Đề tài Phương pháp thu nhận và ứng dụng hợp chất curcumin trong củ nghệ

1 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ----
---- BÁO CÁO CÔNG NGHỆ TẾ BÀO ĐỀ TÀI:PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ ỨNG DỤNG HỢP CHẤT CURCUMIN TRONG CỦ NGHỆ GVHD: NGUYỄN THỊ THỦY TIÊN SV : TRƯƠNG THỤY TRÀ MY 60801296 NGUYỄN THỤY ANH THƯ 60802186 2 MỤC LỤC MỤC LỤC...................................................................................................................................... 2 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH. .................................................................................................. 3 I. Tổng quan. ................................................................................................................................. 3 I.1. Giới thiệu cây nghệ. .............................................................................................................. 4 I.1.1. Nguồn gốc – Phân bố. .................................................................................................... 4 I.1.2. Phân loại. ........................................................................................................................ 5 I.1.3. Đặc điểm. ....................................................................................................................... 5 I.1.4. Sinh trưởng. .................................................................................................................... 5 I.1.5. Thành phần hóa học của củ nghệ. .................................................................................. 6 I.2. Giới thiệu về curcumin. ........................................................................................................ 6 I.2.1. Cấu trúc hóa học và các đặc tính hóa lý của curcumin. ................................................. 7 I.2.2. Tính chất vật lý. .............................................................................................................. 9 I.2.3 Tính chất hóa học đặc trưng. ......................................................................................... 10 II.Nhân giống cây nghệ (curcuma) bằng phương pháp in vitro. ............................................ 10 II.1.Sơ lược về phương pháp vi nhân giống. ............................................................................. 10 II.2.Phương pháp thực hiện. ...................................................................................................... 11 II.3.Các yếu tố ảnh hưởng. ........................................................................................................ 11 III.Thu nhận curcumin. .............................................................................................................. 12 III.1.Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước. ....................................................................... 13 III.2.Phương pháp dùng dung môi dễ bay hơi. .......................................................................... 15 III.3.Phương pháp dùng bình Soxhlet. ...................................................................................... 17 III.4.Phương pháp dùng dung dịch chất lưỡng cực (aqueous hydrotrope solution). ................. 