt chua, ®Êt dèc lµ lo¹i ®Êt phæ biÕn ë vïng ®åi nói phÝa B¾c n­íc ta. T¸c h¹i do b·o lôt còng Ýt do qu¶ chÝn vµo th¸ng 5, 6 khi b·o míi chØ b¾t ®Çu. Th¸ng 11, 12, khi ®ät hoa b¾t ®Çu h×nh thµnh th× trêi b¾t ®Çu rÐt vµ h¹n gióp kÝch thÝch ra hoa. Th¸ng 4, 5, khi qu¶ s¾p chÝn cÇn nhiÒu n­íc l¹i lµ lóc b¾t ®Çu mïa m­a, khÝ hËu Èm Ýt khi thiÕu n­íc [6]. Trång v¶i trong v­ên gia ®×nh mang l¹i thu nhËp kh¸ cao so víi c¸c c©y ¨n qu¶ kh¸c (cam, chuèi, hång xiªm…). Nh©n d©n cho biÕt cïng trªn mét ®¬n vÞ diÖn tÝch, nÕu trång v¶i thiÒu sÏ thu gi¸ trÞ kinh tÕ gÊp 6 lÇn trång lóa. ë huyÖn Lôc Ng¹n (B¾c Giang) nhê trång v¶i thiÒu mµ tõ mét huyÖn miÒn nói ®ãi nghÌo ®· trë thµnh mét huyÖn giµu cã. N¨m 1998, hµng chôc hé n«ng d©n cã thu nhËp tõ 20 - 90 triÖu ®ång. N¨m 1998, gi¸ trÞ thu nhËp cña huyÖn ®¹t 105 tû ®ång, riªng v¶i thiÒu ®¹t 65 tû, gÊp 4 lÇn so víi n¨m 1994. N¨m 1998, Lôc Ng¹n cã 7092 ha v¶i ®¹t ®­îc che phñ ®Êt kho¶ng 35% trong khi ®ã chØ tiªu quèc gia vÒ ®é an toµn che phñ lµ 40% [14]. MÊy n¨m gÇn ®©y phong trµo lµm v­ên ®ang ph¸t triÓn m¹nh. NhiÒu tØnh nh­ Th¸i Nguyªn, Hoµ B×nh, Hµ T©y, Phó Thä, VÜnh Phóc, Yªn B¸i, Lµo Cai, L¹ng S¬n, Thanh Ho¸, NghÖ An,… ®ang cã kÕ ho¹ch t¨ng diÖn tÝch c©y trång vµ coi v¶i thiÒu nh­ mét c©y chñ lùc trong c¬ cÊu c©y ¨n qu¶ trong v­ên. Theo sè liÖu cña Tæng côc Thèng kª n¨m 1997, diÖn tÝch trång v¶i thiÒu ë miÒn B¾c lµ 25.114 ha, trong ®ã cã 10.313 ha ®ang ë ®é tuæi cho thu ho¹ch, s¶n l­îng ®¹t 27.193 tÊn. C¨n cø vµo sè liÖu nµy, ViÖt Nam ®­îc coi lµ n­íc ®øng thø hai trong danh s¸ch nªu ë b¶ng 1 vÒ diÖn tÝch vµ s¶n l­îng v¶i. Do diÖn tÝch v¶i ngµy cµng t¨ng vµ më réng ë nhiÒu tØnh phÝa B¾c, s¶n l­îng cao, chÝn tËp trung, chñ yÕu tiªu thô trong n­íc nªn gi¸ b¸n thÊp. V× vËy, chiÕn l­îc ph¸t triÓn cña n­íc ta hiÖn nay lµ n©ng cao diÖn tÝch trång song song víi viÖc n©ng cao chÊt l­îng gièng, t×m c¸c gièng kh¸c nhau ®Ó r¶i vô, c¶i tiÕn c«ng nghÖ sau thu ho¹ch vµ t¨ng c­êng xuÊt khÈu. XuÊt ph¸t tõ nhËn thøc nµy vµ do n­íc ta lµ mét n­íc n«ng nghiÖp víi kho¶ng 80% d©n sè sèng ë vïng n«ng th«n nªn c¸c nghiªn cøu c¬ b¶n nh»m t×m kiÕm vµ ph¸t hiÖn ra c¸c nguån gen quÝ trong quü gen cña c¸c gièng c©y trång cã gi¸ trÞ kinh tÕ cao trong s¶n xuÊt n«ng nghiÖp, nh­ c©y ¨n qu¶ ®Æc s¶n v¶i thiÒu Thanh Hµ, sÏ kh«ng chØ cã ý nghÜa khoa häc c¬ b¶n, mµ cßn gãp phÇn thiÕt thùc vµo viÖc b¶o tån vµ ph¸t triÓn sù ®a d¹ng sinh häc cña c¸c c©y ¨n qu¶ nãi riªng vµ c¸c gièng c©y trång ë n­íc ta nãi chung. 