Đồ án Nguyên lý kỹ thuật gen

CHƯƠNG VII PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ CÁC KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ I. PCR (Polymerase Chain Reaction) Do Kary Mullis công bố vào tháng 10 năm 1985. Một bước nhảy vọt trong SHPT Cho phép khuếch đại và tạo một lượng lớn bản sao Nguyên lý biến tính, hồi tính và tổng hợp DNA 1. Nguyên lý chung của phương pháp PCR Giai đoạn biến tính (denaturation) ở 94-950C Làm đứt mạch liên kết hydrogen, hai sợi DNA tách rời Kéo dài 1-2 phút Giai đoạn gắn mồi (annealing): từ 55 – 650C Mồi bắt cặp mạch đơn DNA khuôn ở đầu 3’ Thời gian: 30 - 60 giây Giai đoạn tổng hợp (elongation): 70 – 720C. Thích hợp cho hoạt động của DNA polymerase DNA polymerase xúc tác gắn nucleotid vào cuối đoạn mồi Thời gian từ 30s đến vài chục phút. Thời gian 2 phút tổng hợp đoạn DNA có kích thước 2 kb Mỗi phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ, sản phẩm tạo ra làm khuôn cho phản ứng tiếp theo Bao gồm 20 – 40 chu kỳ, như vậy mỗi đoạn khuôn DNA có thể tạo ra 220 – 240 bản sao DNA How does PCR work? One PCR Cycle: How does PCR work? One PCR cycle: What the products really looks like… Biology Animation Library: 4 DNA strands Template Strand Template Strand How does PCR work? Two cycles: What the products really looks like… 8 DNA strands How does PCR work? Three cycles… Notice the production of double stranded, shortened PCR products (target sequence) that spans the two primers. Our target sequences will contain the LUX AB genes. 16 DNA strands How does PCR work? Four cycles… The number of DNA strands doubles after each cycle. Target sequence predominates. 32 DNA strands How does PCR work? Target sequence increases exponentially. After 30 cycles… 2. Các yếu tố cần thiết trong phản ứng PCR 2.1 DNA khuôn (DNA template) Sạch G The Maxam-Gilbert Technique Principle – Chemical Degradation of Pyrimidines Pyrimidines (C, T) are damaged by hydrazine Piperidine cleaves the backbone 2 M NaCl inhibits the reaction with T Chemical degradation method(4/5) Chemical degradation method(5/5) 2. Giải trình tự gen DNA the phương pháp dideoxi 2.1 Nguyên lý Sanger, Smith và Coulson công bố vào năm 1977, dựa theo cơ chế tổng hợp DNA. Đã giải trình tự hoàn chỉnh bộ gen thực khuẩn thể X 174 Trong quá trình tổng hợp mạch đơn DNA bỏ sung một hàm lương nhỏ dideoxinucleotid (ddNTP). Do ddNTP mất cả 2 nhóm OH (carbon số 2 và 3) ngẫu nhiên làm cho phản ứng tổng hợp DNA ngừng lại NUCLEIC ACIDS Dideoxynucleotides used in DNA sequencing NUCLEIC ACIDS Train termination in the presence of dideoxynucleotides NUCLEIC ACIDS Mechanism: NUCLEIC ACIDS Bản gel điện di phóng xạ tự ghi để xác định trình tự 3. Giải trình tự bằng máy tự động (Sequencer) Theo nguyên tắc sử dụng ddNTP do Sanger và CS phát minh Trong quá trình tổng hợp DNA sử dụng mồi và dNTP đánh dấu huỳnh quang, mỗi loại dNTP có màu khác nhau Mày tổng hợp mạch đơn trên cả 2 mạch khuôn, dùng phần mềm để xử lý kết quả DNA Sequencing Sequencing systems PCR   DNA sequencing   Microarrays Mass-spec LICOR DNA 4300 ABI 3100 DNA Sequencing Snapshots of the detection of the fragments on the sequencer four-dye system single-dye system PCR   DNA sequencing   Microarrays Mass-spec DNA Sequencing Chromatogram file PCR   DNA sequencing   Microarrays Mass-spec IV. Các phương pháp lai phân tử Kỹ thuật lai Southern blotting (DNA-DNA) Kỹ thuật lai Northern blotting (DNA-RNA) Kỹ thuật lai Western blotting (Protein-Kháng thể đặc hiệu) Kỹ thuật lai tại chỗ (in situ hybridization) V. Một số kỹ thuật phân tử sử dụng trong xác định đa dạng di truyền và ứng dụng trong phân loại phân tử Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA): Sử dụng một số cặp mồi nhất định (10-40 cặp) nhằm nhân các đoạn DNA đặc trưng. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism DNA) dựa trên đặc điểm các enzym giới hạn khác nhau, tạo nên các đoạn DNA khác nhau, phân biệt bằng điện di đồ Kỹ thuật AFLP (Amplified Length Polymorphism) cũng sử dụng cặp mồi đặc hiệu nhằm khuyếch đại đoạn DNA đặc trưng. Thực hiện PCR lần thứ hai nối thêm 1 hoặc 2 Nu ở đầu 3’ (hoặc 5’) của mồi để nhân đoạn DNA có đặc hiệu cao. Kỹ thuật VNTR (Variable Tandem Repeats) - kiểm tra các đoạn lập lại ngắn trong bộ gen Kỹ thuật DNA Microarray Lai các đoạn cDNA mạch đơn được đánh dấu huỳnh quang với tập hợp (mảng – array) đã biết trình tự, gắn trên GeneChip, để kiểm tra và phát hiện một trình tự nucleoitd nào đó Production of Affymetrix Arrays Borrowed without permission from www.affymetrix.com/technology/ge_analysis/index.affx Borrowed without permission from www.affymetrix.com/technology/ge_analysis/index.affx Affymetrix Target Labeling and Hybridization VI. Các phương pháp chuyển gen  Chuyển gen trực tiếp + Kỹ thuật xung điện (electroporation) + Kỹ thuật vi tiêm (microinjection) + Kỹ thuật bắn gen (Biolistic or gene gun) + Kỹ thuật chuyện gen qua ống phấn Chuyển gen gián tiếp (vector sinh học) + Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens + Virus