17 III. Ứng dụng của curcumin. ..................................................................................................... 21 III.1. Hoạt tính chống oxy hóa. ................................................................................................. 21 III.2. Hoạt tính kháng viêm. ...................................................................................................... 22 III.3. Hoạt tính chống đông máu. .............................................................................................. 23 III.4. Ngăn cản và điều trị ung thư. ........................................................................................... 23 III.5. Tính kháng virus, vi khuẩn, nấm và kí sinh trùng. ........................................................... 23 TÀI LIỆU THAM KHẢO. ......................................................................................................... 24 3 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH. Hình I.1: Cây nghệ. Hình I.2: Một số loài nghệ. Hình I.3: Cấu trúc hóa học của curcuminoid. Hình I.4: Các hợp chất curcuminoid. Hình I.5: Đồng phân hình học dạng cis-trans của curcumin. Hình I.6: Dạng keto và enol của curcumin. Hình II.1: Bình Soxhlet. Hình II.2: Các lớp tế bào của củ nghệ. Hình II.3: Sự phá vỡ cấu trúc của các lớp tế bào củ nghệ sau khi bị chất lưỡng cực thâm nhập 4 I. Tổng quan. I.1. Giới thiệu cây nghệ. Hình I.1: Cây nghệ. I.1.1. Nguồn gốc – Phân bố. Nghệ - curcuma là một chi thuộc họ Gừng (Zingiberaceae).Curcuma là tên Latin xuất phát từ từ “Kourkoum”, một từ mang gốc Ả Rập nghĩa là “có màu vàng”. Ngày nay nghệ vàng được trồng ở Ấn Độ, Pakistan, Malaysia, Myanmar, Việt Nam, Thái Lan, Philippines, Nhật, Trung Quốc, Hàn Quốc, Sri Lanka, Nepal, những hòn đảo ở Nam Thái Bình Dương, Đông và Tây Phi, các đảo ở biển Caribbean, châu Mỹ, nhưng Ấn Độ vẫn là nơi sản xuất và xuất khẩu nghệ vàng chủ yếu hiện tại [1]. Nghệ mọc hoang dại và phân bố khắp những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Tại Việt Nam, cây mọc hoang dại và được trồng khắp nơi. Ở Ấn Độ, nghệ vàng được sử dụng từ lâu đời: dùng làm gia vị, dùng trong các phương thuốc truyền thống của người Ấn Độ. Ngày nay, nó còn được dùng trong công nghiệp thực phẩm (chủ yếu là chất màu), công nghiệp dược phẩm (chống oxi hóa, chữa bệnh, …) và mỹ phẩm (sản phẩm dưỡng, làm đẹp da). 5 I.1.2. Phân loại. Chi nghệ gồm khoảng 1400 loài. (a) (b) (c) (d) Hình I.2: Một số loài nghệ. (a) Curcuma aromaticum (b) Curcuma aeruginosa (c) Curcuma singularis (d) Curcuma purpurascens I.1.3. Đặc điểm. Nghệ là cây thân thảo, cao 0.6 – 1 m. Lá có hình dải trái xoan, dài 45cm, rộng 18cm, hai mặt nhẵn. Cuống lá có bẹ mang lông. Hoa mọc từ giữa các lá, hợp thành bông hình trụ, mang cán dài. Lá bắc có màu trắng hay hơi lục. Các lá bắc trên phớt tím nhạt. Đài không đều. Tràng hoa hình ống không đều, thùy giữa lớn hơn và có mũi nhọn. Bầu có lông, vòi nhẵn. Quả nang 3 ô mở bằng van. Thân rễ gọi là khương hoàng, rễ củ gọi là uất kim. Củ chắc và nặng, dài 2 - 5 cm, đường kính 1 – 3 cm. Mặt ngoài xám nâu, nhăn nheo. Đôi khi cón lại vết tích của các nhánh và rễ phụ. Củ có mùi thơm hắc, vị cay. Cắt ngang củ thấy rõ hai vùng : vỏ và trụ giữa. Trụ giữa chiếm chừng 2/3 bán kính củ. I.1.4. Sinh trưởng. Nghệ có thể phát triển ở các điều kiện nhiệt đới khác nhau, từ đồng bằng cho đến độ cao 1500m, thích nghi tốt trong khoảng nhiệt độ 20-30°C. Đặc biệt, nghệ phát triển tốt nhất ở những 6 vùng có lượng mưa trung bình trên 1500mm, ở các vùng khác thì phải bù thêm nước bằng việc tưới tiêu với lượng nước tương đương. Trồng trọt: Đất phải được cày xới 6-8 lần để đất được tơi xốp và hình thành mùn. Sau đó, đất được đánh luống để đảm bảo việc tưới tiêu và thoát nước được tốt. Thời gian gieo hạt là từ tháng 6 đến giữa tháng 7. Giống là những củ to, chắc, chiếm khoảng 15-20% lượng thu hoạch của mùa vụ trước. Trong thời gian trồng, cần làm cỏ và bón phân đầy đủ. Đồng thời, phải có những biện pháp phòng và chống các bệnh thường gặp như bệnh vết lá, đốm lá do vi sinh vật và bệnh cuốn lá do sâu bệnh gây ra. Thu hoạch: Nghệ ra bông vào khoảng tháng 8 và được thu hoạch vào mùa thu. Khi thu hoạch, rễ để riêng và thân để riêng. Để thuận tiện cho việc thu hoạch, người ta thường cắt bỏ phần trên của cây nghệ bao gồm phần thân, lá và hoa; sau đó cày hay cuốc cho đất vỡ ra và từng cụm rễ nghệ được kéo lên một cách cẩn thận. Nghệ sau thu hoạch được ngâm nước để làm sạch đất, rễ và vảy; sau đó được cất vào kho. Muốn để nghệ được lâu, người ta thường phải đồ hoặc hấp trong 6-12 giờ, sau đó để ráo nước rồi đem phơi nắng hay sấy khô. I.1.5. Thành phần hóa học của củ nghệ. Thành phần trong củ nghệ vàng gồm có: chất màu curcumin (curcuminoids), tinh dầu nghệ dễ bay hơi, chất xơ, chất khoáng, protein, chất béo, lượng ẩm, và carbohydrate. Thành phần của củ nghệ vàng Turmeric Curcumin (Curcuminoids) 2 – 8 % Tinh dầu (Volatile essential oil) 3 – 7 % Chất xơ (Fiber) 2 – 7 % Chất khóang (Mineral matter) 3 – 7 % Protein 6 – 8 % Chất béo (Fat) 5 – 10 % Lượng ẩm (Moisture) 6 – 13 % Carbohydrates 60-70 % Theo Ishita Chattopadhyay (2004), trong tinh dầu (5.8%) thu được bằng chưng cất lôi cuốn hơi nước của củ nghệ gồm có α-phellandren (1%), sabinene (0.6%), cineol (1%), borneol (0.5%), zingiberene (25%) và sesquiterpines (53%) [2]. I.2. Giới thiệu về curcumin. Curcuminoid là các hợp chất có tác dụng tạo nên màu vàng cho củ nghệ. Cùng với tinh dầu, các hợp chất curcuminoid tạo nên vị cay và mùi hăng đặc trưng cho củ nghệ. Ngoài ra curcuminoid còn bảo vệ nghệ chống lại sự xâm nhập của nấm và vi sinh vật. 7 Curcumin là thành phần quan trọng nhất và linh động nhất trong củ nghệ. Nó có hoạt tính sinh học quan trọng như hoạt tính kháng viêm; chống oxy hóa, dị ứng; liền vết thương; chống co thắt; kháng khuẩn, nấm và khối u; … . Ở Mỹ, curcumin được dùng như một chất tạo màu trong phó mát, mustard, ngũ cốc, hoa quả dầm, bột khoai tây, trong súp, kem và cả yogurts. I.2.1. Cấu trúc hóa học và các đặc tính hóa lý của curcumin. Năm 1815, cấu trúc của curcumin (C21H20O6) lần đầu tiên được miêu tả bởi Volger và Pelletier. Và năm 1913, cấu trúc hóa học của curcumin được Lampe xác định qua một loạt các phản ứng: • Khi đun curcumin với kiềm tạo thành vanilic acid và ferulic acid • Curcumin nóng chảy với kiềm cho protocatechuic acid ((OH)2C6H3COOH) • Oxy hóa bằng permanganat tạo thành vanilin • Tác dụng với hydroxylamin tạo dẫn xuất isoxozol • Hydro hóa dẫn xuất diacetyl của curcumin cho hỗn hợp dẫn xuất hexahydro và tetrahydro. Từ những phản ứng trên, cấu trúc của curcumin được xác định là diferuloymethan.  