1.1.3.2. Gièng v¶i thiÒu Thanh Hµ ë ViÖt Nam, hiÖn cã 3 nhãm gièng v¶i chñ yÕu ®ã lµ: v¶i chua, v¶i nhì vµ v¶i thiÒu. V¶i chua hay cßn gäi lµ v¶i ta lµ gièng v¶i ®Þa ph­¬ng, trång tõ l©u ®êi b»ng h¹t nªn ®Æc tÝnh kh«ng æn ®Þnh, ¨n qu¶ cã vÞ chua, chÊt l­îng nãi chung thÊp h¬n v¶i thiÒu. V¶i nhì (v¶i lai) lµ gièng v¶i lai gi÷a v¶i chua vµ v¶i thiÒu. V¶i thiÒu cßn gäi lµ v¶i Tµu v× ng­êi ta cho r»ng nã ®­îc ®­a tõ Trung Quèc sang. Gièng v¶i nµy hiÖn nay cã hai lo¹i lµ v¶i thiÒu Phó Hé (Phó Thä) vµ v¶i thiÒu Thanh Hµ (H¶i D­¬ng) [14]. H×nh 1. C©y v¶i thiÒu tæ t¹i th«n Thuý L©m (¶nh: NguyÔn V¨n Hîi) C©y v¶i thiÒu Thanh Hµ cã t¸n trßn, cµnh vµ l¸ nhá, nhiÒu chïm qu¶ nh­ng qu¶ th­a, qu¶ h×nh cÇu, cuèng qu¶ c¾m xiªn, gai trung b×nh. Qu¶ chÝn cã mµu ®á trªn nÒn h¬i vµng. Qu¶ nÆng 18 - 20 g. Tû lÖ cïi 72 - 76%. §é Brix 19 - 20. Qu¶ ch­a chÝn h¼n ¨n ®· tèt, ®é chua 0,4%. V¶i thiÒu Phó Hé lµ gièng nhËp néi tõ tr­íc n¨m 1945 ë Trung t©m nghiªn cøu chÌ vµ c©y ¨n qu¶ Phó Hé (Phó Thä). Chïm nhiÒu qu¶, qu¶ to 25-27 g nh­ng Ýt chïm. Khi chÝn qu¶ cã mµu ®á sÉm, h×nh tr¸i tim, vai qu¶ h¬i nghiªng, h×nh gai nhiÒu c¹nh, ®é lín kh«ng ®Òu. H¹t còng vËy, to nhá kh«ng ®Òu (h¹t to nhÊt 3,5 g, h¹t bÐ nhÊt 0,4 g), träng l­îng trung b×nh 1,8 g. Tû lÖ phÇn ¨n ®­îc trªn d­íi 70%, ®é kh« 20 - 21%, cao h¬n v¶i thiÒu Thanh Hµ, ®é chua còng cao h¬n. Theo ®¸nh gi¸ cña nhµ m¸y hoa qu¶ T­¬ng Mai (Hµ Néi) th× v¶i thiÒu Phó Hé lµm ®å hép rÊt tèt, tuy nhiªn kh«ng b»ng v¶i thiÒu Thanh Hµ. HiÖn nay, ch­a cã ai nghiªn cøu tuæi thä cña c©y v¶i thiÒu ë n­íc ta nh­ng theo Héi nh÷ng ng­êi lµm v­ên ViÖt Nam (VACVINA) th× c©y v¶i thiÒu l©u n¨m nhÊt cña n­íc ta ®­îc trång ë th«n Thuý L©m, x· Thanh S¬n, huyÖn Thanh Hµ, tØnh H¶i D­¬ng. §©y lµ c©y v¶i thiÒu ®Çu tiªn ®­îc trång ë ViÖt Nam vµ v× vËy ®­îc gäi lµ c©y “V¶i Tæ” cña gièng v¶i thiÒu Thanh Hµ. C©y v¶i nµy cã nguån gèc tõ ThiÒu Ch©u - Trung Quèc, nªn gièng