Đề tài Tổng quan về Enzyme Protease

Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 1 Mở đầu Ngày nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme đượac sản xuất càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm,nông nghiệp,chăn nuôi,y tế…Hàng năm luợng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với trên 500 triệu USD,được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau. Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử,xúc tác cho phản ứng phân hủy.Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Protease la enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất như: chế biến thưc phẩm ( đông tụ sữa làm cho phomát,lsmf mềm thịt,bổ sung để tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia.xử lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…(sản xuất chất tẩy rửa,thuộc da,y tế,nông nghiệp…) Qua nhiều năm ,việc gia tăng sử dụng vi sinh vật như là một nguồn cung cấp protease đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất và sản phẩm được tạo ra nhiều hơn.Tuy nhiên giá thành chế phẩm protease còn khá cao,do đó cũng hạn chế việc sử dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất.Các chế phẩm thu được sau quá trình nuôi cấy sản xuất enzyme chưa phải là chế phẩm có độ tinh khiết cao vì protein chỉ chiếm 20-30%. Vì vậy, việc nghiên cứu cải tiến phương pháp tách và tinh chế enzyme nhằm thu đượ chế phẩm có độ tinh khiết cao rất cần thiết. Để tách và tinh chế enzyme nói chung và protease nói riêng thì có một số phương pháp hóa – lý khác nhau. Có thể chia làm ba nhóm chính sau: - Phương pháp kết tủa - Phương pháp sắc ký - Phương pháp phân tách hệ hai pha nước Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 2 Protease phân bố ở thực vật, động vật, vi sinh vật. Tuy nhiên, nguồn enzyme phong phú nhất là nguồn từ vi sinh vật, có hầu hết ở các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn,… Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 3 Phần I – Tổng quan về enzyme protease 1.Giới thiệu chung Nhóm enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptid ( -CO-NH)n trong phân tử protein, polypeptid đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển acid amin. H2N–CH–CO–NH–CH–CO -….- NH–CH-COOH +H2O R1 R 2 RX H2N-CH-COOH + H2N-CH-CO…NH-CH-COOH R1 R2 RX Mô hình enzyme protease Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 4 Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật ( vi khuẩn, nấm, virus) đến thực vật ( đu đủ, dứa,..) và động vật (gan, dạ dày bê,..). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. Cấu trúc không gian enzyme protease Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 5 1.1 Phân loại Protease Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4). Peptidase (protease) (E.C.3.4) Sơ đồ phân loại protease Protease được phân chia thành 2 loại : endopeptidase và exopeptidase. • Dựa vào vị trí tác động trên mạch polipeptide, exopeptidase được phân chia thành 2 loại : + Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin,một dipeptide hoặc tri peptide. + Carboxypeptide: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide. * Dựa vào động học của cơ chế xúc tác ,endopeptidase được chia thành 4 nhóm: Metallo proteinase Exopeptdase (E.C.3.4.11-17) Serine proteinase Cystein proteinase Aspartic proteinase Carboxypeptidase Aminopeptidase Endopeptidase (E.C.3.4.21-99) Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 6 + Serin proteinase: là những protein chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotrypsin và subtilisin.Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin.trypsin,elastase.Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. + Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài protein động vật và protein kí sinh trùng.Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. + Aspatic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính. + Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA. Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành 3 nhóm: - Protease acid: pH 2-4 - Protease trung tính: pH 7-8 - Protease kiềm: pH 9-11 1.2 Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật Các công trình nghiên cứu protease vi sinh vật ngày càng nhiều. Các kết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một loài vi sinh vật cũng có thể khác nhau vê nhiều tính chất. Căn cứ vào cơ chất phản ứng, pH hoạt động Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 7 thích hợp,…các nhà khoa học đã phân loại các protease vi sinh vật thành 4 nhóm sau: P-xerin, P-thiol, P-kim loại, P-acid Một số tác giả khác chia protease ra 3 nhóm, dựa vào hoạt động pH của chúng bao gồm: protease acid, protease trung tính, protease kiềm. Trong 4 protease kể trên, các protease – xerin và protease – thiol có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid của acid amin. Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không có hoạt tính esterase của các dẫn xuất của acid amin. Nhiều protease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứa tương đối kỹ về cấu tạo phân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng. Kết quả nghiên cứu cho thấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đối bé, nhất là các P-xerin. Các P-xerin có trọng lượng phân tư thấp vào khoảng 20.000 – 27.000 dalton. Tuy nhiên, cũng có một số p-xerin có trọng lượng phân tử lớn hơn như các enzyme Pelicillium cyoneo-fulvum (44.000), Asp (52.000),… Trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với P-xerin ( vào khoảng 33.800 – 48.400). Protease thiol và nhiều protease – acid cũng có trọng lượng phân tử vào khoảng 30.000 – 40.000 dalton. 1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động ( TTHĐ) của protease. Trong TTHĐ của protease vi sinh vật (VSV) ngoài gốc aa đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc aa khác. Các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của một số protease VSV cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau: -TTHĐ của protease đủ lớn và bao gồm một số gốc aa và trong một số trường hợp còn có cả các cofactơ kim loại. + Các protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 21 A0 , có thể phân biệt thành 6 phần dưới TTHĐ ( subsite), mỗi phần dưới trung tâm hoạt động tương ứng với mỗi gốc aa trong phân tử cơ chất. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 8 + Đối với các protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của các tinh thể protease acid của Phizopus chinenis và endothia đã cho thấy phân tử các phân tử protease này có 2 hạt, giữa chúng có khe hở vào khoảng 20 A0. Khe hở này là phần xúc tác của các enzyme, các gốc asp-35 và asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy. - Đối với các protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide. Mặc dù TTHĐ của các protease VSV có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptid theo cùng một cơ chế chung như sau: E+S enzyme – S Enzyme-S + P1 enzyme + P2 Trong đó: E: Enzyme, S: cơ chất, Enzyme-S: phức chất enzyme-cơ chất, P1, P2: là sản phẩm đầu tiên và thứ 2 cưa phản ửng. Phần II – Nguồn thu nhận Enzyme protease là protein được sinh vật tổng hợp trong tế bào và là chất tham gia xúc tác cho mọi phản ứng sinh học. Chính vì thế, mọi vi sinh vật đều được xem là nguồn thu nhận để sản xuất enzyme. Nhưng vẫn chủ yếu là 3 nguồn chính: động vật, thực vật, vi sinh vật. 2.1 Nguồn động vật - Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có nhiều enzyme nhất. Dạ dày bê: trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm Protease tên là renin. Enzyme này từ lâu đã được dùng phổ biến trong công nghệ phomat. Renin làm biến đổi cazein thành paracazein có khả năng kết tủa Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 9 trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất. Trong thực tế nhiều chế phẩn renin bị nhiễm pepxin ( trong trường hợp thu chế phẩm renin ở bê quá thì. Khi đó dạ dày bê đã phát triển đầy đủ có khả năng tiết ra pepxin) thì khả năng đông tụ sữa kém đi. Gần đây có nhiều nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài Edothia Parasitica và Mucor Purullus. Ngoài ra, người ta còn nghiên cứu thu nhận enzyme từ ruột cá basa. Dịch trích ly enzyme thu được từ ruột cá basa có tổng hoạt tính cao nhất là 15.78 UI/gCKNT trong điều kiện trích ly : tỷ lệ mẫu/dung môi: 1/1 (w/w), pH 9.5: nhiệt đọ 35 0C: thời gian trich ly 10 phút. 2.2 Nguồn thực vật Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được từ nhựa củ lá, thân, quả đu đủ ( Carica papaya) còn Bromelain thu được từ quả chồi dứa, vỏ dứa ( pineapple pant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của Bia khi làm lạnh ( chilling proofing) do kết tủa protein. Những ứng dụng khác của proease thực vật này là trong công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hóa. Ficin thu được từ nhựa cây cọ ( Ficus carica). Enzyme được sử dụng thủy phân protein tự nhiên. Nguồn protease thu từ thực vật Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 10 Thu nhận từ hạt cốc nảy mầm: Malt là loại hạt hòa thảo nảy mầm trong những điều kiện nhân tạo( nhiệt độ, độ ẩm, thời gian) xác định gọi là qui tắc ủ malt. Quá trình sản xuất malt bao gồm các khâu sau: + Thu nhận, xử lí, làm sạch, phân loaị và bảo quản hạt. + Rửa, sát trùng và ngâm hạt. + Uơm mầm ta sẽ thu được malt tươi. + Sấy malt tươi. + Xử lí và bảo quản malt khô. Hoạt tính protease trong hạt ban đầu không đáng kể nhưng khi nảy mầm đã tăng lên 4-8 lần, tăng nhanh hơn hoạt tính amylase và đạt cực đại vào khoảng ngày nảy mầm thứ 5. Sự thủy phân protein bắt đầu bằng tác dụng của protienaza để tạo thành albumoza, polypeptit, pepton và sau đó dưới tác dụng của peptidaza tạo thành các acidamin. Tuy nhiên sự biến đổi này thường không hoàn toàn vì các điều kiện nảy mầm thường không phải là điều kiện tối thích cho hoạt động của hệ enzyme proteaza của hạt. Tuy nhiên, vì nhiệt độ nảy mầm tương đối thấp và thời gian nảy mầm tương đối dài sẽ có sự thủy phân protein tương đối sâu sắc để tạo thành một lượng đáng kể các polypeptit và các acidamin. Tác động này chỉ diễn ra với nội nhũ, trong khi protein ở lớp ngăn cách nội nhũ với vỏ và cả phần vỏ malt thì không bị biến đổi cả trong cả quá trình chế biến về sau. 2.3 Nguồn vi sinh vật Vi sinh vật là nguồn thu nhận enzyme khổng lồ, enzyme protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn,…gồm các loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số loại nấm men. 2.3.1 Vi khuẩn Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 11 Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59% sản lượng enzyme được sử dụng. Protease của động vật và thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kêt peptide trong phân tử protein. Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số chi Clotridium. Trong đó, B,subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp ác protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động trong khoảng pH hẹp ( pH 5- 8) và có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B.subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clotridium. Bacillus 2.3.2 Nấm Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus, A.terricola, A.saitoi,… Các nấm mốc này có khả năng cả ba loại protease: acid, kiềm và trung Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 12 tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu là các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2.5-3. Một số nấm mốc nhưA.candidatus, P.camerberti, P.roqueforti…cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat. Nấm mốc 2.3.3 Xạ khuẩn Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm ra được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S.fradiae, S.Terimosus,… Xạ khuẩn Các chế phẩm protease từ xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được chiết tách từ S.grieus, enzyme này có tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy phân tới Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 13 90% liên kết peptide của nhiều protein thành amina acid. Ở Liên Xô (cũ) người ta cũng tách được chế phẩm tương tự từ S,grieus có tên là protelin. Từ S.fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân keratin. Ở Mỹ, chế phẩm được sản xuất có tên là M-zim dùng trong sản xuất Da. Protease từ S.fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong nghiệp chê biến thịt. Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có thể sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các liên kết peptide đinh trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm pH, các nhóm carboxyl hoặc nhóm amine được lựa chọn để bảo vệ, khả năng kết tủa sản phẩm, phản ứng trong hệ hai pha lỏng. Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích chính như sau: • Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy và giống vi sinh vật. • Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16 – 100 giờ nên có thể thu hoạch nhiều lần quanh năm. • Có thể điều khiển sinh tông hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi. • Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản xuất. Tuy nhiên, trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố ( gây độc, gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý. Để sản xuất chế phẩm enzyme , người ta có thể phân lập giống vi sinh vật có trong tự nhiên hoặc giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết nào đó. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 14 Phần III – Thu nhận và làm sạch enzyme protease từ vi simh vật và thực vật 3.1 Thu nhận và làm sạch enzyme Protease từ vi sinh vật. Nguồn thu protease vi sinh vật chủ yếu là vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn. Quá trình sản xuất cá chế phẩm enzyme vi sinh vật bao gồm các giai đoạn chủ yếu: Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật Môi trường nuôi cấy vi sinh tổng hợp enzyme Tách và làm sạch chế phẩm enzyme Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 15 Các công đoạn sản xuất chế phẩm enzyme 3.1.1 Tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật cho enzyme có hoạt lực cao. Để chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao, người ta có thể phân lập từ môi trường tự nhiên hoặc có thể dùng các tác nhân gây đột biến tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền để tạo thành các biến chủng có khả năng tổng hợp đặc biệt hữu hiệu một loại enzyme nào đó, cao hơn hẳn chủng gốc ban đầu. 3.1.1.1 Phương pháp gây đột biến. Đây là phương pháp hay được dùng nhất nhằm để: -Tạo những đột biến tổng hợp enzyme có cấu trúc bậc 1 thay đổi do đó có thể giảm độ thay đổi với kiểu kìm hãm theo cơ chế liên hệ ngược. Nếu sự thay đổi cấu trúc bậc 1 xảy ra ở vùng trung tâm hoạt động hoặc ở gần đó thì có thể làm thay đổi rõ rệt hoạt tính của enzyme. Gây đột biến đoạn gene hoạt hoá promotor để làm tăng áp lực của nó đối với ARN-polymerase do đó làm tăng tốc độ sao chép mã… Dùng biện pháp này có thể làm tăng lượng glucoza-6-phosphatdehydrogenaza lên 6 lần. Hiện tượng đột biến thường liên hệ với sự thay đổi một gene, chẳng hạn bị “lỗi” một bazo khi tái tạo phân tử AND. Để tạo một đột biến gene có thể dùng tác nhân vật lý (tia tử ngoại, tia phóng xạ) hay hoá học (các hoá chất) tác dụng lên tế bào sinh vật. 3.1.1.2 Phương pháp biến nạp. Là sự biến đổi tính trạng di truyền của một nòi sinh vật dưới ảnh hưởng của AND trong dịch chiết nhận được từ tế bào của sinh vật khác. Ở đây yếu tố biến nạp là AND. Sự chuyển vật liệu di truyền (AND) từ tế bào cho đến tế bào nhận có thể xảy ra trong ống nghiệm (invitro) khi cho tế bào nhận tiếp xúc với dịch chiết từ tế bào cho mà không có sự tiếp xúc giữa các tế bào. Enzyme protease Trần Anh Đào – 48K – Hoá thực phẩm – DH Vinh 16 Các tế bào có thể nhận bất kỳ loại AND nào chứ không đòi hỏi phải là AND từ các giống họ hàng. Tuy nhiên tế bào chỉ có thể nhận một số đoạn AND nhất định, thường không quá 10 đoạn. Các đoạn AND được di truỳền trong biến nạp có M=106-107 và phải có cấu trúc xoắn kép. Hiện tượng biến nạp phổ biến ở nhiều loại vi khuẩn như: Diplococus, Staphylocus, Hemophilus, Agrobacterium, Rhizobium, Bacillus, Xantomonas. 3.1.1.3 Phương pháp tiếp hợp gene. Khác với biến nạp, ở đây vật liệu di truyền chỉ được từ tế bào cho đến tế bào nhận khi hai tế bào tiếp xúc với nhau. Do vậy các vi sinh vật có khả năng biến nạp thì sẽ không có khả năng tham gia tiếp hợp gene nữa. Hiện nay quá trình tiếp hợp gene đã được nghiên cứu ở một số loài vi khuẩn như E.coli, Salmonella, Pseudomonas aeruginosa. 3.1.1.4. Phương pháp tải nạp Vật liệu di truyền (AND) được chuyển từ tế bào cho sang tế bào nhận nhờ vai trò trung gian của thực khuẩn thể (phage). Trong quá trình tải nạp, các đoạn AND được chuyển từ tế bào cho đến tế bào tiếp hợp với AND củ