Cấu trúc hóa học của các hợp chất curcumin trong nghệ (curcuminoids) Curcuminoid là các hợp chất của phenol có trong củ nghệ. Curcuminoid gồm chủ yếu là ba hợp chất tạo màu cơ bản cho củ nghệ, tồn tại trong củ nghệ với những tỉ lệ khác nhau và đều là những dẫn xuất dicinnamoylmethane: 1) 1,7-Bis-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione = diferuloylmethane = curcumin (CTHH: C21H20O6: C.A.S. number: 458-37-7, M = 368) 2) 1-(4-Hydroxyphenyl)-7-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione = p-hydroxycinnamoylferuloylmethane = demethoxycurcumin (CTHH: C20H18O5: C.A.S. number: 33171-16-3, M = 338) 3) 1,7-Bis-(4-hydroxyphenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione = p,p-dihidroxydicinnamoylmethane = bisdemethoxycurcumin (CTHH: C19H16O4: C.A.S. number: 33171-05-0, M = 308) 8 Hình I.3: Cấu trúc hóa học của curcuminoid. 1) Curcumin: R1 = R2 = OCH3 2) Demethoxycurcumin: R1 = OCH3, R2 = H 3) Bisdemethoxycurcumin: R1 = R2 = H Hình I.4: Các hợp chất curcuminoid. Trong ba hợp chất trên, curcumin thường chiếm tỉ lệ chủ yếu, sau đó là demethoxycurcumin, và bisdemethoxycurcumin thường ít linh động hơn. 9 Bên cạnh ba thành phần chủ yếu, người ta cũng tách ra được ba thành phần phụ được cho là các đồng phân hình học của ba hợp chất trên. Một trong ba thành phần phụ này được cho là đồng phân hình học dạng cis-trans của curcumin dựa trên phổ UV của nó (curcumin có cấu hình trans-trans). Đồng phân này có điểm nóng chảy thấp hơn và ít ổn định hơn trong dung dịch cũng như trong ánh sáng so với curcumin . Hình I.5: Đồng phân hình học dạng cis-trans của curcumin. Hình I.6: Dạng keto và enol của curcumin. I.2.2. Tính chất vật lý. • Curcumin trích từ củ nghệ có dạng bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 184 – 185 °C. • Curcumin không tan trong nước, tan trong cồn, aceton, metanol, dicloromethan, dicloetylen, benzen, acid acetic, … 10 • Trong môi trường trung tính, dung dịch curcumin có màu vàng. Môi trường acid, dung dịch có màu vàng ánh lục (vàng chanh). Dung dịch có màu từ cam tới đỏ tím trong môi trường kiềm. • Màu của curcumin bền với nhiệt độ, không bền với ánh sáng và khi có sự hiện diện của SO2 với nồng độ ≥ 10 ppm. • Dung dịch curcumin trong dung môi hữu cơ có độ hấp thu cực đại ở bước sóng khoảng 420 – 430 nm. I.2.3 Tính chất hóa học đặc trưng. • Curcumin dễ dàng bị phân hủy dưới tác dung của ánh sáng hoặc trong môi trường pH thích hợp. • Phản ứng cộng với Hydro • Phản ứng tạo phức với kim loại. • Phản ứng của nhóm OH trên vòng benzene. • Phản ứng amin hóa. II.Nhân giống cây nghệ (curcuma) bằng phương pháp in vitro. II.1.Sơ lược về phương pháp vi nhân giống. Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng. Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm: • Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành. • Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh. • Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành. • Nuôi cấy mô sẹo (callus). • Nuôi cấy tế bào đơn. • Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu khi đã tách vỏ còn gọi là nuôi cấy tế bào trần .  