v¶i Thanh Hµ ®­îc gäi lµ v¶i thiÒu Thanh Hµ [14]. Qua t×m hiÓu thÊy r»ng tÊt c¶ c¸c c©y v¶i thiÒu trång ë Thuý L©m tõ x­a tíi nay ®Òu lµ c¸c thÕ hÖ con ch¸u (cµnh chiÕt) cña c©y v¶i tæ nµy. T×m hiÓu c¸c x· kh¸c cña huyÖn Thanh Hµ, c¸c ®Þa ph­¬ng kh¸c cña tØnh H¶i D­¬ng vµ c¸c tØnh kh¸c nh­ B¾c Giang, Hµ T©y, Hoµ B×nh, chóng t«i ®­îc nh©n d©n cho biÕt hä ®Òu lÊy gièng v¶i thiÒu tõ x· Thanh S¬n, huyÖn Thanh Hµ. HiÖn nay, ë Thanh S¬n cã mét bé s­u tËp “sèng” c¸c c©y v¶i thiÒu cã tuæi c©y tõ vµi n¨m ®Õn kho¶ng 180 n¨m tuæi. Mét sè c©y ®­îc dïng lµm gièng gèc ®Ó chiÕt cµnh, nh­ng do chiÕt qu¸ nhiÒu cµnh nªn c©y v¶i mÑ bÞ kiÖt søc, tho¸i ho¸ gièng vµ l­îng c©y gièng kh«ng ®ñ cung cÊp cho viÖc më réng diÖn tÝch trång. V× vËy, vÊn ®Ò ®Æt ra cho c¸c nhµ khoa häc lµ ph¶i nghiªn cøu tÝnh ®a h×nh ADN hÖ gen cña quÇn thÓ v¶i thiÒu Thanh Hµ ®Ó ®¸nh gi¸ møc ®é lÉn t¹p, x¸c ®Þnh phÈm chÊt cña gièng, b¶o tån vµ ph¸t triÓn nguån gen quÝ. HiÖn nay, mét trong nh÷ng kü thuËt tá ra cã tÝnh ­u viÖt ®Ó ®¸nh gi¸ tÝnh ®a h×nh di truyÒn cña sinh vËt nãi chung vµ tÝnh ®a h×nh ADN hÖ gen cña c¸c quÇn thÓ v¶i nãi riªng lµ kü thuËt RAPD. 1.2. kü thuËt PCR - RAPD 1.2.1. Ph¶n øng PCR 1.2.1.1. LÞch sö cña ph­¬ng ph¸p Ph­¬ng ph¸p PCR (Polymerase Chain Reaction - ph¶n øng tæng hîp d©y chuyÒn nhê polymerase) do Kary Mullis vµ céng sù ph¸t minh vµo n¨m 1985 ®· gãp phÇn t¹o ra cuéc c¸ch m¹ng trong sinh häc ph©n tö. Kü thuËt PCR lµ mét ph­¬ng ph¸p hoµn toµn míi trong viÖc nghiªn cøu vµ ph©n tÝch gen. Sö dông kü thuËt PCR cã thÓ t¹o ra mét sè l­îng lín c¸c b¶n sao cña ®o¹n ADN cÇn tæng hîp mµ kh«ng ph¶i t¸ch dßng, nh©n dßng hay sö dông c¸c sinh vËt sèng nh­ E.coli hoÆc nÊm men [4]. 1.2.1.2. Nguyªn t¾c cña ph­¬ng ph¸p PCR VÒ c¬ b¶n PCR lµ mét ph­¬ng ph¸p in vitro cho phÐp nh©n b¶n nhanh mét ®o¹n ADN dùa trªn c¬ së ®Æc tÝnh ho¹t ®éng cña c¸c ADN polymerase. ADN polymerase cã mÆt tù nhiªn trong c¸c c¬ thÓ sèng. Chóng thùc hiÖn chøc n¨ng sao chÐp ADN tr­íc khi tÕ bµo ph©n chia. Chóng liªn kÕt víi mét sîi ADN ®¬n vµ tæng hîp nªn mét sîi ®¬n míi bæ sung víi sîi ban ®Çu, tõ vÞ trÝ måi (mét tr×nh tù ADN ng¾n) ®· b¾t cÆp s½n víi khu«n. ë ph­¬ng ph¸p mµ Kary Mullis ®­a ra ban ®Çu, enzym ®­îc sö dông in vitro. Khi n©ng nhiÖt ®é lªn kho¶ng 96oC ®Ó biÕn tÝnh vµ t¸ch ADN sîi ®«i thµnh hai sîi ®¬n th× ADN polymerase bÞ mÊt ho¹t tÝnh. Cho nªn viÖc bæ sung thªm enzym sau giai ®o¹n gia nhiÖt cña mçi chu kú ®· lµm cho ph­¬ng ph¸p nµy trë thµnh ph­¬ng ph¸p kÐm hiÖu qu¶, tèn thêi gian, yªu cÇu mét l­îng ADN polymerase qu¸ lín vµ ph¶i theo dâi liªn tôc trong suèt qu¸ tr×nh PCR [4]. VÒ sau ph­¬ng ph¸p nµy ®­îc c¶i tiÕn b»ng c¸ch sö dông ADN polymerase t¸ch tõ vi khuÈn ­a nhiÖt sèng ë c¸c suèi n­íc nãng trªn 110oC. ADN polymerase t¸ch tõ c¸c vi khuÈn nµy bÒn nhiÖt (bÒn v÷ng ë nhiÖt ®é cao) vµ trong ph¶n øng PCR nã kh«ng bÞ mÊt ho¹t tÝnh khi hçn hîp gia nhiÖt ®Ó t¸ch c¸c sîi ADN. Do vËy, kh«ng cÇn thiÕt ph¶i bæ sung thªm ADN polymerase míi vµo mçi chu kú vµ qu¸ tr×nh nh©n b¶n mét sîi ADN cÇn lùa chän cã thÓ ®­îc ®¬n gi¶n ho¸ vµ thùc hiÖn tù ®éng [56]. Ph¶n øng PCR lµ mét qu¸ tr×nh t­¬ng ®èi ®¬n gi¶n, gåm mét chuçi c¸c ph¶n øng víi nhiÒu chu kú lÆp l¹i, mçi chu kú gåm 3 giai ®o¹n [4]: + Giai ®o¹n 1 (biÕn tÝnh): ADN ®­îc biÕn tÝnh ë nhiÖt ®é kho¶ng 950C trong thêi gian kho¶ng 1 phót, khi ®ã c¸c liªn kÕt hidro bÞ ®øt vµ sîi ADN kÐp t¸ch thµnh hai sîi ®¬n. + Giai ®o¹n 2 (g¾n måi): ë nhiÖt ®é tõ 300C ®Õn 650C trong kho¶ng 30 gi©y ®Õn 1 phót th× c¸c måi b¾t cÆp víi sîi ADN khu«n theo nguyªn t¾c bæ sung ë hai ®Çu ®o¹n ADN cÇn nh©n. NhiÖt ®é cña b­íc g¾n måi tïy thuéc vµo tõng lo¹i måi cô thÓ, ®­îc tÝnh to¸n dùa trªn nhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña ®o¹n måi. C«ng thøc tÝnh nhiÖt ®é nãng ch¶y (Tm) cña ®o¹n måi: Tm = 81,5 + 16,6(log10 {J+}) + 0,41(%G + C) - (600/I) - 0,63(%FA) Trong ®ã: {J+}: nång ®é cña c¸c cation hãa trÞ I FA : chÊt dïng ®Ó g©y biÕn tÝnh ADN I : chiÒu dµi cña måi + Giai ®o¹n 3 (tæng hîp ADN): ë nhiÖt ®é kho¶ng 720C, trong kho¶ng thêi gian tõ 30 gi©y ®Õn nhiÒu phót (tuú thuéc vµo chiÒu dµi ®o¹n ADN cÇn tæng hîp), khi ®ã, enzym Taq polymerase ho¹t ®éng vµ qu¸ tr×nh tæng hîp ADN diÔn ra trªn nh÷ng ®o¹n gi÷a cÆp måi theo chiÒu tõ 5’- 3’. Mét chu kú gåm 3 b­íc trªn ®­îc lÆp ®i lÆp l¹i nhiÒu lÇn vµ qua mçi lÇn lµm t¨ng gÊp ®«i sè mÉu lÇn tr­íc. Sù t¨ng l­îng mÉu nµy theo cÊp sè nh©n, nªn sau n chu