Đồ án Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ sargassum mcclurei in vitro và ứng dụng để hạn chế sự oxy hóa lipid trên thịt cá thu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  PHẠM THỊ MỸ HIỀN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT RONG MƠ SARGASSUM MCCLUREI IN VITRO VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ HẠN CHẾ SỰ OXY HÓA LIPID TRÊN THỊT CÁ THU ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN Nha Trang, tháng 06 năm 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  PHẠM THỊ MỸ HIỀN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT RONG MƠ SARGASSUM MCCLUREI IN VITRO VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ HẠN CHẾ SỰ OXY HÓA LIPID TRÊN THỊT CÁ THU ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN TS. NGUYỄN THẾ HÂN Nha Trang, tháng 06 năm 2014 i LỜI CẢM ƠN Trong gần ba tháng nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của khoa Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nha Trang, em đã hoàn thành được đề tài tốt nghiệp của mình. Để đạt được kết quả hôm nay, bên cạnh sự nỗ lực của bản thân là sự giúp đỡ tận tình từ gia đình, thầy cô và bạn bè. Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến ban giám hiệu trường Đại học Nha Trang, ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm, các quý thầy cô trong khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình, tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành đề tài này. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy TS. Nguyễn Thế Hân, người trực tiếp hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình, em đã nhận được sự giúp đỡ, động viên rất lớn từ gia đình. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố, mẹ, anh, chị và những người thân trong gia đình. Cuối cùng, cảm ơn tất cả những người bạn đã giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài. Khánh Hòa, ngày 10 tháng 06 năm 2014 Sinh viên thực hiện Phạm Thị Mỹ Hiền ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................. i MỤC LỤC.................................................................................................................. ii DANH MỤC BẢNG...................................................................................................v DANH MỤC HÌNH ....................................................................................................v LỜI MỞ ĐẦU .............................................................................................................1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN.......................................................................................4 1.1. Giới thiệu về rong mơ Sargassum mcclurei .....................................................4 1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái .................................................................4 1.1.2. Phân bố và đặc điểm sinh thái ....................................................................5 1.1.3. Thành phần hóa học của rong mơ ..............................................................6 1.1.4. Ứng dụng của rong mơ...............................................................................7 1.2. Tổng quan về tình hình nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của rong biển ...7 1.2.1. Nghiên cứu trong nước...............................................................................7 1.2.2. Nghiên cứu ngoài nước ..............................................................................8 1.3. Các phương pháp chiết ...................................................................................11 1.3.1. Cơ sở của quá trình tách chiết ..................................................................11 1.3.2. Các phương pháp tách chiết bằng dung môi ............................................11 1.3.2.1. Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt (Percolation) .............................11 1.3.2.2. Chiết bằng phương pháp ngâm dầm (Maceration) ............................11 1.3.2.3. Tách chiết bằng phương pháp chiết hồi lưu.......................................12 1.3.2.4. Chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước.......................................12 1.3.3. Một số phương pháp tách chiết khác........................................................12 1.3.3.1. Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction) .....12 1.3.3.2. Phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm..........................................12 1.3.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết...........................................13 1.3.4.1. Dung môi chiết...................................................................................13 1.3.4.2. Nhiệt độ chiết .....................................................................................13 1.3.4.3. Thời gian chiết xuất ...........................................................................14 1.4. Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa......................................14 iii 1.4.1. Phương pháp TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity)................14 1.4.2. Phương pháp khử gốc tự do DPPH (Scavenging ability towards DPPH radicals) ..............................................................................................................15 1.4.3. Phương pháp ORAC (oxygen radical absorbance capacity)....................15 1.4.4. Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential) ..........16 1.4.5. Phương pháp FRAP (ferric reducing-antioxidant power)........................17 1.4.6. Lipid assay................................................................................................17 1.4.7. Phương pháp FTC (ferric thiocyanat ) .....................................................18 1.4.8. Tổng năng lực khử (reducing power).......................................................18 1.5. Giới thiệu về cá thu Scomberomorus commerson..........................................18 1.5.1. Đặc điểm sinh học và phân bố .................................................................19 1.5.2. Thành phần hóa học và dinh dưỡng .........................................................20 1.5.3. Hư hỏng thường gặp của thịt cá thu trong quá trình bảo quản lạnh.........20 1.6. Quá trình oxy hóa lipid và lipid trên cá thu....................................................21 1.6.1. Khái quát chung về lipid ở cá thu.............................................................21 1.6.2. Cơ chế của quá trình oxy hóa lipid...........................................................21 1.6.3. Tác hại của quá trình oxy hóa lipid ..........................................................23 1.6.4. Các chất chống oxy hóa............................................................................24 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................29 2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất............................................................................29 2.1.1. Nguyên liệu rong mơ S. mcclurei ............................................................29 2.1.2. Nguyên liệu cá thu S. commerson............................................................29 2.1.3. Hóa chất và thuốc thử...............................................................................29 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................30 2.2.1. Quy trình bố trí thí nghiệm tổng quát .....................................................30 2.2.2. Thí nghiệm xác định độ ẩm của rong mơ khô ........................................32 2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ ..........33 2.2.3.1. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết...........33 2.2.3.2. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ chiết ............................... 34 2.2.3.3. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết..........................35 iv 2.2.3.4. Thí nghiệm ảnh hưởng của số lần chiết .............................................36 2.2.3.5. Thí nghiệm ảnh hưởng của sóng siêu âm .........................................38 2.2.4. Thí nghiệm sử dụng dịch chiết rong mơ S. mcclurei để hạn chế sự oxy hóa lipid trên thịt cá thu trong quá trình bảo quản lạnh .....................................39 2.3. Phương pháp phân tích ...................................................................................41 2.3.1. Xác định hàm ẩm......................................................................................41 2.3.2. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số .................................................41 2.3.3. Xác định khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) ....41 2.3.4. Xác định tổng năng lực khử .....................................................................42 2.3.5. Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ S. mcclurei trên thịt cá thu bảo quản lạnh .............................................................................42 2.4. Phương pháp xử lý số liệu ..............................................................................43 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN..................................44 3.1. Ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ .........................................................44 3.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết ..................................................44 3.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết ..................................................................47 3.1.3. Ảnh hưởng của thời gian chiết .................................................................51 3.1.4. Ảnh hưởng của số lần chiết ......................................................................54 3.1.5. Ảnh hưởng của sóng siêu âm ..................................................................56 3.1.6. Mối tương quan giữa hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa (tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH) .......................59 3.2. Khả năng hạn chế sự oxy hóa lipid trên cơ thịt cá thu trong quá trình bảo quản lạnh của dịch chiết rong mơ S. mcclurei.......................................................61 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................63 4.1. Kết luận...........................................................................................................63 4.2. Kiến nghị.........................................................................................................63 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................65 PHỤ LỤC v DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Thành phần hóa học cơ bản của cá thu 4................................................20 vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Rong mơ Sargassum mcclurei ....................................................................4 Hình 1.2. Phản ứng giữa gốc tự do DPPH và một chất chống oxy hóa....................15 Hình 1.3. Đồ thị mô tả độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian ...........................16 Hình 1.4. Cá thu Scomberomorus commerson ........................................................19 Hình 1.5. Quá trình tự oxy hóa của lipid không no ..................................................23 Hình 1.6. Vô hoạt hóa gốc tự do bởi flavonoid (Nicole, 2001; Marfak, 2003) 10 26 Hình 1.7. Cơ chế tạo phức giữa các flavonoid và các ion kim loại (Men+) (Nicole, 2001; Marfak, 2003) 10....................................................................27 Hình 1.8. Các vùng cấu trúc đảm bảo khả năng chống oxy hóa của polyphenol (Amic và cộng sự, 2003) 10 .............................................................27 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát .............................................................30 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định độ ẩm của rong mơ khô........................32 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ .......................................................................................................33 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ .......................................................................................................34 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ .......................................................................................................35 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ .......................................................................................................36 Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ .......................................................................................................38 vii Hình 2.8. Bố trí thí nghiệm ứng dụng dịch chiết rong mơ để hạn chế sự oxy hóa lipid thịt cá thu trong quá trình bảo quản lạnh ở t=4C ......................40 Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến hàm lượng polyphenol tổng số (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) ...............................................................................45 Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến tổng năng lực khử (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) ....................................................................................................46 Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến khả năng khử gốc tự do DPPH (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05).....................................................................................................47 Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) ....................................................................................................49 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tổng năng lực khử.......................................50 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) ....................................................................................................51 Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) ....................................................................................................52 Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến tổng năng lực khử (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05)............53 Hình 3.9. Ảnh hưởng của thời gian chiêt đến khả năng khử gốc tự do DPPH (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) ....................................................................................................54 Hình 3.10. Ảnh hưởng của số lần chiêt đến hàm lượng polyphenol tổng số (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) .............................................................................................................55 viii Hình 3.11. Ảnh hưởng của số lần chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05)............56 Hình 3.12. Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) ....................................................................................................57 Hình 3.13. Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến tổng năng lực khử.............................58 Hình 3.14. Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến khả năng khử gốc tự do DPPH.........59 Hinh 3.15. Mối tương quan giữa hàm lượng polyphenol tổng số và tổng năng lực khử ......................................................................................................60 Hinh 3.16. Mối tương quan giữa hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng khử gốc tự do DPPH ..................................................................................61 Hình 3.17. Sự thay đổi chỉ số TBARS của thịt cá thu trong quá trình bảo quản lạnh (t=4C) (Chữ cái trên điểm khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa ....62 1 LỜI MỞ ĐẦU Rong biển hay tảo biển có tên khoa học là marine-algae, marine plant hay seaweed. Rong biển phân bố hầu hết ở các vùng nước mặn, nước lợ, cửa sông, vùng nước sâu và vùng biển cạn. Hàng năm, các Đại dương cung cấp cho trái đất trên 200 tỷ tấn rong. Trong tự nhiên, rong biển có vai trò quan trọng đối với sự sống của các sinh vật biển khác. Rong biển cũng được xem như nguồn thực phẩm tương lai của con người. Với tiềm năng đó, rong biển ngày càng được con người khai thác, nuôi trồng và sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Ở Việt Nam trong gần 1000 loài rong biển được tìm thấy, trong số đó ngành rong nâu (Phacophyta) chiếm 143 loài. Cơ sở dữ liệu Species 2000 phiên bản 2006 liệt kê chi rong mơ Sargassum thuộc ngành rong nâu Phacophyta, có tới 691 loài 54. Hiện nay, theo thống kê ở Việt Nam có khoảng 78 loài, nhiều loài có giá trị kinh tế cao như S. oligocystum, S. polycystum (rong mơ nhiều phao), và S. mcclurei. Các loài rong mơ được phân bố chủ yếu ở vùng biển miền Trung bộ trong đó có Khánh Hòa, sản lượng khoảng 4.000 tấn rong khô mỗi năm 13. Tuy nhiên, việc nuôi rong biển vẫn chưa được chú trọng và chưa tương xứng với tiềm năng thế mạnh của Việt Nam. Hiện nay, rong mơ là một trong những đối tượng nghiên cứu được quan tâm nhiều. Nhiều nghiên cứu cho thấy trong thành phần rong nâu chứa các chất có hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, chống đông tụ và chống bức xạ UV-B, làm lành vết thương và tái tạo cấu trúc tế bào 2. Vì vậy, rong nâu là nguồn nguyên liệu tiềm năng sử dụng trong các lĩnh vực y dược và thực phẩm. Một số nghiên cứu ở Việt Nam mới bước đầu tập trung vào các hoạt tính kháng nấm, kháng u, kháng khuẩn của một số hợp chất như carbohydrate và phenolic từ rong nâu (Nguyễn Duy Nhứt, (2008); Bùi Minh Lý, (2009); Trần Thị Thanh vân, (2009)) 2. Trong khi đó, nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa của rong mơ và ứng dụng dịch chiết từ rong mơ để hạn chế sự oxy hóa lipid thịt cá vẫn 2 chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ. Ngoài ra, nghiên cứu ở Việt Nam chưa nghiên cứu điều kiện chiết thích hợp cho hoạt tính chống oxy hóa cao mà chỉ dừng lại chiết trong một điều kiện. Do đó, đề tài này sẽ nghiên cứu các điều kiện chiết thích hợp để thu được hoạt tính chống oxy hóa cao. Hiện nay, thủy sản là mặt hàng chiếm tỷ trọng lớn trong cơ cấu xuất khẩu của Việt Nam trong đó cá là mặt hàng chủ lực xếp thứ hai sau tôm. Trong thịt cá, lipid chiếm tỷ lệ cao và là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho con người. Cá là nguyên liệu thực phẩm dễ bị hư hỏng. Nguyên nhân chủ yếu dẫn đến sự giảm chất lượng của cá sau thu hoạch là do quá trình oxy hóa lipid gây nên. Oxy hóa lipid làm giảm giá trị cảm quan và dinh dưỡng đối với sản phẩm thủy sản. Để khắc phục được vấn đề trên, trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm, con người đã sử dụng rộng rãi các chất chống oxy hóa tổng hợp như Butylated hydroxytoluene (BHT), Butylated hydroxynisole (BHA), tocophe