Thuận lợi của phương pháp vi nhân giống: Rút ngắn thời gian sản xuất. Hệ số nhân giống cao. Cây giống đồng nhất. Tiết kiệm không gian. Không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên. Chất lượng cây giống được nâng cao. Đa dạng về sản phẩm. Dễ vận chuyển. Có thể sản xuất quanh năm. 11 II.2.Phương pháp thực hiện.  Nguyên liệu: Chồi non của củ nghệ, cắt đoạn dài 1cm.  Môi trường nuôi cấy: môi trường MS cơ bản. Bổ sung 6µM BA, 0.3µM NAA, 3% sucrose, 0.8% agar. Chỉnh pH đến 5.8. Môi trường được khử trùng bằng autoclave ở 121°C trong 20 phút.  Khử trùng mẫu cấy: Chồi non được rửa dưới vòi nước chảy, rửa với Tween-20 trong 5 phút và rửa lại dưới vòi nước chảy trong 5 phút. Mẫu cấy sau đó được nhúng ngập trong ethanol 70% trong 30-40 giây và ngâm tiếp theo trong dung dịch chất tẩy rửa (0.1% HgCl2 có thêm 2-3 giọt Tween-20/100ml). Trong điều kiện vô trùng, dung dịch HgCl2 được gạn ra và mẫu cấy được rửa 5-6 lần với nước cất vô trùng. Mẫu sau khi khử trùng được tách vỏ trong điều kiện vô trùng và được cắt nhỏ. Sau đó cấy mẫu vào 25ml môi trường. Mẫu được nuôi cấy trong môi trường kích thích tạo chồi trên trong điều kiện 16 giờ chiếu sáng và 8 giờ tối, nhằm thu mẫu cấy vô trùng, sạch bệnh.Sau 6 tuần, thực hiện cấy chuyền mẫu cấy và giữ trong 6 tuần tiếp theo để tạo chồi. Các chồi này được cắt và chuyển vào môi trường mới (thành phần tương tự môi trường ban đầu nhưng không có chất kích thích sinh trưởng) và nuôi cấy trong 4 tuần tiếp theo. II.3.Các yếu tố ảnh hưởng.  Phương pháp khử trùng mẫu cấy: Phương pháp khử trùng làm đẩy mạnh việc tạo mẫu vô trùng và quá trình tạo chồi. Bằng việc kết hợp Tween-20 với 0.1% HgCl2 như một chất làm ẩm nhằm làm giảm sức căng bề mặt và gia tăng bề mặt tiếp xúc. Dưới điều kiện này, hơn 70% mẫu là vô trùng. Và dường như việc sử dụng Tween-20 giúp tăng % mẫu cấy vô trùng vì nó giúp sự khử trùng bề mặt được tốt hơn.  Sucrose. Ở nồng độ 9%, số lượng chồi là cao nhất (8.3 ± 0.32). Chồi lớn nhất (0.88 ± 0.03) g thu được trong tối, trong khi ánh sáng làm giảm nhẹ về số lượng (8.3 ± 0.35) và kích thước (0.82g ± 0.03). Ở nồng độ 7% thì giảm về cả số lượng và kích thước, nhưng không đáng kể về mặt thống kê. Tuy nhiên, nồng độ sucrose thấp hơn (0 - 5%) và cao hơn (11%) có tác dụng hạn chế sự tạo chồi. Kết quả này phù hợp với những báo cáo của Shirgurkar (2001), Sunitibala (2001) và Nayak (2000) [3]. Số lượng chồi thu được cao nhất (5.6 ± 0.8 – 7.0 ± 1.1) ở 6% sucrose, trong khi ở 8% sucrose thì có sự giảm về số lượng (5.6 ± 0.8 – 5.8 ± 1.1) nhưng lại tăng nhẹ về kích thước [4]. Ở nồng độ 3% sucrose, mẫu cấy không thể phát sinh chồi dù tăng nồng độ BA từ 1-7 mg/l hay tăng thời gian chiếu sáng.  Chất kích thích sinh trưởng BA, Kn và NAA. BA, Kn và NAA có ảnh hưởng đáng kể đến sự tạo chồi. 12 Theo Islam (2004), 12 µM BA cùng với 0.3 µM NAA có ảnh hưởng ứng tốt hơn trong tạo chồi về số lượng (8.1 ± 0.36) và khối lượng (0.67 ± 0.03g). Và Kn một mình hay kết hợp với NAA không cho một kết quả hứa hẹn, chỉ tạo ra đến tối đa 4.5 ± 0.14 chồi với khối lượng chồi 0.39 ± 0.02 g. Đồng thời, Islam cho thấy 0.3 µM NAA là thích hợp để đạt số lượng chồi nhiều nhất (8.7 ± 0.36) và khối lượng lớn nhất (0.82 ± 0.03) g [3]. Shirgurkar (2001) khẳng định BA có tác dụng kìm hãm sự sinh chồi ở mẫu cấy củ nghệ. Mặc dù ở nồng độ thấp nhất 4.4 µM, BA không có nhiều ảnh hưởng, nhưng ở nồng độ cao nhất 35.2 µM, nó hoàn toàn kìm hãm sự sinh chồi [4]. Tuy nhiên, Sunitibala (2001) báo cáo rằng Kn (1mg/l) thích hợp cho sự tạo chồi trong nuôi cấy in vitro Curcuma longa L.  Môi trường MS. Theo Islam (2004), môi trường MS nồng độ 0.75 là thích hợp cho sự tạo chồi với số lượng (8.3 ± 0.55) và khối lượng (0.81 ± 0.04) g. Cả nửa nồng độ và nồng độ MS toàn phần đều làm giảm số lượng (6.5 ± 0.53 và 7.1 ± 0.54) và khối lượng (0.65 ± 0.04g và 0.69 ± 0.04) g. Nồng độ MS càng thấp thì càng cho số lượng và khối lượng chồi càng nhỏ, trong khi toàn nồng độ MS cho số lượng chồi ít hơn nhưng có khối lượng lớn hơn [3]. Theo Shirgurkar (2001), nửa nồng độ MS là thích hợp cho sự tạo chồi ở nghệ, với sản lượng trung bình là 5.8 ± 0.7 và kích thước lớn nhất 0.55 ± 0.06 g [4].  Thidiazuron (TDZ). TDZ, một hợp chất giống cytokinin và không chứa purine, cho ảnh hưởng mạnh mẽ hơn cyctokinin đối với nhiều loài thực vật. TDZ kích thích hiệu quả sự phát triển của chồi nách và sự phát sinh các chồi bất định (Huetteman và Preece, 1993). Theo Prathanturarug (2003), việc cho nuôi cấy mẫu cấy với môi trường có bổ sung TDZ với thời gian thích hợp kết hợp việc sau đó chuyển mẫu cấy qua môi trường mới không có chất kích thích sinh trưởng giúp quá trình tạo chồi có hiệu quả cao [5]. TDZ nồng độ 18.17 µM cho số lượng chồi tạo thành lớn nhất: 13.25 ± 0.7 chồi/mẫu với mẫu cấy ban đầu nguyên vẹn và 11.33 ± 0.86 chồi/mẫu với mẫu cấy ban đầu bị cắt (mẫu ban đầu sau đó được cắt thành bốn mẫu bằng nhau trước khi đem cấy vào môi trường chứa TDZ). III.Thu nhận curcumin. Để thu nhận hợp chất tự nhiên curcumin trực tiếp từ củ nghệ,người ta dùng các phương pháp trích ly. 13 III.1.Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.  Xử lý nguyên liệu củ nghệ. Củ nghệ sau thu hoạch được phơi khô dưới ánh sáng mặt trời, đến khi độ ẩm đạt 69%. Phương pháp phơi khô được chọn vì không có sự thay đổi nào trong nguyên liệu thô so với phương pháp sấy khô bằng lò. Nghiền 1kg củ nghệ thành bột và trộn lẫn với hạt thủy tinh, nhằm ngăn chặn sự kết khối đặc của nguyên liệu trong thiết bị chưng cất. Sau đó, cho toàn bộ vào máy chưng cất.  Chưng lôi cuốn hơi nước. Thực chất quá trình là chưng tinh dầu trước để loại tinh dầu, sau đó mới thu curcuminoid. Hơi nước Củ nghệ Xử lý i Nước nóng Chưng cất lôi cuốn hơi nước Cặn rắn Lắng, gạn Cặn rắn Sấy Curcuminoid Tinh dầu Sơ đồ quá trình thực hiện. 14 Hơi nước được sinh ra trong một nồi hấp với áp suất được kiểm soát, được cho đi vào thiết bị chưng cất có chứa bình chứa nguyên liệu và bình ngưng. Sau khi đi qua mẫu bột nghệ, hơi được ngưng lại bằng nước lạnh ở nhiệt độ phòng, được gom lại trong phễu tách cùng với tinh dầu đã được hơi nước mang theo ra. Hỗn hợp được để lắng trong một ngày; sau đó, tinh dầu được cho vào bình thót cổ nút chặt bằng nút cao su có quấn Teflon, bảo quản trong tủ lạnh. Sau khi trích xong tinh dầu, van phía dưới thiết bị chưng được mở ra để thu chất màu (curcuminoid) và các chất rắn lơ lủng khác bằng nước nóng (ống dẫn). Nước nóng sau đó được gom lại và để bảo quản lạnh trong một tuần, c